牛乳過敏原及加工技術對其致敏性的影響

譚　夢,華家才,馮鳳琴,2,3

(1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310058;2.馥莉食品研究院,浙江杭州 310058;3.浙江省農產品加工技術研究重點實驗室,浙江杭州 310058)

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牛乳過敏原及加工技術對其致敏性的影響

譚夢1,華家才1,馮鳳琴1,2,3

(1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310058;2.馥莉食品研究院,浙江杭州 310058;3.浙江省農產品加工技術研究重點實驗室,浙江杭州 310058)

對嬰幼兒來說,牛乳營養豐富,是母乳最好的替代品,但牛乳中的蛋白質可能會引起過敏。牛乳中的主要過敏原是酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。本文從牛乳過敏原的結構和抗原表位、熱處理、發酵和酶處理等不同的加工技術對牛乳蛋白致敏性的影響和過敏原標記檢測方法三個方面進行了綜述,為開發低致敏牛乳制品提供借鑒。

牛乳過敏原,加工技術,檢測

食物過敏是各國政府和公眾廣泛關注的食品安全問題之一。據統計,全球有2.2～2.5億人對食物過敏[1]。聯合國糧農組織劃定,牛奶、雞蛋、魚、甲殼動物或者貝類、花生、大豆、堅果和小麥為最常見的八類過敏食物[2]。牛乳含有3.3%～3.5%的蛋白質,營養豐富,是母乳最好的替代品,但牛乳中的蛋白質可能會引起過敏反應。對嬰幼兒來說,牛乳過敏是最常見的過敏疾病,發病率高達2%～7.5%[3]。牛乳過敏嚴重影響了嬰幼兒的生長發育,甚至威脅其生命。因此,系統研究牛乳過敏原種類、結構,尋求減輕牛乳過敏的新技術和過敏原的標記檢測方法,對我國開發低致敏牛乳制品具有深遠的理論和實踐意義。

1　牛乳過敏原蛋白的組成和特征

牛乳過敏是牛乳過敏原蛋白所引發的食物不良反應,主要是IgE介導的由免疫機制調節的變態反應。牛乳和人乳在蛋白組成上存在一定差異(見表1),牛乳含有人乳中并不存在的α-酪蛋白及β-乳球蛋白,其次α-乳白蛋白和免疫球蛋白的含量也較少,這導致嬰幼兒配方奶粉中需要脫除某些蛋白或者調整不同蛋白比例以模擬人乳組成。

研究表明,牛乳中最主要的過敏原是酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白[5]。這些蛋白都含有可以被免疫系統識別的抗原表位,包括構象表位和線性表位。構象表位的活性依賴于構象,線性表位則是依賴于氨基酸序列的一級結構。目前,已有很多學者通過化學法或酶法切割、肽文庫技術和肽掃描技術進行了過敏原表位定位(見表2)。酪蛋白是牛乳中最主要的蛋白質,占總蛋白的80%左右,分為αS1-,αS2-,β-,κ-酪蛋白,大部分對酪蛋白過敏的患者對這四種酪蛋白均過敏。大部分酪蛋白以膠束形式存在,具有柔性和熱穩定性。β-乳球蛋白占總蛋白的10%,不存在于人乳中,由于其耐胃酸和胃蛋白酶消化,因此可通過腸道進入血液循環,約有82%的牛乳過敏患者對β-乳球蛋白過敏。牛乳α-乳白蛋白與人乳α-乳白蛋白有74%的氨基酸同源,但是仍是一種主要過敏原,這說明其致敏性可能主要依賴于構象表位。

表1　牛乳和人乳的蛋白組成[4]Table 1　The main composition of cow’s milk and human milk[4]

表2　牛乳中主要過敏蛋白的性質和結構特征[6-8]Table 2　The characteristics and structure of major allergens in cow’s milk[6-8]

2　加工技術對牛乳致敏性的影響

牛乳及其制品需通過一定的加工處理,以確保其微生物安全性,提高風味和質地,雖然充分了解過敏原的結構特點有助于研究其致敏性,但在食品加工過程中蛋白質結構會發生變化,繼而引起其致敏性強弱改變,故研究加工技術對其致敏性的影響更具現實意義和指導作用。

