發酵對南酸棗飲料抗氧化性的影響

李　俶,戴濤濤,程　超,王謝祎,劉成梅,陳　軍,*,劉繼延

(1. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.江西齊云山食品有限公司,江西贛州 341000)

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發酵對南酸棗飲料抗氧化性的影響

李俶1,戴濤濤1,程超1,王謝祎1,劉成梅1,陳軍1,*,劉繼延2

(1. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.江西齊云山食品有限公司,江西贛州 341000)

以南酸棗為主要原料,利用馴化后的乳酸菌(嗜熱鏈球菌,保加利亞乳桿菌)對其進行發酵,制備南酸棗功能型乳酸菌飲料。采用福林酚法、硝酸鋁-亞硝酸鈉法測定發酵液前后游離酚、游離黃酮的含量變化;采用三種不同抗氧化模型來考察南酸棗功能型乳酸菌飲料發酵前后抗氧化性變化。研究表明,經發酵后,發酵液中的游離酚、游離黃酮含量對比發酵前有明顯升高,分別為發酵前的1.3和1.1倍;南酸棗功能型乳酸菌飲料具有較強的抗氧化性,發酵前后DPPH·清除率的IC50分別為0.137、0.185 mL/mL,ABTS+·清除率的IC50分別為0.012、0.015 mL/mL,發酵后的抗氧化能力均為發酵前1.1～1.4倍;發酵液鐵離子還原能力是發酵前的1.4～1.7倍;且均存在顯著性差異(p<0.05)。

南酸棗,發酵,抗氧化活性,飲料

越來越多的研究表明,食品經乳酸菌發酵后,能提高維生素、有機酸、氨基酸等營養成分的含量與種類,并且更易被人體消化吸收[1]。鄭欣等[2]用多種益生乳酸菌發酵荔枝汁后,其維生素C、總酚、胞外多糖、果糖等營養成分含量均有所增加。此外,乳酸菌飲料具有維持消化道微生物菌群平衡功效,有利于人體消化和營養吸收。乳酸菌飲料風味獨特,深受消費者喜愛。近年來,開發與乳酸菌相關的功能性食品已然成為研究的熱點之一[3-4]。目前,市售的乳酸菌飲料的品種較少,而向其中添加不同風味的營養物質來開發乳酸菌飲料新產品已成為一種必然的研究方向。

南酸棗(Choerospondiasaxillaris),又名五眼果、山棗等,為漆樹科(Anacardiaceae)南酸棗屬(ChoerospondiasBurttetHill)。南酸棗主要分布在印度、中南半島以及我國氣候條件、土壤條件適宜的地區,如江西、湖南、浙江等地[5]。南酸棗的營養成分豐富,其果肉的蛋白質含量約為0.92%～1.48%,有機酸含量可達 5.22%～8.13%[6];另外還含有豐富的Ca、Fe、Zn、Cu、P等礦物元素[7]及多種生物活性物質[8],如槲皮素、鞣花酸、沒食子酸等。南酸棗的干燥成果是蒙藥的習用藥材,具有治療心律失常[9]和保護心肌缺血等心血管疾病的作用[10],有研究認為南酸棗果實中的黃酮是其主要的功能成分[11]。在體內、體外的抗氧化性實驗研究中,南酸棗的水提物均表現出較好的抗氧化能力[11]。

羅登宏[12]采用野生南酸棗為主要原料制備了發酵保健飲料,此飲料香氣純正,口感協調柔和,酸甜可口,營養豐富,具有一定的保健功效。劉曉庚等[13]采用南酸棗鮮果為主要原料,制備了純天然的南酸棗汁保健飲料。基于南酸棗獨有的風味,本研究以南酸棗為主要原料,利用馴化后的乳酸菌發酵得到南酸棗風味乳酸菌飲料,同時研究發酵前、后樣液中游離酚、游離黃酮含量及其抗氧化性的變化,為南酸棗功能型乳酸菌飲料工藝優化和營養強化提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

南酸棗鮮果由江西齊云山食品有限公司提供;脫脂奶粉購買自內蒙古伊利實業集團股份有限公司;嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌購買自北京川秀科技有限公司;抗壞血酸標準品(>99.9%)、TPTZ(>99%)、DPPH(>97%)、ABTS(≥98%)均購買自美國Sigma公司;兒茶素、沒食子酸標準品購買自阿拉丁試劑有限公司;福林酚試劑購買自上海藍季科技發展有限公司。

FD-1冷凍干燥機北京德天佑科技發展有限公司;DFY-500型植物粉碎機大德藥劑有限公司;HWS-250型恒溫恒濕培養箱上海森信實驗儀器有限公司;LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠;T6新世紀紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1南酸棗飲料制造工藝流程

