響應面法優化懷菊水溶性總多酚的超聲提取工藝

樊燕鴿,張娟梅,黃做華

(1.河南大學藥學院,河南開封 475004;2. 河南省科學院化學研究所有限公司,河南鄭州 450002)

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響應面法優化懷菊水溶性總多酚的超聲提取工藝

樊燕鴿1,2,張娟梅1,*,黃做華2

(1.河南大學藥學院,河南開封 475004;2. 河南省科學院化學研究所有限公司,河南鄭州 450002)

對懷菊中水溶性總多酚的超聲輔助提取工藝進行了優化。以水作提取劑,在單因素實驗的基礎上選擇超聲功率、超聲時間、液料比3個因素為自變量,以懷菊中總多酚的得率為響應值,進行中心組合設計(CCD),采用響應面法優化了懷菊總多酚的提取工藝。結果表明,超聲輔助提取懷菊中總多酚的最佳工藝條件為:超聲功率225 W,超聲處理時間為40 min,液料比23.5∶1(mL/g)。在此工藝條件下,總多酚的得率高達76.53 mg/g。該實驗結果能夠為懷菊中水溶性多酚提取工藝的進一步放大提供科學依據和理論參考。

懷菊,總多酚,響應面法,中心組合設計(CCD),超聲提取

花茶作為一種傳統飲品在我國已有兩千多年的歷史。近年來,隨著人們保健與養生意識的不斷增強,可作花茶飲用的各種天然藥食同源植物的花卉備受青睞。懷菊屬于白菊花的一種,為懷川四大懷藥之一,是我國著名的道地藥材,主產于河南焦作地區(武陟、溫縣、博愛一帶),具有散風清熱,平肝明目等功效,是極佳的藥用菊花[1]。懷菊的活性成分主要有黃酮類、多酚類、揮發油等[2-3],懷菊中黃酮類和揮發油的研究已有大量報道[4-7],但針對其水提多酚類物質的研究尚不多見。多酚是一類廣泛存在于植物體內的多元酚類化合物,屬于一種非營養性生物劑,是一種良好的抗氧化劑,對能引起生物組織膜因產生過氧化作用而導致結構和功能損傷的過氧自由基(RO2·)、羥自由基(OH·)等自由基有明顯的清除作用,在保護人體不受自由基所致的氧化損傷方面有著十分重要的作用[8-9]。懷菊的生物學效應與其所含的多酚類物質密切相關。

前人對中草藥藥效成分的提取多以乙醇作為提取劑[4,7,10-12],本文以水作提取劑旨在獲得懷菊中的水溶性多酚,可為進一步考察懷菊花茶的生理功能奠定基礎。另一方面,超聲波能引起空化等一系列的特殊效應,具有輔助萃取植物有效成分的功能,可有效提高萃取效率[13-14]。本文采用超聲輔助提取技術提取懷菊中的水溶性總多酚,并采用響應面法優化提取條件,旨在為懷菊的工業化深加工和質量控制提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

懷菊河南省焦作市懷達懷藥有限公司,105 ℃烘干后磨碎,置于干燥器中保存,備用;沒食子酸標準品大連美侖生物技術有限公司;福林酚、無水乙醇、無水碳酸鈉均為分析純。

VGT-2227QTD數控式超聲波萃取設備深圳固特宏業機械設備有限公司;HH-4型數顯恒溫水浴鍋江蘇省金壇市友聯儀器研究所;R-205型旋轉蒸發儀上海申順生物科技有限公司;BAO-80型精密鼓風干燥箱上海施都海儀器設備有限公司;Alpha-1101型可見分光光度計上海譜元儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1懷菊提取物的制備稱取5.0000 g懷菊粉末,按照20∶1(mL/g)的液料比加入去離子水后置于超聲萃取罐中提取30 min,取濾液再于12000 r/min條件下離心20 min,得澄清提取液。收集上清,旋轉蒸發至漸干,再以5 mL去離子水復溶。復溶后的樣品于真空冷凍干燥機中凍干后稱重,計算得率。所得樣品密封后置于-20 ℃保藏,備用。懷菊提取物得率(D)的計算公式如下:

1.2.2懷菊提取物中總多酚含量及得率的測定本文參照已有文獻[15],采用福林-酚法測定懷菊提取物中總多酚的含量。精確稱取沒食子酸標準品,配成2.0000 mg/mL的樣品母液,稀釋得到0.0125、0.0250、0.0500、0.1000、0.2000 mg/mL的系列濃度(Nki),再分別吸取1 mL稀釋后的樣品于25 mL棕色容量瓶中,加入2.5 mL配制好的福林-酚試劑和12 mL去離子水,放置1 min后,加入7.5%的Na2CO3溶液5 mL,定容后室溫下反應1 h。同時,用1 mL去離子水代替標準樣品作為空白對照,反應完成后在760 nm波長下測定各個吸光度(Aki),繪制標準曲線。稱取一定量粉末狀的懷菊提取物,配制成2.0000 mg/mL的待測樣品母液,測定時將樣品稀釋到0.2000 mg/mL,再吸取1 mL稀釋后的樣品于25 mL棕色容量瓶中,然后與按照標準溶液同樣的方法,在760 nm波長下測定其吸光度(As)。懷菊提取物中總多酚的沒食子酸當量濃度(Nd)按下式計算:

式中,0.2000表示被測樣品的終濃度為0.2000 mg/mL;1表示被測樣品的取樣量為1 mL;式中,Aki和Nki之間的關系可以通過建立回歸方程來確定。

該法制備懷菊中水溶性總多酚的得率可按下式計算:

總多酚得率(%)=Nd×D

式中,Nd表示懷菊提取物中總多酚的當量濃度;D表示懷菊提取物的得率。

1.2.3懷菊總多酚提取的單因素實驗

1.2.3.1超聲功率對懷菊總多酚得率的影響稱取5.0000 g懷菊粉末,按照25∶1(mL/g)的液料比加入去離子水,在超聲時間為60 min的條件下,分別選取50、150、250、350、450 W的超聲功率,按照方法1.2.1進行多酚提取,計算提取物中多酚的含量與得率,考查超聲功率對總多酚得率的影響。每份樣品做三個平行,測定結果取平均。

1.2.3.2超聲處理時間對懷菊總多酚得率的影響稱取5.0000 g懷菊粉末,按照25∶1(mL/g)的液料比加入去離子水,在超聲功率為250 W的條件下,分別選取20、40、60、80、100、120 min六個時間點來考查超聲處理時間對懷菊總酚得率的影響。按照方法1.2.1進行多酚提取,每份樣品做三個平行。

1.2.3.3液料比對懷菊總多酚得率的影響稱取5.0000 g懷菊粉末,在超聲功率200 W、超聲時間60 min的條件下,分別選取5∶1、15∶1、25∶1、35∶1、45∶1(mL/g)的液料比,按照方法1.2.1進行多酚提取。計算總多酚得率,考查液料比對懷菊總多酚得率的影響。每份樣品做三個平行,測定結果取平均。

1.2.4響應曲面法優化懷菊總多酚的超聲提取工藝在單因素實驗的基礎上,選取超聲功率、超聲提取時間和液料比三個因素為考查對象,應用Design export 7.0 數據處理軟件的Central Composite Design(CCD)工具設計實驗方案,實驗次數為20次,實驗設計的因素水平見表1。

表1　中心點法實驗設計的因素水平表Table 1　Corresponding actual values of the factors tested in central-composite design

注:alpha=1.68179。

1.3數據統計分析

本文所得數據均為平行測定3次以上取平均值,并計算出正負標準偏差,用誤差線表示。采用Design export 7.0 數據處理軟件對實驗結果進行處理,應用中心點法對各組變量的計算結果進行方差分析和差異顯著性分析,p<0.05表明分析結果的差異性顯著。

2　結果與討論

2.1總多酚測定的標準曲線

以沒食子酸標準液濃度為橫坐標,測得的吸光度為縱坐標,繪制標準曲線(圖1)。

圖1　多酚測定的標準曲線Fig.1　The standard curve of polyphenol content determine

由圖1可見,沒食子酸濃度在0.0125～0.2000 mg/mL的梯度范圍內,其濃度與吸光度具有良好的線性關系,所得回歸方程的R2值高達0.9995。因此,該方程準確有效,可用作樣品中多酚含量測定的工作曲線。

