菊花蜂花粉多糖的分離純化及抗腫瘤活性研究

王　博，張夢珊，張中玉，李珊珊1,,*

(1.中國農業科學院 特產研究所,吉林長春 130112;2.北華大學 化學與生物學院,吉林吉林 132013;3.東北師范大學生命科學學院,吉林長春 130024)

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菊花蜂花粉多糖的分離純化及抗腫瘤活性研究

王博1,2,3，張夢珊3，張中玉3，李珊珊1,3,*

(1.中國農業科學院 特產研究所,吉林長春 130112;2.北華大學 化學與生物學院,吉林吉林 132013;3.東北師范大學生命科學學院,吉林長春 130024)

本文對蜂花粉多糖進行了分離純化和組成分析,并初步分析了各多糖級分對腫瘤細胞增殖的抑制作用。選取菊花蜂花粉為原料,通過水提、醇沉得到總多糖WDPP,再通過離子交換層析得到一個中性糖(WDPP-N)和兩個酸性糖級分(WDPP-1,WDPP-2)。通過高效液相色譜法測定各級分的單糖組成,通過對腫瘤細胞增殖作用的影響探討各級分的抗腫瘤活性。結果表明,WDPP-N主要由半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖組成,比例為30.3∶31.6∶32.7;WDPP-1和WDPP-2都主要由半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖組成,還含有少量的鼠李糖、葡萄糖等。WDPP-N和WDPP-2濃度為5 mg/mL時對腫瘤細胞HCT116增殖的抑制率分別為38%和32%,對HT-29增殖的抑制率為42%和47%,WDPP-1對腫瘤細胞增殖作用的影響不顯著(p>0.05),而WDPP在濃度為5 mg/mL時對HCT116和HT-29腫瘤細胞增殖的抑制率分別為61%和81%。因此,菊花蜂花粉總多糖WDPP抑制腫瘤細胞增殖的活性優于中性糖和酸性糖。

菊花蜂花粉,多糖,分離純化,抗腫瘤活性

蜂花粉是天然的保健食品與藥品原料,作為純天然無污染的產品,其保健功能越來越被人們所青睞。《神農本草經》和《本草綱目》中均有對花粉的保健治療作用的記載。花粉的成分主要包括蛋白質、糖類、脂質、維生素、酚類、微量元素、生長素等[1],這些成分的種類和含量與植物來源及采收季節均有關系。荷花蜂花粉、菊花蜂花粉、五味子蜂花粉等市面上常見蜂花粉所含營養成分大致是:蛋白質20%～25%,碳水化合物40%～50%,脂肪5%～10%,礦物質2%～3%,木質素10%～15%,未知物質10%～15%[2]。多糖作為蜂花粉中重要的活性成分,具有多種生物學活性和藥理作用。國內外對蜂花粉多糖的結構和活性的報道較少。山楂蜂花粉多糖能夠激活巨噬細胞的吞噬活動,增強人體綜合免疫功能[3];梯牧草蜂花粉多糖[4]含有20%的阿拉伯半乳聚糖蛋白,能夠刺激機體的免疫應答反應;油菜蜂花粉多糖[5]能夠顯著抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長率,并可提高小鼠免疫力。除此之外,蜂花粉多糖還有抗衰老、美容、防治腦心血管疾病、減肥、調節腸胃功能、保肝護肝、調節神經系統等多種功效,對貧血、糖尿病、改善記憶力、更年期障礙等也有較好效果[6]。現有相關文獻中,對蜂花粉多糖分離純化的報道較少,缺乏系統的分析,針對上述問題設計了本文的研究內容。

本文選取菊花蜂花粉為原料,對多糖成分進行了提取和純化,共得到一種菊花蜂花粉中性糖和兩種酸性糖級分,對各級分的單糖組成和對腫瘤細胞增殖作用的影響進行了分析,探討了不同的多糖級分在組成和抗腫瘤活性等方面的差異。本文的結果可以為蜂花粉多糖的應用提供數據基礎和理論依據,也為菊花蜂花粉多糖的下一步研究提供了指導。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菊花蜂花粉中國農業科學院飼料研究所;人結直腸癌細胞株HCT116、人大腸癌細胞株HT29中國醫學科學院基礎醫學研究所;單糖標準品Sigma-Aldrich公司;其它試劑均為國產分析純。