1.2.2南酸棗功能型乳酸菌飲料制造工藝流程

同1.2.1冷卻到40 ℃左右后接種乳酸菌(嗜熱鏈球菌,保加利亞乳桿菌)進行發酵,接種量為3%,發酵時間為7 h,發酵溫度為40 ℃,發酵結束后添加復配穩定劑:果膠添加量0.075%,黃原膠添加量0.020%,羧甲基纖維素鈉(CMC)添加量0.025%,得到南酸棗乳酸菌發酵飲料。

1.2.3功能型飲料游離酚含量的測定游離酚含量的測定方法參照Alothman等[14]的實驗方法并稍作了修改,標準曲線的繪制及樣品的測定方法具體如下:

沒食子酸標準曲線的繪制:精確稱量0.2000 g沒食子酸,蒸餾水溶解,轉移至50 mL容量瓶,定容。分別移取0.50、1.00、1.50、2.50、5.00 mL到50 mL容量瓶中,蒸餾水定容。從上述標準溶液中分別移取0.10 mL加入到50 mL容量瓶中,再分別加入30 mL去離子水,混合均勻后加入2.5 mL福林酚試劑,混勻,在5～8 min內,加入2 mL 7.5%的NaCO3溶液,混勻,定容。室溫下避光放置2 h后,以蒸餾水為空白參比,于760 nm處測定吸光度。以標準樣液質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

樣液的測定:準確移取0.10 mL發酵前后樣液于50 mL容量瓶中,按照上述操作執行,于760 nm處測定吸光度,并根據回歸方程計算樣液中游離酚的含量(以沒食子酸當量(GAE)計)。

1.2.4功能型飲料游離黃酮含量的測定游離黃酮含量的測定方法參照Yao等[15]的實驗方法并稍作了修改,標準曲線的繪制及樣品的測定方法具體如下:

兒茶素標準曲線的繪制:準確移取0.1 mg/mL兒茶素標品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別置于10 mL容量瓶中,加入適量蒸餾水后,再加入0.05 g/mL NaNO2溶液0.5 mL,搖勻后放置6 min,加0.10 g/mL Al(NO3)3溶液0.5 mL,搖勻后放置6 min,加0.04 g/mL NaOH溶液4 mL,用蒸餾水定容至刻度,搖勻,放置15 min,以蒸餾水為空白參比,于510 nm處測定吸光度。以標準樣液質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

樣液的測定:準確移取0.10 mL發酵前后樣液于10 mL容量瓶中,按照上述操作執行,于510 nm處測定吸光度,并根據回歸方程計算樣液中黃酮的含量(以兒茶素當量(CE)計)。

1.2.5DPPH·清除能力游離黃酮含量的測定方法參照Cagno等[16]的實驗方法并稍作了修改,標準曲線的繪制及樣品的測定方法具體如下:

分別配制系列濃度為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL/mL(每mL溶液中含有多少mL原液,下同)發酵前后樣液。按表1加樣,充分振蕩后室溫下于暗處反應30 min后,室溫下6000 r/min離心10 min,取上清液于515 nm處測定吸光值。以樣液濃度和清除率做標準曲線,求IC50值。

式中,A0:空白吸光值;A1:樣液吸光值。

1.2.6ABTS+·清除能力ABTS+·反應液:將7 mmol/L的ABTS+·溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合,制備ABTS+·儲備液,避光保存12～16 h。使用前先用無水乙醇將其稀釋成工作液,要求其在30 ℃、734 nm波長條件下吸光度為0.7±0.02[17]。

表1　DPPH·清除實驗加樣設計Table 1　Dosages of DPPH radical-scavenging activity method

分別配制系列濃度為0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 mL/mL的發酵前、后樣液,按表2加樣,混勻后反應6 min,于734 nm處測定其吸光度,以同等體積蒸餾水為陰性對照。以樣液濃度和清除率做標準曲線,求IC50值。

式中,A1:加樣液后測定的吸光度;A0:陰性對照的吸光度;A10:蒸餾水代替ABTS+·加入樣液后測定的吸光度。

表2　ABTS+·清除實驗加樣設計Table 2　Dosages of ABTS radical-scavenging activity method

1.2.7鐵離子還原能力游離黃酮含量的測定方法參照Benzie等[18]的實驗方法并稍作了修改,標準曲線的繪制及樣品的測定方法具體如下:

標準曲線的繪制:準確吸取0.1 mL濃度為0.025、0.050、0.075、0.100、0.150 mg/mL的抗壞血酸溶液,加入3.9 mL的FRAP溶液(2.5 mL 10 mmol/L的TPTZ溶液和2.5 mL 20 mmol/L的FeCl3溶液和25 mL 0.3 mol/L的醋酸緩沖液混合),混勻后升溫至37 ℃,保溫10 min后在593 nm下測定吸光度。以抗壞血酸溶液濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。