2.1熱處理

熱處理是牛乳及其制品加工保藏過程最常用的方法。針對牛乳常見的熱處理方式為高溫短時巴氏殺菌和超高溫瞬時殺菌,不同的熱處理方式對于牛乳蛋白致敏性影響不盡相同,加熱可以誘導過敏原蛋白構象發生變化,一方面可能會導致蛋白質失活聚集,掩蔽抗原表位,降低致敏性;另一方面,可能會引起蛋白質結構舒展開來,使得內部掩蓋的抗原表位暴露,增強其致敏性。這取決于處理方法的強弱和不同蛋白的熱敏性強弱。Rytk?nen等[9]發現,在大鼠中的胃腸道粘膜反應上,熱變性β-乳球蛋白(90 ℃ 30 min)較不經熱處理組會誘發更密集的免疫反應。Bu[10]等在不同溫度條件下分別加熱乳清分離蛋白20 min后,測定其抗原性,結果發現當加熱溫度為50～90 ℃時,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性增加,但是當溫度高于90 ℃時,兩種蛋白質的抗原性均顯著下降。Mehr[11]等研究了完全避免攝入牛乳的過敏患者對強加熱牛乳的口服耐受性,參與實驗的70名兒童中有51名(73%)兒童可以忍受強加熱的牛乳,19名(27%)出現了不同程度的反應。

熱處理時,乳蛋白除了自身結構會舒展或相互聚集外,還會和牛乳制品中的還原糖(如乳糖)發生美拉德反應。美拉德反應使得牛乳蛋白的α或ε-氨基與還原糖中的羰基以共價鍵相連,形成蛋白質-糖共價復合物,這不僅可以改善蛋白質的功能特性,如乳化性、溶解性、起泡性、成膜性等,而且被引入糖分子的空間位阻和電荷作用可以修飾蛋白的抗原表位,降低其致敏性。Wu等人[12]研究了β-乳球蛋白與低聚果糖,低聚半乳糖和低聚異麥芽糖的美拉德反應,通過ELISA法分析反應前后β-乳球蛋白與IgE和IgG結合能力發現,β-乳球蛋白與這些功能性低聚糖的美拉德反應產物均能顯著降低其抗原性。Enomoto等[13]利用干熱法,將麥芽五糖結合到α-乳白蛋白上降低了其抗原性。美拉德反應降低牛乳致敏性與反應條件和反應程度有關。乳清分離蛋白與葡萄糖的美拉德反應結果顯示,不同的反應底物質量比(0.17～7.83)、溫度(40～60 ℃)和時間(24～120 h)條件下,β-乳球蛋白的抗原性下降從42%～96%不等[14]。值得注意的是,美拉德反應容易造成堿性氨基酸的損失,副產物丙烯酰胺等也會對人體健康產生不利影響[15],用于低敏性嬰幼兒奶粉中需考慮其營養性和安全性。

表3　降低牛乳致敏性的發酵菌種Table 3　The strains which can reduce cow’s milk allergenicity

熱處理改變牛乳致敏性受很多因素如牛乳組成、加工條件和消費者個體差異等的影響,開發低過敏性乳制品,需要控制熱處理條件,避免引起抗原性增強的情況發生。

2.2發酵

在食品工業中,發酵是一種傳統的加工技術。發酵的牛乳制品除了具有生物活性、減少腸道致病菌的功能外,還能調節免疫力,減少過敏癥狀。牛乳經過發酵后,其抗原性會大大降低,其原因可能有兩種,一是乳酸菌具有復雜的蛋白酶系,發酵過程中產生的蛋白酶、肽酶使得牛乳蛋白分解成肽和氨基酸,破壞了一些抗原表位,從而降低其致敏性,二是乳酸菌本身具有調節免疫系統的作用,能促進I型和II型干擾素的產生,降低炎癥性細胞因子IL-4 和IL-5的分泌[16],從而起到降低過敏的效果。

1999年,Wroblewska[17]對滅菌乳采用嗜溫和嗜熱乳酸菌發酵,凝乳后用兔多克隆抗體間接競爭ELISA法測定上清液中乳清蛋白的殘余抗原性,發現發酵后乳清蛋白的抗原性比生牛乳降低了99%以上。在此之后,眾多學者發現乳酸菌發酵可以有效降低α-乳白蛋白,β-乳球蛋白,酪蛋白的抗原性(見表3),且不同乳酸菌混合發酵具有協同效果[18]。然而,發酵過程中牛乳蛋白抗原性的變化取決于發酵菌種和條件,Ehn等[19]研究發現,乳酸菌發酵牛乳后,雖然色譜顯示降解了β-乳球蛋白,但并不能顯著降低其IgE的結合能力,這說明在某些條件下乳酸菌蛋白酶并不能完全破壞過敏蛋白上IgE的結合表位,或者是使得內部表位暴露更易與抗體發生反應。