恒流蠕動泵BT01-100保定蘭格恒流泵有限公司;自動部分收集器BS-100A上海滬西分析儀器廠;低速臺式離心機2-6KLSigma-Aldrich公司;CO2細胞培養箱MCO-15AC日本三洋儀器公司。

高效液相色譜儀及色譜柱:紫外檢測器SPD-10Avp日本島津儀器有限公司;溶劑輸送泵,LC-10ATvp日本島津儀器有限公司;柱溫箱AT-330天津奧特賽恩斯儀器有限公司;色譜柱Shim-pack VP-ODS日本島津儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菊花蜂花粉總多糖的提取向干燥的菊花蜂花粉(500 g)中加入8 L蒸餾水,浸泡過夜,100 ℃提取4 h,離心(4500 r/min,10 min)。沉淀加入8 L蒸餾水重復提取兩次。合并三次提取所得濾液,60～80 ℃水浴濃縮至800 mL,離心(4500 r/min,10 min),棄去沉淀。向上清液加入4倍量無水乙醇,沉淀過夜。離心(4500 r/min,10 min),收集沉淀。向沉淀中加入800 mL蒸餾水,充分溶解,加入4倍量無水乙醇再次醇沉。依次用300 mL 95%乙醇、300 mL無水乙醇、100 mL乙醚洗滌。將沉淀置于有五氧化二磷的真空干燥器中,真空干燥24 h,得粉末狀菊花蜂花粉總多糖(WDPP,Water-soluble Dendranthema indicum bee Pollen Polysaccharides)。

1.2.2蜂花粉多糖的分離純化DEAE-纖維素分別用酸堿進行預處理后,裝柱,依次用3倍柱體積的蒸餾水、2倍柱體積的2 mol/L NaCl和2倍柱體積的蒸餾水進行平衡,平衡流速為15 cm/h。

取10 g菊花蜂花粉多糖WDPP溶于100 mL蒸餾水中,離心后上樣于平衡好的DEAE-纖維素離子交換層析柱(8.0 cm×20 cm,Cl-型),依次用2 L蒸餾水、0.2、0.4 mol/L NaCl水溶液洗脫,流速12.5 mL/min,每燒杯收集50 mL洗脫液,苯酚-硫酸法檢測洗脫液中總糖含量分布[7],間羥基聯苯法測定洗脫液中糖醛酸含量分布[8]。分別收集不同的洗脫峰,除鹽后減壓凍干,分別獲得蒸餾水洗脫組分WDPP-N和0.2 mol/LNaCl溶液洗脫組分WDPP-1、0.4 mol/L NaCl溶液洗脫組分WDPP-2。

1.2.3理化性質測定采用苯酚-硫酸法測定總糖含量,間羥基聯苯法測定糖醛酸的含量。

單糖組成分析[9]:稱取多糖樣品2 mg,依次用1 mL 1 mol/L鹽酸-甲醇溶液和1 mL 2 mol/L三氟乙酸水解,PMP衍生化后,濾膜過濾,加入適量蒸餾水稀釋,HPLC檢測。取單糖標準品作為對照,根據出峰時間和峰面積判斷待測樣品單糖組成類型和比例。采用Shimadzu HPLC系統(LC-10ATvp泵和SPD-10AVD紫外可見光檢測器),DIKMA Inertsil ODS-3色譜柱(4.6 mm× 150 mm),流動相為82.0% 0.1 mol/L PBS和18.0%乙腈(v/v),流速為1.0 mL/min,進樣量為20 μL,檢測波長為245 nm。