樣液測定:分別準確吸取0.1 mL濃度為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL/mL的發酵前、后樣液,加入3.9 mL的FRAP溶液(2.5 mL 10 mmol/L的TPTZ溶液和2.5 mL 20 mmol/L的FeCl3溶液和25 mL 0.3 mol/L的醋酸緩沖液混合),混勻后于37 ℃反應10 min后,于593 nm處測定吸光度,以蒸餾水為空白參比,樣液抗氧化活性以達到相同吸光度所需的抗壞血酸的濃度表示。

1.3統計分析方法

2　結果與分析

2.1 游離酚含量

根據沒食子酸標準曲線,得其線性回歸方程為y=0.1693x+0.0006[(x為沒食子酸質量濃度(mg/mL),y為吸光度(A))],R2=0.9996。從圖1中可以看出,發酵前后樣液游離酚含量為1245.3、1620.3μg GAE/mL,發酵后的樣液中游離酚類物質含量明顯增加,約為發酵前的1.3倍,發酵前、后樣液間的游離酚含量存在顯著性差異(p<0.05),乳酸菌發酵后的南酸棗汁中游離酚含量顯著性增加,這可能是其中一些結合態的多酚被乳酸菌產生的糖苷酶或酯酶水解[19],轉化成游離多酚,進而使發酵液中的游離多酚含量增加。微生物酶類,如葡糖甘酶、淀粉酶等可以水解葡萄糖苷,分解植物細胞壁或淀粉,從而促進多酚類物質的釋放與合成[20],使得游離酚含量增加。發酵過程中,蛋白質水解活性增強,可分解酚-肽復合物,從而釋放結合態酚類物質,使其含量增加[21]。此外,聚合酚類物質也可能通過發酵過程中的酸水解反應生成簡單酚類物質,使游離酚含量增加[20]。

圖1　發酵前后飲料游離多酚含量Fig.1　The free phenolic content of unfermented and fermented beverage注:圖中不同字母間差異顯著(p<0.05),圖2、圖4、圖6同。

2.2游離黃酮含量測定

根據兒茶素標準曲線,得其線性回歸方程為N=43.800M+0.0048[(M為兒茶素含量(mg/mL),N為吸光度)],R2=0.9999。圖2中可以看出,發酵前后樣液游離黃酮含量分別為6.81、7.68 μg CE/mL,發酵后的樣液中游離黃酮含量明顯增加,約為發酵前的1.1倍,發酵前、后樣液對比,其游離黃酮含量存在顯著性差異(p<0.05),游離多酚含量的增加導致游離黃酮含量的增加。

圖2　發酵前后飲料游離黃酮含量Fig.2　The free flavonoids content of unfermented and fermented beverage

2.3DPPH自由基清除能力

南酸棗果實中的總多酚、黃酮、抗壞血酸和其他一些物質均具有清除DPPH·的能力,DPPH·清除能力的高低反映了發酵前后樣液的抗氧化能力強弱[19]。圖3為發酵前、后樣液的DPPH·清除率的對比圖。從圖中可以看出,發酵前、后的DPPH·清除能力均隨著濃度的升高而逐漸增強,且發酵后樣液的DPPH·清除能力有很大提高,約為發酵前的1.1～1.4倍。如圖4所示,發酵前后樣液的DPPH·清除率的IC50分別為0.185、0.137 mL/mL,經方差分析可知,其IC50存在顯著性差異(p<0.05)。這可能是經乳酸菌發酵后,其中一些糖基化酚類物質被乳酸菌產生的糖苷酶去糖基,從而使其抗氧化性有所增強[22]。發酵過程中,可能還會引起一些抗氧化性成分結構上的變化[20],生成一些具有更強給電子能力的成分[21],使其抗氧化能力增強。

表3　發酵前后樣液的鐵離子還原能力Table 3　Ferric reducing/antioxidant power of unfermented and fermented beverage

注:表中數值為平均值±標準偏差(n=3)。各列不同字母間差異顯著(p<0.05)。

圖3　發酵前后樣液的DPPH·清除能力Fig.3　The DPPH radical-scavenging activity of non-fermented and fermented beverage

圖4　發酵前后樣液的抗氧化能力Fig.4　IC50 values in antioxidant properties of unfermented and fermented beverage注:IC50,半抑制濃度,當清除率達50%時的有效濃度。 IC50值通過線性回歸分析所得，圖6同。

