原花青素對營養肥胖模型大鼠腸道消化酶活性的影響

李雅梅,方　爍,肖俊松,曹雁平

(北京工商大學,北京市食品添加劑工程技術研究中心，食品質量與安全北京實驗室,北京 100048)

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原花青素對營養肥胖模型大鼠腸道消化酶活性的影響

李雅梅,方爍,肖俊松*,曹雁平

(北京工商大學,北京市食品添加劑工程技術研究中心，食品質量與安全北京實驗室,北京 100048)

以高脂飼料喂養Wistar大鼠建立營養肥胖模型,然后以200 mg/(kg·bw·d)葡萄籽原花青素提取物灌胃6周,研究其對大鼠體重,以及蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等腸道內酶活性的影響。造模結束時,模型組、灌胃組體重及Lee’s指數無顯著區別,且顯著高于正常組(p<0.05);灌胃6周葡萄籽原花青素后,灌胃組體重及Lee’s指數顯著低于模型組(p<0.05)。灌胃組大鼠腸道蛋白酶、脂肪酶活性顯著(p<0.05)高于模型組和正常組;灌胃組淀粉酶活性顯著(p<0.05)高于正常組,與模型組無顯著區別(p>0.05);灌胃組α-葡萄糖苷酶活性與模型組和正常組無顯著區別;灌胃組β-葡萄糖苷酶活性顯著(p<0.05)低于模型組和正常組。實驗結果顯示200 mg/(kg·bw·d)濃度的提取物可顯著抑制大鼠肥胖,且提高了腸道消化酶的活性,有利于營養物質的吸收利用,同時降低了二糖酶中β-葡萄糖苷酶的活性,有利于降低血糖。

葡萄籽原花青素,肥胖,腸道酶活,大鼠

肥胖是一種由多種因素引起的慢性代謝性疾病,是長期能量攝入大于消耗所引起的以脂質代謝異常為主的代謝失調癥。肥胖已成為當今社會嚴重危害公眾健康的問題,與炎癥、糖尿病、高血壓、心腦血管疾病及胰島素抵抗的發生密切相關[1]。已有流行病學和臨床研究表明,肥胖是心腦血管疾病和糖尿病的獨立危險因素,對血壓、血糖、血脂水平均有影響[1]。

原花青素(Proanthocyanidin)是廣泛存在于植物中的一類天然多酚,由多個黃烷-3-醇單元通過C4-C6或C4-C8鍵連接而成,3位羥基可與沒食子酸兒茶素發生酯化[2]。原花色素根據結構不同,構成單元組成不同,分別稱為原花青素(Procyanidin)、原雀翠素(prodelphinidin)、原菲瑟素(profisetinidin)、原刺槐素(prorobinetinidin)等。原花青素有良好的抗氧化、清除自由基、減肥、消炎和降低胰島素抵抗的生理活性[3]。流行病學調查顯示,膳食中原花青素等多酚類物質的攝入,能顯著降低肥胖、糖尿病等代謝疾病發病幾率[4]。原花青素在葡萄、高粱、可可、蘋果等食物中大量存在,其中葡萄籽是商業原花青素的重要來源。

人體自身對原花青素的利用度并不高。原花青素進入腸道后僅少量被腸道吸收進入血液,大部分通過腸道菌群代謝以及糞便排出體外[5]。Serra等[6]用葡萄籽原花青素灌胃大鼠,發現在血漿中的原花青素及其衍生物含量分別只有0.85～8.55 μmol/L和0.06～23.90 μmol/L,原花青素二聚體B2的生物利用率僅在8%～11%之間,大部分通過腸道菌群代謝。

目前,關于葡萄籽提取物原花青素預防和治療肥胖的報道還很少,本文以高脂膳食誘導營養肥胖模型,然后以葡萄籽原花青素灌胃,從腸道消化酶的角度,探索葡萄籽原花青素對大鼠腸道代謝情況的影響,為進一步研究其預防和治療肥胖等代謝綜合征提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄籽原花青素提取物(原花青素含量≥95%)天津尖峰天然產物公司;Wistar雄性大鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司;脂肪酶試劑盒、淀粉酶試劑盒、考馬斯亮藍試劑盒、福林酚試劑均購自南京建成生物工程研究所;對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷購自美國阿法埃莎;其他試劑均為國產分析純。

