分心木酸性多糖SJP-2的理化性質及其抗氧化活性研究

邵雙雙,賀　亮,韋朝陽,李衛旗,*

(1.浙江大學生命科學學院,浙江杭州 310058;2.浙江省林業科學研究院生物技術所,浙江杭州 310023)

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分心木酸性多糖SJP-2的理化性質及其抗氧化活性研究

邵雙雙1,賀亮2,韋朝陽1,李衛旗1,*

(1.浙江大學生命科學學院,浙江杭州 310058;2.浙江省林業科學研究院生物技術所,浙江杭州 310023)

以分心木為原料進行熱水浸提,經過醇沉、脫色素、脫蛋白以及DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱色譜和Sephadex-G50凝膠柱色譜分離純化得到一種酸性多糖組分(SJP-2),再對該組分進行理化性質及抗氧化活性分析。結果表明:SJP-2不含蛋白,是一個低分散度,分子量較為均一的多糖,分子量為3.239×103g/mol;HPLC分析得知SJP-2為一種酸性多糖,其單糖組成及摩爾比例為阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶半乳糖醛酸=1∶2.62∶4.45∶18.53;抗氧化活性測得SJP-2清除DPPH自由基、羥自由基以及ABTS自由基的IC50分別為0.094、0.945、0.591 mg/mL,還原能力在1.0 mg/mL時達到1.158,ORAC值為(1217.99±31.22) μmol TE/g,說明SJP-2具有較高的體外抗氧化能力。

分心木,多糖,分離純化,理化性質,抗氧化

分心木(SemenJuglandis)為胡桃科胡桃屬植物胡桃(JuglansregiaL.)果核內的木質隔膜,別名隔心木,胡桃衣,胡桃夾,胡桃隔,胡桃芯。呈薄片狀,多彎曲、破碎而不整齊,完整者呈類圓形或橢圓形,表面棕色至淺棕褐色,稍有光澤,邊緣不整齊,體輕,質脆,易折斷,氣微,味微澀,在我國南北方均有栽培[1]。分心木可以治療牙齦出血、口腔潰瘍、結石、腰痛等疾病,具有補腎澀精、利尿清熱等功效[2]。王艷等[3]對維吾爾藥核桃分心木進行研究,發現分心木95%乙醇提取物、正丁醇提取物以及水提取物均不同程度地改善了小鼠模型腎陽虛的癥狀。

多糖不僅是細胞的結構物質和能源物質,而且是一種重要的生物活性物質。越來越多的研究表明,多糖是除了蛋白質和核酸之外另一種重要的生命物質,具有多方面、復雜的生物活性及功能[4]。多糖在對腫瘤、肝炎、心血管病等疾病的預防和治療,以及在調節糖代謝和抗氧化等方面顯示出良好的應用前景,而且多糖廣泛存在于動物、植物以及微生物中,毒副作用低,因此被廣泛研究和開發應用[5]。

近年來,有關分心木化學成分及其生物活性的研究已經逐漸展開,其中對黃酮提取以及含量測定的研究比較多,對多糖的研究卻很少,而多糖又是分心木中主要的活性成分之一[6-8]。本實驗首次對分心木的多糖進行提取分離純化,并對其理化性質和抗氧化活性進行研究,為其多糖類活性物質的開發利用提供科學依據。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

分心木浙江省林業科學研究院;無水乙醇、氯仿等試劑分析純,國藥集團化學試劑有限公司;濃硫酸、鹽酸杭州化學試劑有限公司。

CL31R型多功能高速離心機美國Thermo公司;R-210型旋轉蒸發儀瑞士BUCHI公司;DZF6020 型真空干燥箱 上海博訊實業有限公司;冷凍干燥機美國LABCONCO公司;U-1900型可見分光光度計日本HITACHI公司;Spectra Max M2多功能酶標儀美國分子儀器公司;AKTA purifier層析系統美國GE醫療集團;戴安U-3000型高效液相色譜儀美國Dionex公司;多角度激光光散射儀(DAWN-II)美國Wyatt Technology Co。