1.2.4MTT法檢測菊花蜂花粉多糖各級分對腫瘤細胞體外增殖活性的影響將處于對數生長期的HCT116細胞和HT29細胞傳代后,細胞密度調為2×105個/mL。向96孔板中加入50 μL細胞液,5% CO2細胞培養箱中37 ℃培養24 h。去除原培養基,加入多糖溶液,終濃度分別為0.5、2、5 mg/mL。72 h后,加入MTT染色液培養4 h,吸去上清,加入DMSO,避光振蕩10 min。酶標儀檢測波長為570 nm處的光吸收值,計算細胞存活率[6]。

對所得數據進行分析統計,計算均值及SD值,并用SPSS 12.0進行分析,當p<0.01時,表示實驗組與對照組差異極其顯著,當p<0.05時,實驗組與對照組有顯著性差異。

2　結果與討論

2.1菊花蜂花粉總多糖的提取和分離純化

500 g干燥的菊花蜂花粉經熱水煮提,4倍體積乙醇沉淀,常規干燥,共得到39.5 g菊花蜂花粉總多糖(WDPP),收率為7.9%。WDPP主要由鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)及阿拉伯糖(Ara)組成(表1),還含有少量的葡萄糖醛酸(GlcA)和甘露糖(Man)。其中,半乳糖和阿拉伯糖是總多糖的主要組成成分。

通過DEAE-纖維素柱層析,對WDPP進行純化,共得到一個中性糖級分WDPP-N和兩個酸性糖級分WDPP-1、WDPP-2。其洗脫圖如圖1所示。

圖1　WDPP經DEAE-纖維素柱層析洗脫后 總糖和糖醛酸分布曲線圖Fig.1　Distribution of total carbohydrate and uronic acid of WDPP on DEAE-Cellulose column

通過DEAE-Cellulose分離純化,共得到一種菊花蜂花粉中性糖WDPP-N及兩種菊花蜂花粉酸性糖WDPP-1、WDPP-2。

中性糖WDPP-N收率為32.8%,淡黃色粉末。主要由Gal、Ara和Glc組成,比例為30.3∶31.6∶32.7,約為1∶1∶1。推測其含有阿拉伯半乳聚糖和葡聚糖。同時,中性糖中還含有少量的Man。

WDPP-1主要由Rha(3.4%)、GalA(9.3%)、Gal(38.6%)和Ara(37.1%)組成。Rha和GalA的比例約為1∶3,符合文獻中對RG-I型果膠的定義[10-11],具有少量的RG-I和HG結構域。Gal和Ara比例約為1∶1,總量達到75%以上,推測其中含有大量的阿拉伯半乳聚糖片段。

表1　菊花蜂花粉多糖各級分收率及組成分析Table 1　Yield and monosaccharide composition of polysaccharides from bee pollen of Dendranthema indicum

注:a多糖產量與蜂花粉干物質的百分比;b該級分與上樣量的百分比。

WDPP-2主要由Rha(10.2%)、GalA(30.4%)、Gal(16.0%)和Ara(40.7%)組成。Rha與GalA的比例約為1∶3,含有大量的RG-I型和HG果膠。Ara含量較高,推測存在大量的阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖。

菊花蜂花粉中的兩種酸性糖主要由Rha、GalA、Gal和Ara組成,并隨著洗脫液鹽濃度的增加,組成呈現規律性的變化。當洗脫液的鹽濃度較小時,洗脫下來的酸性糖中鼠李糖和半乳糖醛酸比例較小,同時阿拉伯糖和半乳糖比例為1∶1。當鹽濃度增大時,鼠李糖和半乳糖醛酸含量逐漸增高,同時阿拉伯糖比例上升,半乳糖比例下降。總體來說,兩種菊花蜂花粉酸性糖級分都是含有阿拉伯半乳聚糖片段的RG-I型果膠,同時有少量HG結構域存在。

2.2菊花蜂花粉多糖對腫瘤細胞增殖活性的影響

菊花蜂花粉多糖對HCT116腫瘤細胞體外增殖活性的影響如圖2所示。低濃度時,各級分對腫瘤細胞的抑制活性不明顯,高濃度時抑制活性顯著。WDPP的對HCT116腫瘤細胞的抑制活性高于中性糖及酸性糖級分。

