5種黑穗醋栗果實中糖酸組成與含量分析

李　賀,李歆昕,陸　璐,柯筱純,阮成江

(大連民族大學環境與資源學院,遼寧大連 116600)

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5種黑穗醋栗果實中糖酸組成與含量分析

李賀,李歆昕,陸璐,柯筱純,阮成江*

(大連民族大學環境與資源學院,遼寧大連 116600)

采用高效液相色譜法對5個品種黑穗醋栗果實的主要糖酸組分進行定性和定量分析,并計算甜度和甜酸比。結果表明,黑穗醋栗果實中糖組分包括果糖、葡萄糖、蔗糖,其中以果糖(19.03～32.74 mg/g)和葡萄糖(17.47～23.21 mg/g)為主;黑穗醋栗果實中有機酸組分包括草酸、奎寧酸、蘋果酸、維生素C、檸檬酸等,其中以檸檬酸(19.16～24.33 mg/g),維生素C(2.53～8.80 mg/g),蘋果酸為主(0.92～2.27 mg/g)。不同品種黑穗醋栗果實中的糖酸組成及含量存在一定的差異,果糖和葡萄糖含量最高的品種為寒豐,檸檬酸含量最高的品種為奧依賓,蘋果酸和維生素C含量最高的品種為寒豐。甜度/總酸值是影響黑穗醋栗果實甜酸風味的一個重要因素。各品種甜度/總酸值在179.23～261.01之間,總體表現為寒豐>丹豐>綏研1號>黑豐>奧依賓。

黑穗醋栗(RibesnigrumL.),高效液相色譜,糖,有機酸,甜度/總酸

黑穗醋栗(RibesnigrumL.)俗稱黑加侖,虎耳草科茶藨子屬落葉直立灌木,抗寒性強、色澤好、風味獨特,是極具寒地特色的小漿果樹種[1]。果實富含維生素C、花青素等營養成分[2],可鮮食。作為黑穗醋栗果實中的主要風味物質,可溶性糖和有機酸直接影響果實的甜酸風味和口感,是衡量果實品質的重要指標[3-5]。因此,研究糖、酸風味物質的組成與含量及其對果實風味品質形成的影響,對于黑穗醋栗品質評價及其相關食品、飲料的加工具有重要意義。

國內外有較多關于植物果實糖酸組分分析的報道[6-10],但是關于黑穗醋栗果實糖酸組分及含量的研究報道不多,Kampuss[11]曾對黑穗醋栗等三種漿果進行了糖、酸、維生素C等組分的分析,Jasminka等[12]連續三年對種植在塞爾維亞共和國的3個黑穗醋栗品種進行了糖、酸的測定,研究發現不同品種的黑穗醋栗果實糖酸含量存在較大差異。國內至今還未見黑穗醋栗果實糖、酸組成及含量分析的相關報道,亟待對我國黑穗醋栗品種進行此方面的研究,揭示不同品種果實在糖、酸組成及含量上的差別,及其對風味品質的影響。本研究以5個黑穗醋栗品種為試材,采用高效液相色譜法(HPLC)對果實糖、酸組分和含量進行了分析,比較了不同黑穗醋栗品種果實甜酸風味的差異,在考慮不同糖組分對果實甜度產生不同影響的基礎上,綜合評價了5個黑穗醋栗品種的甜酸風味,以期為黑穗醋栗品質評價、品種改良提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試的5個黑穗醋栗品種(奧依賓,綏研1號,丹豐,黑豐,寒豐)的成熟果實于2014年7月采自黑龍江省農業科學院漿果研究所黑穗醋栗材料圃,實驗室中-20 ℃長期保存。果糖、葡萄糖、蔗糖、奎寧酸、L-蘋果酸、維生素C、檸檬酸標準品和磷酸二氫鉀(KH2PO4,色譜級,≥99.5%)Sigma-Aldrich(中國)公司;草酸標準品德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈和甲醇(均為色譜純級)美國Honeywell Burdick & Jackson公司;二硫蘇糖醇(DTT,≥99%)德國Merk公司;偏磷酸國藥集團化學試劑有限公司。

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀及工作站美國Agilent公司;SB52000型超聲波清洗儀寧波新藝超聲設備有限公司;PL203型電子天平瑞士METTLER TOLEDO公司;H2100R型高速冷凍離心機湖南湘儀離心機儀器有限公司;AD200L-P型分散勻質機上海昂尼儀器儀表有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品處理準確稱取2 g凍果于50 mL離心管中,加入2 mL提取液(酸提取液:2%偏磷酸,含0.1% DTT,下同;糖提取液:超純水,下同),勻漿30 s,漩渦混合1 min,室溫水浴超聲2 min,4 ℃下15000×g離心15 min,取上清液到10 mL離心管中,殘渣中加入1 mL提取液再提取,合并上清液,用提取液定容至5 mL,經0.22 μm濾膜過濾后備用。糖待測液樣品在上機前用超純水稀釋2～3倍。