2.2懷菊總多酚超聲提取的單因素實驗

2.2.1超聲功率對懷菊總多酚得率的影響5種不同的超聲功率對懷菊總多酚得率的影響見圖2。

圖2　超聲功率對總多酚得率的影響Fig.2　Effect of ultrasound power on the yield of polyphenols

由圖2可見,懷菊中多酚的得率隨著超聲功率的增加先增大再減小。超聲功率為250 W時,總多酚的得率最大,但當功率增加到350 W以后,總多酚的得率不僅沒有增加反而略有降低。這可能是由于較大的超聲功率雖有利于加快植物組織中多酚的溶出,然而當功率增加到一定程度后,過大的超聲功率所引起的熱效應會造成組織蛋白變性,從而阻礙了多酚的溶出。所以,選擇250 W的超聲功率為佳。

2.2.2超聲處理時間對懷菊總多酚得率的影響6種不同的超聲處理時間對懷菊中總多酚得率的影響結果見圖3。

圖3　超聲時間對總多酚得率的影響Fig. 3　Effect of ultrasound time on the yield of polyphenols

由圖3可看出,懷菊中總多酚的得率隨著超聲提取時間的延長先增大再減小,這可能是由于超聲時間越長,對植物組織的破壞力越大,越利于多酚的溶出。然而,當超聲時間增加到60 min后,總多酚的提取得率反而開始下降,這可能是由于超聲時間過長,使得提取液的溫度升高過多,一方面物料受熱不利于植物組織中多酚的溶出,另一方面也可使溶出的多酚類化合物因高溫下長時間作用而被破壞。本文選擇40 min作為最佳的提取時間。

2.2.3液料比對懷菊中總多酚得率的影響考查5種不同的液料比對懷菊總多酚提取得率的影響,結果見圖4。

圖4　液料比對總多酚得率的影響Fig.4　Effect of liquid-to-solid rate on the yield of polyphenols

由圖4可見,當液料比小于25∶1(mL/g)時,懷菊中總多酚的提取得率隨著液料比的增大而增大,但當液料比超過25∶1(mL/g)后,總多酚的得率不再隨液料比的增加而增大。由于生產中使用的提取劑后期處理與回收均較為繁雜,高的液料比勢必增加后期處理的負擔,所以液料比的選擇也不宜過高,25∶1(mL/g)是較好的選擇。

2.3超聲輔助提取懷菊中總多酚的工藝優化

根據單因素實驗結果,對選取的3個影響因子(超聲功率、超聲處理時間和液料比)分別從5個水平(-alpha,-1,0,1,+alpha)進行考查,應用Design Export設計軟件的中心組合設計(CCD)方法,得出20組實驗的設計方案,按照各組實驗給定的工藝條件進行懷菊總多酚的提取,計算總多酚得率,結果見表2。以總多酚得率為考查依據,建立響應曲面模型,并對所建立的模型進行顯著性分析,結果見表3。

利用Design Export 7.0.0軟件對實驗結果進行分析,可以得到總多酚得率的擬合一階模型,其回歸方程:Y=72.32+4.51A+2.93B+2.45C+0.46AB-1.48AC-1.29BC-3.15A2-3.69B2-1.28C2,R2=0.9459。說明該模型能夠很好地擬合各因素組合對多酚提取得率的影響。

由表3可見,所建立模型的F值為19.41,p值小于0.0001,表明該模型極顯著。由各項的p值可以看出,該模型中,A,B,C,A2,B2,均為極顯著項(p<0.01),AC,AB,BC為不顯著項(p>0.05)。失擬項的p值為0.8215,大于0.05,表明失擬項所帶來的絕對偏差不顯著,這表明所建立的模型是切實有效的。用響應曲面的3D圖來反映各因素兩兩之間的交互作用,結果見圖5～圖7。

表2　懷菊總多酚的超聲輔助提取工藝條件優化的 實驗方案及結果Table 2　Experiment design of optimizing the total polyphenol extraction process conditions

表3　中心點法實驗設計的 多元回歸模型系數評估及其顯著性檢驗Table 3　Regression coefficients estimation and their significance test for the quadratic polynomial model of CCD