圖2　菊花蜂花粉多糖對HCT116腫瘤細胞增殖的影響Fig.2　Anti-proliferative effects of bee pollen polysaccharides from Dendranthema indicum on HCT116 cells注:*p<0.05差異顯著,**p<0.01差異極顯著。

菊花蜂花粉多糖對HT-29細胞的體外增殖活性影響如圖3所示。WDPP、WDPP-N和WDPP-2對腫瘤細胞的抑制活性隨濃度增加而增強,具有一定的濃度依賴性。WDPP濃度為5 mg/mL時腫瘤細胞存活率低于20%,抑制作用明顯強于其它級分。

圖3　菊花蜂花粉多糖對HT-29腫瘤細胞增殖的影響Fig.3　Anti-proliferative effects of bee pollen polysaccharides from Dendranthema indicum on HT-29 cells注:*p<0.05差異顯著,**p<0.01差異極顯著。

3　結論與討論

目前關于多糖的結構、性能和活性研究越來越深入,在食品工業中的應用也越來越廣泛[12]。多糖結構復雜,活性多樣。不同結構的多糖具有不同的生物活性。本研究所得到的菊花蜂花粉總多糖主要由Ara(37.8%)、Gal(27.7%)、Glc(17.2%)和GalA(6.0%)組成。通過DEAE-Cellulose分離純化,將菊花蜂花粉總多糖分離為幾種不同類型的級分。WDPP-N主要由Gal(30.3%)、Ara(31.6%)和Glc(32.7%)組成,WDPP-1主要由Rha(3.4%)、GalA(9.3%)、Gal(38.6%)和Ara(37.1%)組成,WDPP-2主要由Rha(10.2%)、GalA(30.4%)、Gal(16.0%)和Ara(40.7%)組成。體外抗腫瘤活性結果表明,菊花蜂花粉總多糖在濃度為5 mg/mL時能夠顯著抑制HCT116和HT-29腫瘤細胞的增殖,抑制率分別為61%和81%,活性優于中性糖和酸性糖級分。本論文的研究結果能夠為菊花蜂花粉有效活性成分的研究奠定基礎,為蜂花粉多糖的應用提供一定的理論指導和依據,也可以為其它類型蜂花粉多糖的研究提供一定的思路。

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Study on extraction,purification and antitumor activity of polysaccharide from bee pollen ofDendranthemaindicum

WANG Bo1,2,3,ZHANG Meng-shan3,ZHANG Zhong-yu3,LI Shan-shan1,3,*

(1.Institute of Special Animal and Plant Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130012,China;2.College of Chemistry and Biology,Beihua University,Jilin 132013，China;3.School of Life Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130024,China)

The purification procedures,physiochemical features and antitumor activity of polysaccharide fractions from bee pollen ofDendranthemaindicumwere studied in this paper. Polysaccharide fractions(WDPP)was dealed with water-extraction,ethnol-precipetation and ion-exchange chromatography,then one netral(WDPP-N)and two acidic fractions(WDPP-1,WDPP-2)were obtained. The monosaccharide composition was tested through HPLC,the antitumor activity of all fractions were investigated by MTT method. WDPP-N was composed of galactose,arabinose,and glucose with a ratio of 30.3∶31.6∶32.7;WDPP-1 and WDPP-2 were mainly composed by galacturonic acid,galactose and arabinose,rhamose and glucose as small proportion. Total polysaccharide had obvious inhibition effect on HT-29 and HCT116 tumor cells in high concentration compared with neutral and acidic fractions.

bee pollen ofDendranthemaindicum;polysaccharide;extraction and purification;antitumor activity

2015-08-27

王博(1978-),女,博士研究生,講師,研究方向:天然產物的結構和功能,E-mail:shanshanli123456@163.com。

李珊珊(1984-),女,博士研究生,助理研究員,研究方向:糖復合物的結構與功能,Email:lishanshan@caas.cn。

TS201.2

A

1002-0306(2016)05-0358-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.064