1.2.2標準溶液的配制準確稱取果糖、葡萄糖標準品各500 mg,蔗糖標準品200 mg混合定容于10 mL容量瓶,得到果糖50 mg/mL、葡萄糖50 mg/mL、果糖20 mg/mL的混標母液,用超純水稀釋糖混標母液,得到果糖和葡萄糖濃度為10.00,4.00,2.50,1.25,1.00,0.50 mg/mL,蔗糖濃度為6.00,2.40,1.50,0.75,0.60,0.30 mg/mL的一系列糖混標溶液。準確稱取草酸20 mg、奎寧酸40 mg、蘋果酸50 mg、維生素C 250 mg、檸檬酸500 mg,混合定容于10 mL容量瓶,得到草酸2 mg/mL、奎寧酸4 mg/mL、蘋果酸5 mg/mL、維生素C 25 mg/mL,檸檬酸50 mg/mL的有機酸混標母液,用超純水稀釋有機酸混標母液,得到草酸濃度為0.40,0.20,0.16,0.10,0.08,0.05 mg/mL,奎寧酸濃度為0.80,0.40,0.32,0.20,0.16,0.10 mg/mL,蘋果酸濃度為1.00,0.50,0.40,0.25,0.20,0.125 mg/mL,維生素C濃度為5.00,2.50,2.00,1.25,1.00,0.625 mg/mL,檸檬酸濃度為10.00,5.00,4.00,2.50,2.00,1.25 mg/mL的一系列有機酸混標溶液。

1.2.3高效液相色譜條件糖組分的液相色譜條件:RID示差檢測器,色譜柱:Zorbax Carbohydrate Analysis column(250 mm×4.6 mm,5 μm,Agilent),流動相為乙腈∶水=7∶3,流速0.7 mL/min,柱溫30 ℃,檢測池溫度35 ℃,進樣量20 μL。

有機酸測定的液相色譜條件:DAD二極管陣列檢測器,色譜柱:Shim-pack VP-ODS column(250 mm×4.6 mm,5 μm,Shimadzu),帶C18保護柱(4× 3.0 mm),流動相:40 mmol/L KH2PO4(含0.1% DTT),流速為0.4 mL/min,柱溫35 ℃,進樣量 20 μL。維生素C檢測波長245 nm,其它有機酸檢測波長208 nm。

1.2.4糖、酸測定的可行性

1.2.4.1線性關系和重復性的考察對濃度分別為0.30～10.00 mg/mL和0.05～10.00 mg/mL的糖、酸混合標準溶液進行HPLC分析,對各測得值進行相關關系分析,并擬合線性回歸方程;測定6份平行處理得到的樣品,計算測定結果的相對標準偏差(RSD),以考察實驗方法的重復性。

1.2.4.2回收率的測定對回收率的測定本研究采用加標回收法[13]。精確量取已知質量濃度的同一樣品提取液3份,加入不同質量濃度的糖組分單標標樣,使得每種糖組分質量濃度均增加1 mg/mL;另取5份已知質量濃度的同一樣品提取液,分別加入不同的有機酸組分單標標樣,使5種有機酸(草酸、奎寧酸、蘋果酸、維生素C、檸檬酸)的質量濃度分別增加0.05,0.05,0.20,0.50,1.00 mg/mL。根據加入標準品的質量濃度和檢出質量濃度計算回收率。

1.2.4.3確定出峰時間在基本一致的外界環境下(如溫度、濕度等),將標樣和樣品的待測液在相應的色譜條件下進行分析,考察出峰時間(每次實驗前先測定混標以確定當天的實驗條件下各組分的出峰時間)。

1.2.55個黑穗醋栗品種果實糖、酸組分及其含量的測定按照1.2.1項下方法制備樣品溶液并適當稀釋,按照1.2.3項下方法進樣,用外標法計算各物質含量,每個樣品重復3次。

1.2.6甜度計算甜度的計算參照梁俊等[13]和姚改芳等[14]的方法。將蔗糖甜度定為100,以此為標準進行甜度對比,則果糖為175,葡萄糖為70,甜度值=果糖含量×175+葡萄糖含量×70+蔗糖含量×100。