注:*p<0.05,差異顯著;**p<0.01,差異極顯著。

圖5　超聲時間和超聲功率 對總多酚得率影響的響應曲面圖Fig.5　Response surface plots showing the effect of ultrasound time and power affected yield of polyphenol

圖6　液料比和超聲功率對總多酚得率影響的響應曲面圖Fig.6　Response surface plots showing the effect of liquid-to-solid and power affected yield of polyphenol

圖7　液料比和超聲時間對總多酚得率影響的響應曲面圖Fig.7　Response surface plots and contours showing the effect of liquid-to-solid and ultrasound time affected yield of polyphenol

通常情況下,響應曲面的等高線圖中等高線的形狀能夠直觀地反映出兩因素交互作用的強弱[16]。一般而言,等高線呈橢圓形表示兩因素的交互作用是顯著的,橢圓的兩焦距越大表明越顯著,焦距越小則越不顯著。若橢圓形的焦距為零,則等高線呈正圓形,表明兩因素之間沒有交互作用,或交互作用不顯著,可以忽略不計[17]。由圖5～圖7可見,超聲功率和超聲提取時間之間交互作用的等高線最趨于正圓形,表明二者之間無明顯交互作用。

在以上數據分析的基礎上,運用Design Export 7.0.0軟件的Point Prediction工具預測結果得出,以水作提取劑,懷菊總多酚提取的最優工藝條件為:超聲功率為225 W,超聲處理時間為40 min,液料比23.5∶1(mL/g),預測該工藝條件下的平均得率為77.55 mg/g。

2.4模型的驗證

根據模型預測結果進行近似驗證實驗,工藝條件為:超聲功率為225 W、超聲處理時間為40 min、液料比23.5∶1(mL/g),測得總多酚的得率為76.53 mg/g,與回歸方程所得預測值77.55 mg/g的誤差為1.31%。這表明該回歸方程能夠真實地反映各因素對水溶性懷菊總多酚得率的影響,也表明響應面法可用于該提取工藝的研究。

3　結論

響應面分析法可用于超聲輔助水提懷菊中總多酚的工藝條件研究,在單因素實驗的基礎上,采用中心組合實驗設計(CCD)對提取工藝進行優化,并利用統計學方法對該模型進行了顯著性檢驗,優化了內在因素水平,探討了各因素間的交互作用,并對實驗結果進行數學模擬和預測,從而以最經濟的方式高效、準確地得到優化條件。優化后的工藝條件為:超聲功率為225 W,超聲處理時間為40 min,液料比23.5∶1(mL/g)。在此工藝條件下,總多酚的得率為76.53 mg/g。該實驗結果能夠為懷菊中水溶性多酚提取工藝的進一步放大提供科學依據和理論參考,具有一定的理論價值和實際應用前景。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction of total polyphenols from huai chrysanthemum by response surface analysis

FAN Yan-ge1,2,ZHANG Juan-mei1,*,HUANG Zuo-hua2

(1.Pharmaceutical College of Henan University,Kaifeng 475004,China;2. Institute of Chemistry Co. Ltd.,Henan Academy of Sciences,Zhengzhou 450002,China)

Response surface methodology was applied to optimize ultrasonic-assisted extraction process of total polyphenols from huai chrysanthemum based on single experiments. Ultrasonic power,extraction times and ratio of solid and liquid were selected for central composite design(CCD). The response surface method was used to optimize the huai chrysanthemum the extraction process of total polyphenols. The results indicated that the optimal process conditions were as followings:ultrasonic power was 225 W,extraction time was 40 min,the ratio of liquid and solid was 23.5∶1(mL/g). Under these optimized conditions,the yield of total polyphenols was up to 76.53 mg/g. These researches provided some useful and valid reference for the further study of huai chrysanthemum.

huai chrysanthemum;total polyphenols;response surface methodology;central composite design(CCD);ultrasonic extraction

2015-08-07

樊燕鴿(1979-),女,碩士研究生,助理研究員,研究方向:天然產物與藥物化學,E-mail:fblues@163.com。

張娟梅(1981-),女,博士,講師,研究方向:食品營養與安全,E-mail:zjmwrn@163.com。

TS201.2

B

1002-0306(2016)05-0268-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.044