1.2實驗方法

1.2.1酸性多糖的提取及分離純化分心木用粉碎機粉碎后,過20目篩,按料液比為1∶20(m/v)的比例,加去離子水,90 ℃浸提2 h,8000 r/min,離心15 min,收集上清液,濾渣重復提取1次,合并2次提取液。提取液在50 ℃下減壓濃縮,凍干得粗多糖。粗多糖溶于水,雙氧水法脫色素后,濃縮,透析(1000 u),然后采用Sevage法脫蛋白,將脫完色素蛋白的多糖樣品,過DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱(2.0 cm×35 cm),按照順序用蒸餾水、0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 mol/L 的NaCl溶液進行梯度洗脫,流速為1.0 mL/min,每管收集4 mL,苯酚-硫酸法檢測糖分布,最后用Sephadex-G50凝膠柱色譜(1.0×64 cm)對多糖進一步純化,蒸餾水做洗脫液,流速為0.5 mL/min,每管收集4 mL,苯酚-硫酸法檢測糖分布,可得到分心木純化后的多糖組分SJP-2[9]。

1.2.2蛋白含量測定考馬斯亮藍G250法[10]。

1.2.3分子量及純度測定將激光光散射檢測器與示差折光檢測器聯用對多糖分子量及其純度進行鑒定,配制0.1 mol/L NaNO3溶液作為流動相,過0.22 μm膜,超聲脫氣30 min。稱取3 mg多糖樣品溶解于1 mL 0.1 mol/L NaNO3溶液中,磁力攪拌溶解4 h,過0.22 μm膜,采用Astra軟件采集散射信號并進行數據處理[11]。

1.2.4單糖組成單糖組成的測定,參考Dai等[12]的方法,并做了適當的修改。

多糖水解:稱取3 mg多糖,加入1 mL 4 mol/L TFA溶液,121 ℃水解6 h,加入200 μL甲醇,60 ℃真空離心濃縮,去除殘留的三氟乙酸,反復3次,加入50 μL 0.3 mol/L NaOH溶液溶解。

單糖及多糖水解液的PMP衍生化:準確稱取10種單糖標準品,加去離子水配成5 mmol/L的單糖標準液,取100 μL單糖標樣溶液,分別加入100 μL NaOH(0.6 mol/L)溶液,混勻得到2.5 mmol/L的單糖標準液。取50 μL多糖水解后溶液及10種2.5 mmol/L的單糖標樣溶液,分別加入50 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇液,混勻,70 ℃水浴100 min,然后加入50 μL 0.3 mol/L HCl,加水至總體積為1 mL后,加入1 mL氯仿,震蕩、離心除去PMP等雜質,收集水相,重復5次,過0.45 μm膜,待HPLC。

RP-HPLC測定條件:檢測波長為245 nm,流速為1.0 mL/min,柱溫:25 ℃,柱子:HYPERSIL APS-2(4.6×250 mm,5 μm,Thermo,USA),進樣體積為10 μL,流動相A(乙腈):流動相B(PBS緩沖液,pH6.8)=15∶85。

1.2.5抗氧化活性研究

1.2.5.1DPPH自由基清除率測定參考李志平等[13]的方法,在試管中加入1.0 mL溶于95%乙醇的DPPH(0.2 mmol/L),然后加入1.0 mL不同濃度的樣品溶液,混勻,室溫黑暗靜置30 min,于517 nm處測定吸光值,VC作為陽性對照,DPPH自由基的清除率通過以下公式計算:

式中:A0為空白樣品吸光值,As加樣后的吸光值,Aj為以蒸餾水代替DPPH的吸光值。

1.2.5.2羥自由基清除率參考Mao等[14]的測定方法并稍作修改,具體方法為:2.0 mL FeSO4溶液(6 mmol/L)與2.0 mL不同濃度的樣品混勻,加入2 mL H2O2(6 mmol/L),搖勻,室溫靜置10 min后,加入2.0 mL水楊酸(6 mmol/L),混勻,室溫靜置10 min,于510 nm處測定吸光值,VC作為陽性對照,對羥自由基的清除能力按照下面公式進行計算:

式中:A0為空白樣品吸光值,As加樣后的吸光值,Aj為以蒸餾水代替H2O2的吸光值。

1.2.5.3還原力參考Akbari等[15]的方法,在試管中加入不同濃度樣品液,依次加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH6.6,0.2 mol/L),2.5 mL鐵氰化鉀(1%,w/v),搖勻,50 ℃水浴20 min后,加入2.5 mL三氯乙酸(10%,w/v),離心(1200 r/min,10 min),吸取2.5 mL上清液與2.5 mL蒸餾水和0.5 mL FeCl3(0.1%,w/v)混勻,室溫靜置10 min,于700 nm處測定吸光值,VC作為陽性對照,樣品反應后吸光值越高,還原能力越強。

1.2.5.4ABTS自由基清除率參考Luo等[16]的實驗方法,ABTS+·溶液(7 mmol/L)用75%乙醇稀釋,在734 nm處調整吸光值為0.70±0.02,0.1 mL樣品液與3.9 mL of ABTS+·溶液在試管中混勻,室溫反應10 min,在734 nm處測定吸光值,VC作為陽性對照,按照下式計算對ABTS自由基的清除率:

式中,A0為空白樣品吸光值,As加樣后的吸光值。

1.2.5.5氧自由基吸收能力(ORAC)總的反應混合液為200 μL,在96孔板的微孔中加入20 μL熒光素(35 nmol/L),40 μL待測樣品液和140 μL AAPH(12.8 mmol/L)。該反應在75 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)體系中進行,檢測溫度為37 ℃,激發波長為485 nm,發射波長為528 nm,每隔2 min測定一次吸光強度,持續98 min。各個微孔不同時間點的絕對熒光強度與其初始時間的熒光強度之比,得到相對熒光強度,以相對熒光強度采用近似積分法計算熒光衰退曲線下面積(AUC)。Net AUC=AUCsample-AUCblank,Net AUC與抗氧化物的濃度成正相關。ORAC值即Trolox當量(TE),以μmol TE/g表示[17]。

1.3數據分析

采用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0軟件對相關數據進行統計分析。

2　結果與分析

2.1酸性多糖的提取及分離純化

分心木經過熱水浸提以及乙醇沉淀后得到粗多糖。由圖1A可知,多糖脫色素脫蛋白后,經過DEAE-Sepharose Fast Flow柱分離,得到兩個組分,命名為:SJP-1和SJP-2,其中組分SJP-1含量為10.92%,SJP-2含量為89.08%。SJP-1的得率與SJP-2相比較低,所以選取主要組分SJP-2經過Sephadex-G50 凝膠柱進一步純化,得到單一對稱的洗脫峰,如圖1B,由圖表明經過凝膠柱進一步純化后獲得了純度較高的多糖組分。

圖1　分心木多糖的DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sephadex-G50柱層析洗脫曲線Fig.1　Elution profile of polysaccharide from Semen Juglandis on DEAE-Sepharose Fast Flow columnand gel filtration on Sephadex-G50

2.2酸性多糖SJP-2的蛋白含量

考馬斯亮藍G250測得牛血清白蛋白標準曲線線性方程為:y=0.2136x-0.0097,R2=0.9992,根據標準曲線計算得知SJP-2不含蛋白。

2.3酸性多糖SJP-2的分子量及純度

如圖2所示,樣品峰出現在10～20 min之間,90°光散射和示差檢測器RI所產生的峰形具有相似大小和形狀,幾乎完全重疊,并且顯示多糖呈現單一對稱峰,表明SJP-2為均一性的多糖。同時,測得SJP-2多糖純度達到99.61%,分子量Mw=3.239×103g/mol,Mw/Mn=1.023。Mw/Mn表示樣品的分散度,分子量分布越寬,分散度就越大[18]。Mw/Mn比較接近1,表明SJP-2是一個低分散度的多糖。