Multiskan MK3型全自動多功能酶標儀美國Thermo公司;UV-2000型紫外可見分光光度計日本島津公司;CR21-GIII型高速冷凍離心機日本Hitachi公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組及處理出生3周Wistar雄性大鼠45只。首重(90±10)g,SPF級動物房飼養,溫度25 ℃左右,濕度60%,光照10～12 h/d。適應飼喂2 d后開始造模。

造模方法[7]:隨機抽取7只大鼠,飼喂標準大鼠日糧,剩余大鼠飼喂高脂飼料。每周定期測量大鼠體重體長。8周后,稱量大鼠體重,以體重超過正常組大鼠平均體重20%的為造模成功。

灌胃階段,正常組繼續給予標準大鼠日糧,灌胃無菌水;造模成功的大鼠隨機分成灌胃組和模型組,每組7只,繼續飼喂高脂飼料,并分別灌胃原花青素200 mg/(kg·bw·d)和無菌水。灌胃階段每周測量大鼠體重體長。

灌胃6周以后,禁食12 h,肌肉注射2%的戊巴比妥0.6 mL麻醉后,股動脈取血致死,取回腸內容物,-80 ℃保存待測。

1.2.2生長性能測定根據下式計算李氏指數即Lee’s指數[8]:

式中,體重單位為g;體長:大鼠鼻尖到肛門的長度,cm。

Lee’s指數是評價成年肥胖模型大鼠肥胖程度的指標,肥胖大鼠較正常大鼠Lee’s指數明顯增加[7]。

1.2.3粗酶液的制備取0.15 g大鼠腸道內容物,加入1 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4),充分振蕩混勻 3000 r/min低溫離心30 min,上清液即為粗酶提取液,-80 ℃保存待測。采用考馬斯亮藍試劑盒測定粗酶液中蛋白含量。

1.2.4蛋白酶酶活的測定[9-10]

1.2.4.1制備酪氨酸標準曲線取濃度為10、20、30、40、50、60 μg/mL酪氨酸-磷酸鹽溶液各2 mL,加入0.55 mol/L碳酸鈉5 mL使呈堿性,然后加入1 mL福林酚,37 ℃水浴顯色15 min,680 nm下測吸光度值。取2 mL純水加入如上試劑反應后作為空白對照。根據吸光度和對應酪氨酸濃度繪制標準曲線,方程為y=0.0186x+0.02(R2=0.9997)。

1.2.4.2底物與酶的反應取0.3 mL粗酶液用磷酸鹽緩沖液(pH7.4)稀釋至3 mL于37 ℃水浴預熱3～5 min,加入于37 ℃水浴預熱5 min的0.5%酪素2 mL,混合均勻后于37 ℃水浴中準確反應15 min。反應后加入3 mL 10%三氯乙酸終止反應,10000 r/min離心15 min,取上清液2 mL,加入5 mL 0.55 mol/L碳酸鈉堿化,然后加入福林試劑1 mL,混勻后37 ℃水浴顯色15 min,680 nm下測吸光度值。

1.2.4.3蛋白酶比活力定義在37 ℃下每毫克蛋白每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸即為一個酶活力單位。

式中:C為樣品測得光密度查曲線對應的酪氨酸量,μg;F為粗酶液稀釋倍數;15為反應時間,min;W為粗酶液蛋白含量,mg;k為標準曲線斜率倒數,1/0.0186;OD為吸光度值。

1.2.5淀粉酶、脂肪酶酶活的測定用淀粉酶試劑盒(碘法)測定各組樣品粗酶液中淀粉酶活力[11-12],用脂肪酶試劑盒測定各組樣品粗酶液中脂肪酶活力[13-14],方法參照試劑盒說明書。

1.2.6α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶酶活的測定pNPG法測α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶酶活[15-19]。

1.2.6.1繪制PNP標準曲線分別取1 mmol/L對硝基苯酚溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL,各加入2 mL 1 mol/L碳酸鈉,補充緩沖液使其終濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L。于400 nm處測定吸光度值,繪制對硝基苯酚—光密度曲線,得到曲線方程y=17.374x+0.009(R2=0.9981)。

1.2.6.2底物與酶的反應取粗酶液0.3 mL用的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖(pH6.0)稀釋至1.2 mL后于37 ℃水浴預熱5 min,加入底物1.6 mmol/L的pNPG溶液(37 ℃預熱10 min)0.3 mL,混勻后37 ℃水浴準確反應30 min,然后用3.5 mL 0.5 mol/mL碳酸鈉溶液終止反應,于400 nm處測定吸光度值。