1.2.7果實甜酸風味的評測參照趙尊行等[15]的方法,用甜度/總酸值來評測果實風味。感官評價:將果實切成多個小塊,邀請10位測試者進行品嘗,對果實的甜酸風味打分。口感評價分為三個等級:偏甜(記3分)、甜酸(記2分)和偏酸(記1分),以口感得分平均值作為感官評價的最終得分。

表1　糖測定的線性回歸方程的相關性和重復性Table 1　Linearity and repeatability determination of sugars

注:回歸方程中X代表糖質量濃度,Y代表峰面積。

表2　有機酸測定的線性回歸方程的相關性和重復性Table 2　Linearity and repeatability determination of organic acids

注:回歸方程中X代表有機酸質量濃度,Y代表峰面積。

1.3數據處理

實驗數據采用SPSS22.0進行平均數、相對標準偏差和多重比較分析。

2　結果與分析

2.1糖,酸含量測定的可行性

2.1.1線性關系與重復性如表1和表2所示,三種糖的線性回歸方程的相關系數為0.9902～0.9970;五種有機酸的線性回歸方程的相關系數為0.9906～0.9985,表明在設定的高效液相色譜條件下各種糖、酸組分的峰面積與其含量有較好的線性相關性,實驗方法能在給定的濃度范圍內較準確地測定糖、酸組分的含量。6份平行處理的樣品經分析測定,糖、酸組分的相對標準偏差分別為2.34%～4.80%和0.04%～4.64%,說明HPLC方法具有較好的重復性,達到了分析的要求。

2.1.2回收率如表3和表4所示,糖、酸組分的加標回收率分別在92.39%～102.26%和92.22%～104.62%之間,相對標準偏差均小于4%,回收率較高,相對標準偏差較小,滿足分析測試的需要。

表3　糖測定的回收率Table 3　Recoveries of sugars determination

表4　有機酸測定的回收率Table 4　Recoveries of organic acids determination

2.1.3出峰時間圖1和圖2分別為糖混合標準品和黑豐果實中糖組分的液相色譜圖,如圖所示,所有糖組分在15 min內出峰完畢。樣品中糖組分的組成較簡單,只含有與糖標準品相同的3種糖組分,且均被很好地分離開來。圖3和圖4分別為有機酸混合標準品和丹豐果實中有機酸組分的液相色譜圖,如圖所示,所有有機酸組分在18 min內出峰完畢。樣品中有機酸酸組分的組成較為復雜,除有機酸標準品中的5種酸以外還含有個別未知酸且與幾種已知酸組分的出峰時間極為相近,難以完全分離,但黑穗醋栗中三種主要的有機酸組分,檸檬酸、維生素C和蘋果酸都能夠被較好的分離。

圖1　糖混合標準樣品的色譜圖Fig.1　Chromatogram of mixture standard of sugars注:1.果糖;2.葡萄糖;3.蔗糖。

圖2　黑豐果實糖組分色譜圖Fig.2　Chromatogram of sugar components in Heifeng注:1.果糖;2.葡萄糖;3.蔗糖。

圖3　有機酸混合標準樣品的色譜圖Fig.3　Chromatogram of mixture standard of organic acids注:1.草酸;2.奎寧酸;3.蘋果酸; 4.維生素C;5.檸檬酸,圖4同。

圖4　丹豐果實有機酸組分的色譜圖Fig.4　Chromatogram of organic acid components in Danfeng

2.25種黑穗醋栗果實中糖組分及其含量

如表5所示,不同黑穗醋栗品種果實中糖組分組成基本相同,但含量上有差異,果糖含量19.03～32.74 mg/g,葡萄糖含量17.47～23.21 mg/g,蔗糖含量4.55～10.56 mg/g。果糖、葡萄糖、蔗糖均為黑穗醋栗果實中的主要糖組分,但蔗糖含量相對偏低,含量上總體表現為:果糖>葡萄糖>蔗糖。在5個品種中,總糖含量表現為:寒豐>丹豐>綏研1號>黑豐>奧依賓;果糖含量表現為:寒豐>綏研1號>丹豐>奧依賓>黑豐;葡萄糖含量表現為:寒豐>綏研1號>丹豐>奧依賓>黑豐;蔗糖含量表現為:黑豐>寒豐>丹豐>綏研1號>奧依賓。

不同糖組分在不同品種總糖中所占比例表現為,果糖占總糖比最高的品種為綏研1號(51.51%),最低的為黑豐(40.44%);葡萄糖占總糖含量的比例最高的為奧依賓(39.24%),最低的為寒豐(35.78%),蔗糖占總糖比例最高的為黑豐(22.44%),最低的為綏研1號(9.63%)。寒豐品種果實中果糖和葡萄糖含量均最高,分別為32.74、23.21 mg/g;黑豐品種蔗糖含量最高為10.56 mg/g(表5)。