圖2　SJP-2在0.1 mol/L NaNO3溶液25 ℃的 SEC-MALLS尺寸排阻色譜圖Fig.2　SEC chromatogram of SJP-2 in 0.1 mol/L NaNO3 solution at 25 ℃ detected by SEC-MALLS

2.4酸性多糖SJP-2的單糖組成

如圖3所示,A為10種單糖標準品的HPLC圖,B為SJP-2單糖組成的HPLC圖。由圖可知,SJP-2多糖的單糖組成及摩爾比例為:阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶半乳糖醛酸=1∶2.62∶4.45∶18.53,其中,半乳糖醛酸含量最高,為69.97%,說明SJP-2為酸性多糖糖,這與高莉等[19]得到的核桃隔膜多糖的單糖組成(阿拉伯糖∶果糖∶甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖=2.11∶6.25∶8.81∶12.59∶15.58)具有較大差異,這可能與實驗樣品不同有關。

圖3　10種單糖標準品與SJP-2的HPLC色譜圖Fig.3　The HPLC chromatogram of 10 standard monosaccharides and SJP-2

2.5酸性多糖SJP-2的體外抗氧化活性

2.5.1DPPH自由基清除率如圖4所示,在0.02～0.10 mg/mL范圍內,隨著濃度的升高,VC和SJP-2對DPPH自由基的清除能力逐漸增強;在0.1 mg/mL時,VC和SJP-2對DPPH自由基的清除率分別達到99.68%和53.90%,SJP-2的IC50為0.094 mg/mL,清除DPPH自由基的能力比VC弱,但是與鐘葵等[20]測得的綠豆多糖酸性組AEMP-2對DPPH自由基的清除能力(IC50為0.103 mg/mL)相近。

圖4　VC和SJP-2對DPPH自由基的清除率Fig.4　DPPH scavenging activity of VC and SJP-2

2.5.2羥自由基清除率如圖5所示,在實驗濃度范圍內,隨著濃度的增加,VC和SJP-2對羥自由基的清除能力越強;當濃度為1.0 mg/mL時,VC和SJP-2對羥自由基清除力大小分別為99.01%和54.68%,VC和SJP-2清除羥自由基的IC50分別為0.291 mg/mL和0.945 mg/mL,SJP-2對羥自由基的清除能力要低于VC,但比高莉等[21]測得多糖PDJL和PDJL-A3清除羥自由基的能力要高。

圖5　VC和SJP-2對羥自由基的清除率Fig.5　Hydroxyl radical scavenging activity of VC and SJP-2

2.5.3還原力如圖6所示,在0.2～1.0 mg/mL范圍內,隨著濃度的增大,VC和SJP-2的還原能力越大;在0.2 mg/mL時,VC和SJP-2還原能力大小分別為0.637和0.295,在1.0 mg/mL時,VC和SJP-2還原能力大小分別為1.523和1.158,SJP-2還原能力要比VC的還原能力弱。

圖6　VC和SJP-2的還原能力Fig.6　Reducing power of VC and SJP-2

2.5.4ABTS自由基清除率如圖7所示,在0.2～1.0 mg/mL測定范圍內,隨著濃度增加,VC和SJP-2對ABTS自由基的清除能力逐漸增強;在1.0 mg/mL時,VC和SJP-2對ABTS自由基的清除率分別為100%和68.05%,SJP-2清除ABTS自由基的IC50為0.591 mg/mL,SJP-2對ABTS自由基的清除能力要比VC弱。