1.2.6.3酶比活力定義在上述條件下,每毫克蛋白每分鐘內催化生成1 μmol對硝基苯酚為一個酶活力單位。

式中:C為對應對硝基苯酚濃度-光密度曲線上的值,μg;30,反應時間,min;F,原酶液稀釋倍數;W,粗酶液蛋白含量,mg;k為標準曲線斜率倒數,1/17.374;OD為吸光度值。

1.2.7數據處理與統計分析各組大鼠每個樣品做三次平行,采用Origin 8.5繪圖。數據采用SPSS statistics 17.0軟件進行分析,利用單因素方差分析進行顯著性檢驗,并采用鄧肯(Duncan)新復極差法對正常組、模型組、灌胃組各指標進行兩兩比較。

2　結果與分析

2.1原花青素對肥胖模型大鼠體重及肥胖程度的影響

圖1代表灌胃期間大鼠體重的變化,由圖1可以發現在灌胃初期模型組、灌胃組與正常組體重差距明顯(p<0.05),灌胃第1周體重平均水平分別為(592.38±9.42)、(578.56±16.14)、(486.71±5.06)g,隨著灌胃時間的延長,模型組體重與正常組體重依然差距明顯(p<0.05),而灌胃組大鼠體重逐漸遠離模型組并靠近正常組,灌胃第6周灌胃組、模型組、正常組體重平均水平分別為(610±24.46)、(685±12.51)、(564.5±8.19)g,說明原花青素可抑制高脂飼喂大鼠體重的增加,且效果與灌胃時間有關。

圖1　灌胃期間各組大鼠體重變化Fig.1　Weight changes of three groups during gavage

圖2代表灌胃期間大鼠Lee’s指數的變化,揭示了大鼠肥胖程度的變化情況。由圖2可以發現在灌胃初始階段灌胃組與模型組Lee’s指數無明顯差異且顯著高于正常組,平均水平分別為348.48±5.24、350.33±3.8、328.01±3.76,灌胃過程中灌胃組與正常組的Lee’s指數數值、變化趨勢一直保持一致,且逐漸接近,灌胃第6周灌胃組Lee’s指數接近正常水平并顯著低于模型組,說明原花青素對于肥胖大鼠具有一定的減重效果,且效果與灌胃時間有關。

圖2　灌胃期間各組大鼠Lee指數變化Fig.2　Lee’s index changes of three groups during gavage

2.2原花青素對腸道蛋白酶活力的影響

圖3代表各組大鼠腸道內容物測得蛋白酶活力的差異,由圖3結果可看出,灌胃組大鼠腸道蛋白酶活力較正常組與模型組均有極顯著性提高(p<0.01),而模型組較正常組大鼠腸道蛋白酶活力降低但并無顯著區別(p>0.05)。說明肥胖對腸道蛋白酶活性有一定的抑制作用,而原花青素可改善這種抑制,并且對腸道蛋白酶有顯著地激活作用。

圖3　大鼠腸道蛋白酶活力Fig.3　Activity of proteinase from rat intestinal 注:大寫字母不同表示有極顯著差異(p<0.01);小寫字母不同表示有顯著差異(p<0.05);圖4～圖7同。

2.3原花青素對腸道淀粉酶活力的影響

圖4代表各組腸道內容物測得淀粉酶活力的差異,由圖4結果可以看出,灌胃組大鼠腸道淀粉酶活力較正常組有顯著性提高(p<0.05),而較模型組大鼠腸道淀粉酶活力雖有提高,但并不顯著(p>0.05);模型組與正常組淀粉酶活性也無顯著差異(p>0.05)。說明肥胖對腸道淀粉酶的代謝活動影響不大,而原花青素可顯著提高腸道淀粉酶的活性。

圖4　大鼠腸道淀粉酶活力Fig.4　Activity of amylase from rat intestinal

2.4原花青素對腸道脂肪酶活力的影響

圖5各組腸道內容物測得脂肪酶活力的差異,由圖5結果可看出,灌胃組大鼠腸道脂肪酶活力較正常組有顯著性提高(p<0.05),較模型組有極顯著性增高(p<0.01),而模型組較正常組大鼠腸道脂肪酶活力雖有一定抑制,但并不顯著(p>0.05)。說明肥胖對腸道脂肪酶的活性影響不大,而原花青素可顯著提高腸道脂肪酶的活性。

圖5　各組脂肪酶活力Fig.5　Lipase activities of three groups

2.5原花青素對腸道α-葡萄糖苷酶活力的影響

圖6代表各組腸道內容物測得α-葡萄糖苷酶活力的情況,由圖6結果可看出,各組大鼠腸道α-葡萄糖苷酶活力并無顯著性差異(p>0.05)。肥胖與原花青素對腸道α-葡萄糖苷酶均無明顯作用。