表5　5個黑穗醋栗品種的果實中糖組分及含量(mg/g)Table 5　Contents of sugar components in 5 blackcurrant cultivars(mg/g)

注:同列數據后不同大寫字母表示差異顯著(p<0.05),表6同。

2.35種黑穗醋栗果實的甜度

由于不同種類的糖甜度不同,對果實口感的影響也不同,所測得的3種糖中,果糖最甜,蔗糖其次,葡萄糖甜度最低[14]。測得的三種糖在黑穗醋栗中所含的比例不同,因此不能用總糖含量來反映整體的甜味,而應根據不同糖種類的不同甜度計算出的其整體甜度值進行判斷。例如,由表5可知總糖含量上黑豐高于奧依賓,但由于奧依賓中的果糖含量比黑豐高,使得黑豐的甜度比奧依賓低。5種黑穗醋栗果實的甜度值表現為:寒豐>丹豐>綏研1號>奧依賓>黑豐。甜度值分布在5000～6000的品種2個,分別是奧依賓和黑豐;甜度值在6000～7000的品種2個,分別是綏研1號和丹豐;甜度值>7000的品種只有1個,即寒豐。

表6　5個黑加侖品種的果實中有機酸組分及含量(mg/g)Table 6　Contents of organic acid components in 5 blackcurrant cultivars

2.45種黑穗醋栗果實中有機酸組分及其含量

從有機酸的混合標準樣品出峰情況可看出,在設定的色譜條件下(維生素C的檢測波長為245 nm,其余酸組分被檢測波長為208 nm),各種有機酸分離效果較好,峰形對稱;但從樣品的出峰效果來看,草酸峰和奎寧酸峰與鄰峰有連峰現象,其它3種酸分離情況較好,峰形也較對稱。從樣品出峰結果還能發現黑穗醋栗果實中在208 nm波長下可檢成分比較復雜,可能是由于高濃度的色素干擾或是其它含量較少的酸。如表6所示,不同黑穗醋栗品種的果實中有機酸組分組成基本相同,以檸檬酸為主(60.67%～81.43%),其次是維生素C(8.98%～27.87%)和蘋果酸(3.54%～7.19%),草酸和奎寧酸含量偏低,占總酸比例均低于5%。在5個品種中,總酸含量表現為奧依賓>寒豐>丹豐>綏研1號>黑豐;檸檬酸含量表現為奧依賓>綏研1號>丹豐>黑豐>寒豐;維生素C含量表現為寒豐>奧依賓>丹豐>黑豐>綏研1號。5個黑穗醋栗品種中,奧依賓品種果實中的檸檬酸含量最高,為24.33 mg/g;寒豐品種果實中的蘋果酸和維生素C含量均最高,分別為2.27 mg/g和8.80 mg/g。

2.55種黑穗醋栗實的風味比較

關于果實風味的研究有人認為主要取決于總糖,總酸的含量和糖酸比[16-18],但由于總糖含量并不能反映果實的真實甜度,所以本研究參考梁俊等[13]的觀點,用甜度/總酸值來反映黑穗醋栗果實的風味,實際的口感評價結果符合甜度/總酸值反映的結果。5個黑穗醋栗品種的甜度/總酸值(表6)表現為寒豐>丹豐>綏研1號>黑豐>奧依賓,果實的口感表現出的規律與甜度/總酸值相同,寒豐的口感偏甜,丹豐、綏研1號和黑豐為甜酸風味,奧依賓口感偏酸,其中奧依賓的總甜度(5689.04)高于黑豐(5607.86),但口感較黑豐偏酸,就是由于奧依賓的總酸含量(31.74 mg/g)高于黑豐(26.10 mg/g),使奧依賓的甜度/總酸值小于黑豐。因此,本研究認為甜度/總酸值是影響黑穗醋栗果實風味的重要因素。