2.4ABTS+自由基清除能力

圖5為發酵前、后樣液的ABTS+·清除率的對比圖。從圖中可以看出,發酵前、后的ABTS+·清除能力均隨著濃度的升高而逐漸增強,且發酵后樣液的ABTS+·清除能力有很大提高,約為發酵前的1.1～1.3倍。如圖6所示,發酵前后樣液的ABTS+·清除率的IC50分別為0.015、0.012 mL/mL,經方差分析可知,其IC50存在顯著性差異(p<0.05)。發酵后的樣液具有更強的自由基清除能力,可能是由于發酵過程中游離酚和黃酮苷元的含量增加,而黃酮苷元可以更有效地終止自由基反應[23-24]。

圖5　發酵前后樣液的ABTS+清除能力Fig.5　The ABTS radical-scavenging activity of non-fermented and fermented beverage

圖6　發酵前后樣液的抗氧化能力Fig.6　IC50 values in antioxidant properties of unfermented and fermented beverage

2.5鐵離子還原能力

根據抗壞血酸標準曲線,得其線性回歸方程為y=7.4535x-0.0061(x為抗壞血酸濃度/(mg/mL),y為吸光度(A)),R2=0.9997。從表3中可以看出,發酵前、后的鐵離子還原能力均隨著濃度的升高而逐漸增強,且發酵后樣液的鐵離子還原能力有很大提高,約為發酵前的1.4～1.7倍。經方差分析可知,發酵前、后樣液相比,其鐵離子還原能力存在顯著性差異(p<0.05)。Vadivel等[25]研究認為鐵離子還原能力與酚類物質的含量有關,研究結果顯示,經乳酸菌發酵后,結合態的多酚被乳酸菌產生的糖苷酶或者酯酶水解[26-27],使發酵液中游離酚含量增加,從而提高了發酵后樣液的抗氧化能力。

3　結論

以南酸棗為主要原料,利用馴化后的乳酸菌進行發酵制成南酸棗功能性乳酸菌飲料,研究表明:經發酵后,樣液中的游離酚、游離黃酮含量明顯升高,分別為發酵前的1.3倍、1.1倍,這可能是結合態的多酚轉化為游離多酚和黃酮,另外酶的作用促使多酚物質的生成與釋放。

對南酸棗功能性乳酸菌飲料的抗氧化效果進行了初步研究。結果表明:南酸棗功能性乳酸菌飲料具有較強的抗氧化性,發酵后樣液的DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力均是發酵前的1.1～1.4倍;發酵后樣液的鐵離子還原能力為發酵前的1.4～1.7倍;且均存在顯著性差異。經過發酵后,南酸棗飲料的抗氧化性明顯增強。然而,游離酚、游離黃酮含量的增加僅僅只是引起其抗氧化性增強的原因之一。發酵過程中,可能還會引起一些抗氧化性成分結構上的變化,生成一些具有更強給電子能力的成分使其抗氧化能力增強。

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Fermentation effects on antioxidant activity ofChoerospondiasaxillarisbeverage

LI Ti1,DAI Tao-tao1,CHENG Chao1,WANG Xie-yi1,LIU Cheng-mei1,CHEN Jun1,*,LIU Ji-yan2

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2. Jiangxi Qiyunshan Food Co.,LTD.,Ganzhou 341000,China)

Domesticated bacteria(StreptococcusthermophilusandLactobacillusbulgaricus)were utilized to fermentChoerospondiasaxillaristo produce functionalLactobacillusbeverages ofChoerospondiasaxillaris. The free phenolic and flavonoid compounds of beverages of fermentation and unfermentation were determined by the method of Folin-Ciocaileu and Al(NO3)3-NaNO2. Three antioxidant model were used to study the change of antioxidant activity of the beverages after fermention ofChoerospondiasaxillaris. The results showed that the content of the free phenolic and flavonoid compounds were increased to 1.3 times,1.1 times respectively after fermentation compared to that of unfermented one. It was found that the antioxidant activity of the beverage was enhanced obviously. The IC50of DPPH radical-scavenging activity of fermented and unfermented beverages were 0.137,0.185 mL/mL,respectively. The IC50of ABTS radical-scavenging activity of fermented and unfermented beverages were 0.012,0.015 mL/mL,respectively. The antioxidant activity was increased to 1.1～1.4 times,and the ferric reducing/antioxidant ability was increased to 1.4～1.7 times by fermentation. Besides,all the changes showed significant difference(p<0.05).

Choerospondiasaxillaris;fermentation;antioxidant activity;beverage

2015-08-04

李俶(1971-),女,博士,教授,主要從事天然產物的提取與應用,E-mail:liti@ncu.edu.cn。

陳軍(1986-),男,博士,助理研究員,研究方向為食品(含生物質)資源的開發利用,E-mail:chen_jun1986@126.com。

國家自然科學基金(31460394);江西省支撐計劃(20121BBF60039)。

TS272.7

B

1002-0306(2016)05-0054-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.002