圖7　VC和SJP-2對ABTS自由基的清除率Fig.7　ABTS scavenging activity of VC and SJP-2

2.5.5氧自由基吸收能力(ORAC)如圖8所示,A為標準品Trolox在不同濃度下的相對熒光強度衰退曲線,B為SJP-2為1.25 μg/mL時的相對熒光強度衰退曲線。Trolox系列標準液標準曲線線性方程為:y=1.0581x+4.0779,R2=0.9991。根據標準曲線線性方程計算得到,SJP-2的ORAC值為(1217.99±31.22) μmol TE/g,與趙謀明等[22]測得去皮核桃仁酶解物的ORAC值(約為1200 μmol TE/g)相當。

圖8　Trolox標準品及SJP-2多糖熒光衰退曲線Fig.8　Fluorescence decay curve of Trolox and SJP-2注:A為不同濃度的Trolox標準品的熒光衰退曲線, B為SJP-2多糖的熒光衰退曲線。

3　結論

分心木經過水提醇沉,脫色素脫蛋白,以及DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱色譜和Sephadex-G50凝膠柱色譜的分離純化,得到酸性多糖組分SJP-2。考馬斯亮藍G250法測得SJP-2不含蛋白;激光光散射檢測器與示差折光檢測器聯用檢測分析得知SJP-2純度達到99.61%,是一個低分散度,分子量較為均一的多糖,其分子量大小為3.239×103g/mol;高效液相色譜分析表明,SJP-2為酸性多糖,其單糖組成及摩爾比例為阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶半乳糖醛酸=1∶2.62∶4.45∶18.53,其中半乳糖醛酸含量最高(69.97%);抗氧化活性測定得知SJP-2清除DPPH自由基、羥自由基以及ABTS自由基的IC50分別為0.094、0.945、0.591 mg/mL,還原能力在1.0 mg/mL時達到1.158,ORAC值為(1217.99±31.22) μmol TE/g,說明SJP-2具有較高的體外抗氧化能力,可以作為天然的抗氧化添加劑應用到食品、化妝品和藥品等行業,為分心木多糖的開發及利用提供理論依據。

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Physicochemical properties and antioxidant activity of acid polysaccharide sjp-2 fromSemenJuglandis

SHAO Shuang-shuang1,HE Liang2,WEI Chao-yang1,LI Wei-qi1,*

(1.College of Life Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.Institute of Biological Technology,Zhejiang Forestry Academy,Hangzhou 310023,China)

The polysaccharide SJP-2 fromSemenJuglandiswas obtained by hot water extraction and alcohol precipitation,and purified using DEAE-Sepharose Fast Flow chromatography and Sephadex-G50 gel column chromatography. The physicochemical properties and antioxidant activity of SJP-2 were determined. The result showed that SJP-2 without proteins,was a lower dispersion polysaccharide with uniform molecular of 3.239×103g/mol,and the purity was 99.61%. The SJP-2 was acid polysaccharide determined by HPLC,and composed of arabinose,galactose,glucose,and galacturonic acid with a molar ratio of 1∶2.62∶4.45∶18.53. The IC50of DPPH scavenging activity,hydroxyl radical scavenging activity,and ABTS scavenging activity were 0.094,0.945,0.591 mg/mL,respectively. At 1 mg/mL,the reducing power was 1.158. The ORAC of SJP-2 was(1217.99±31.22) μmol TE/g. It was demonstrated that SJP-2 had higher antioxidant activity.

SemenJuglandis;polysaccharide;isolation and purification;physicochemical properties;antioxidant activity

2015-06-03

邵雙雙(1990-)，女，碩士在讀，研究方向：微生物學，E-mail:shaoshuanger@sina.com。

李衛旗(1964-),男，博士，副教授，研究方向：天然產物加工，E-mail:liweqi2014@sina.com。

浙江省重大科技攻關項目(2012C12004-4)；浙江省科技計劃項目(2014C32085)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)05-0059-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.003