3　討論

通過對5種黑穗醋栗的研究,發現其果實中主要的糖組分為果糖、葡萄糖,主要的有機酸組分有檸檬酸、蘋果酸,這與Jasminka等[12]的研究結果一致,但本研究發現5個黑穗醋栗品種中檸檬酸的平均含量(21.72 mg/g)遠遠大于蘋果酸(1.58 mg/g),而Jasminka等分析的3個品種中二者相差不大且含量較低,說明不同地區黑穗醋栗品種間的活性成分含量存在很大差異。本研究5個品種中寒豐的果糖、葡萄糖和蔗糖含量最高,甜度/總酸值最大,口感最甜,奧依賓總糖和甜度最低,總酸最高,甜度/總酸值最小,口感偏酸,品種間在糖酸的組成和含量上存在一定的差異。已有研究認為黑穗醋栗的種間及品種間的差異與基因型(遺傳因素),降水量(氣候因素)以及果實的成熟度等有關[12,19],本研究的材料來自同一生長地,氣候等環境因素相似,且于成熟期采集,因此推測品種的遺傳特性是主要因素,但這一推測有待進一步研究。

另外,本研究發現黑穗醋栗果實中除了檸檬酸和蘋果酸,還存在草酸,奎尼酸和含量較高的維生素C,前兩者在以往的文獻中還未見報道。本研究中測得的各品種果實維生素C的平均含量為4.56 mg/g,高于劉洪章等[20]在亮葉,黑珍珠和新賓三個品種中測得的維生素C含量(最高為1.58 mg/g),這說明黑穗醋栗有機酸的組成及含量在品種間的差異有待深入研究。

果實風味品質的形成是糖、酸以及揮發性芳香物質等多種成分共同作用的結果,其中糖、酸的組成及其含量起主要作用。黑穗醋栗中很多種物質影響果實的風味,但其口感主要受糖、酸組分及含量的影響,并且不同糖組分對甜味的影響程度不同,因此并不能由總糖含量或是總糖/總酸含量來判斷果實的口感,而應用甜度/總酸值來反映果實甜酸風味。例如,黑豐品種的甜度雖然低于奧依賓,但其總酸值相對奧依賓品種也更低,所以黑豐的甜度/總酸值高于奧依賓,相應的口感也偏甜。因此,本研究認為對于黑穗醋栗來說,甜度/總酸值是影響和反映果實口感的重要因素和指標。

4　結論

黑穗醋栗果實中的糖組分有果糖、葡萄糖、蔗糖;有機酸組分有草酸、奎尼酸、蘋果酸、維生素C、檸檬酸,不同品種在糖、酸的組成及含量上存在一定的差異。本研究中5種黑穗醋栗果實中糖主要成分為果糖和葡萄糖,二者含量平均約占總糖含量的86.06%,有機酸主要成分為檸檬酸,其含量平均約占總酸含量的74.53%,其次為維生素C、蘋果酸,二者含量平均約占20.59%。甜度/總酸值是影響黑穗醋栗果實甜酸風味的重要因素,5個品種中甜度/總酸值最高的品種是寒豐(>260),最低的是奧依賓(<200),其余3個品種甜度/總酸值在210～230之間。

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Analysis of contents and constituents of sugar and organic acid in 5 black currant cultivars

LI He,LI Xin-xin,LU Lu,KE Xiao-chun,RUAN Cheng-jiang*

(College of Environment and Resources,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China)

The primary sugars and organic acids of five blackcurrant cultivars were analyzed quantitatively and qualitatively by HPLC(High Performance Liquid Chromatography)method,and the sweetness and sweetness/total acids were calculated. The results indicated that the soluble sugars in blackcurrant berries included fructose,glucose and sucrose,of which fructose(19.03～32.74 mg/g)and glucose(17.47～23.21 mg/g)were much more than sucrose. The organic acid components in blackcurrant included oxalic acid,quinic acid,malic acid,vitamin C and citric acid,of which citric acid(19.16～24.33 mg/g),vitamin C(2.53～8.80 mg/g)and malic acid(0.92～2.27 mg/g)were much more than others. There were some differences in composition and content of sugar and organic acid among five black currant varieties. Hanfeng exhibited the highest levels of fructose and glucose in comparison to the other cultivars. The berries of Aoyibin contained highest citric acid in all the cultivars. Vitamin C and malic acid were richest in berries of Hanfeng. The value of sweetness/total acids was an important indicator influencing the sweet and sour flavors of black currant fruit. The sweetness/total acids was from 179.23 to 261.01,and Hanfeng>Danfeng>Suiyan 1st>Heifeng>Aoyibin.

black currant(RibesnigrumL.);HPLC;sugars;organic acids;sweetness/total acids

2015-08-27

李賀(1975-)，女，博士研究生，副教授，研究方向：植物成分分析，E-mail:lihe@dlnu.edu.cn。

阮成江(1972-)，男，博士，教授，研究方向：植物代謝組學，E-mail:ruan@dlnu.edu.cn。

國家自然科學基金(31100489)；大學生創新創業訓練計劃(X201412236)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)05-0137-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.018