圖6　各組α-葡萄糖苷酶活力Fig.6　Alpha-glucosidase activities of three groups

2.6原花青素對腸道β-葡萄糖苷酶活力的影響

圖7代表各組腸道內容物測得β-葡萄糖苷酶活力的差異,由圖7結果可看出,灌胃組大鼠腸道β-葡萄糖苷酶活力較正常組與模型組均極顯著性降低(p<0.01),模型組酶活力水平極顯著高于正常組(p<0.01)。說明肥胖使腸道β-葡萄糖苷酶活性顯著增高,而原花青素可顯著抑制腸道β-葡萄糖苷酶活性,使其達到正常水平。

圖7　不同組β-葡萄糖苷酶活力Fig.7　Beta-glucosidase activities of three groups

3　討論與結論

葡萄籽原花青素對高脂膳食誘導的肥胖大鼠有較好的減重效果,肥胖程度在灌胃6周后基本達到正常水平。用原花青素灌胃后肥胖大鼠腸道消化酶類諸如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶較正常大鼠有一定程度的提高,但淀粉酶和脂肪酶的這種變化并不顯著;而經過原花青素灌胃處理6周后,抑制作用得到了明顯改善,且較正常水平均有一定的提高。說明原花青素可提高肥胖大鼠腸道消化酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活力,從而提高其消化能力,這一結論與文獻報道中基本相符[11-12]。而通過對二糖酶α-葡萄糖苷酶及β-葡萄糖苷酶酶活力的檢測結果分析可知,肥胖模型組大鼠兩種酶活力綜合水平顯著高于正常組大鼠,從而印證了肥胖癥往往伴隨高血糖癥狀。而原花青素灌胃處理過后的大鼠β-葡萄糖苷酶活力顯著降低,說明原花青素可抑制肥胖大鼠腸道β-葡萄糖苷酶的活力,從而改善其高血糖癥狀。

從腸道酶活角度研究原花青素對肥胖的影響是一種創新的手段,是對先前其他研究方面的補充,也為原花青素作為功能性成分在食品、飼料等的生產使用提供進一步的科學依據。但利用大鼠腸道內容物進行腸道內酶活力的測定,由于酶量較少、易失活,且大鼠個體差異較大,得到的實驗結果有待進一步驗證。因此,可在此基礎上考慮對腸道酶進行分離純化,進一步進行分子水平的研究。

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權威·核心·領先·實用·全面

Effect of proancyanidins on intestinal enzyme activityin nutritional obese rats

LI Ya-mei,FANG Shuo,XIAO Jun-song*,CAO Yan-ping

(Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Laboratoryfor Food Quality and Safety,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

Nutritional obese model was induced by feeding Wistar rats with high-fat diet. And then the model rats were treated with 200 mg/(kg·bw·d)of grape seed procyanidins by gavage for 6 weeks. Detected effect of procyanidin on obesity and activities of intestinal protease,amylase,lipase,alpha-glucosidase,beta-glucosidase. There was no significantly(p<0.05)difference in weight and Lee’s index between model group and ig group,while both the two groups were significantly different with normal group in weight and Lee’s index. After the 6 weeks’ gavage of grape seed procyanidins,weight and Lee’s index of ig group were significantly(p<0.05)lower than model group.The activities of intestinal protease and lipase of ig group were significantly(p<0.05)higher than that of model group and normal group,the amylase activity of ig group was significantly(p<0.05)higher than normal group,but it was not significantly(p>0.05)different with model group. There’s no significant(p>0.05)difference in intestinalα-glucosidase activity of three groups,whileβ-glucosidase activity of ig group were significantly(p<0.05)lower compared with the model group and normal group. The results showed that 200 mg/(kg·bw·d)of grape seed procyanidins could significantly inhibit obesity,and increase the activity of intestinal digestive enzyme to promote the absorption of nutrients,and reduce the activity of beta-glucosidase to lower blood glucose.

grape seed procyanidins;obesity;enzyme activity;rat

2015-11-09

李雅梅(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：功能性食品，E-mail：13161990942@163.com。

肖俊松(1980-)，男，博士，副教授，研究方向：功能性食品，E-mail：xiaojs@th.btbu.edu.cn。

國家自然科學基金青年項目(31201323)；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養三年行動計劃(0142132014)；“十二五”科技支撐項目(2011BAD23B02)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)10-0364-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.067