2.3酶處理

隨著食品酶制劑的快速發展,蛋白水解酶已經廣泛用于處理各類過敏原,降低其致敏性。蛋白酶能夠水解大分子的蛋白質生成小分子肽和氨基酸,破壞一些引起過敏反應的空間表位和線性表位,使得致敏性降低。目前研究較多的酶主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶等。Prakash等[27]用中性蛋白酶水解酪蛋白,體外間接ELISA結果顯示,當水解度為5%時,抗原性降低了70%～80%。在小鼠模型中發現,飼喂胰蛋白酶乳清蛋白水解物組較完整乳清蛋白組,小鼠血漿中具有顯著低的特異性IgE含量和組胺水平,且IL-4 和IL-5 的分泌量也顯著降低,這說明酶水解可以降低乳清蛋白致敏性[28]。單一種類的酶具有水解位點局限性,多種酶的復配使用不僅能夠更好的降低牛乳蛋白抗原性,還能減少苦味的生成[29]。酶水解具有條件溫和、高效性、節約能源等優點,丹麥Arla和新西蘭Fonterra等公司已開發出不同程度的水解乳清蛋白產品,為低敏嬰幼兒配方奶粉提供了原料。雖然水解產品抗原性顯著降低,但并不能完全消除。不同的水解模型和水解度可能會導致肽組成和口感上的差異,水解過程中各產物對其致敏性與風味的影響機理,還需要進一步的研究。

2.4其他加工技術

近年來,一些對食品風味和營養影響較小的非熱物理加工方法越來越受到重視。高壓、輻照、微波、高強度超聲波等加工方式可能使得蛋白內部結構展開或者氫鍵斷裂、蛋白聚合、抗原表位掩蓋或者暴露,從而改變牛乳致敏性。Kleber[30]在不同溫度下,用200～600 MPa處理β-乳球蛋白,間接競爭ELISA法測定其抗原性,結果表明高壓處理增強了β-乳球蛋白的抗原性,可能是非共價鍵的作用力使得蛋白結構展開,更容易與抗體結合。輻射作為一種殺菌技術,也可改變過敏蛋白的分子結構,掩蓋抗原表位,從而降低乳蛋白的過敏性[31]。Lee等[32]發現了牛乳中α-酪蛋白和β-乳球蛋白經γ射線照射后,用過敏患者血清進行ELISA實驗,結果兩種蛋白抗原性均降低,可能是γ射線照射改變了抗原表位的結構。

3　過敏原的標記和檢測

3.1過敏原的標記

食物過敏還沒有有效的治療方法。過敏患者需嚴格規避含有過敏原的食物和配料。因此,過敏患者選擇食品很大程度上依賴于準確的過敏原標簽和公開的配料信息。一些國家已經提出過敏原標簽的立法。2004,美國頒布了食物過敏原標簽和消費者保護法案,要求除美國農業部管轄的肉制品、禽肉制品和蛋制品外,所有在美國銷售的包裝食品必須標明8類過敏食物加工原料。2008年,歐盟要求所有導致過敏或不良反應的成分都必須標識。我國對食物過敏原的研究和關注相對落后,2012年4月實施的《GB 7718-2011 食品安全國家標準預包裝食品標簽通則》對八類致敏食物的標簽提出規范性要求,但屬于推薦標示內容。該規定已是我國預包裝食品標簽過敏原標識的極大進步,推動了食品產品信息向公開化的方向發展。目前絕大多數規定只適用于原配料有意添加的情況,并未定義過敏原的閾值,也未對食品行業如何針對過敏原交叉反應提供指導建議。

3.2過敏原的檢測

高效、準確的檢測過敏原含量是保證過敏原標簽標示制度順利實施的條件之一。酶聯免疫吸附技術(ELISA)[2]因其靈敏度高、快速方便且不需要昂貴的儀器等優點,是多個國家推薦的過敏原檢測方法,常用于食品安全和臨床檢驗等領域,可以定性和定量分析過敏原。鄧小芳[33]自制相應的單克隆抗體及多克隆抗體牛奶過敏原的雙抗體夾心ELISA檢測方法,酪蛋白檢測限可以達到0.55 ng/mL。隨著試劑生產技術的發展,檢測食物過敏原的商業試劑盒應運而生,極大的方便了過敏原的定量檢測。2008年3月實施的《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準SN/T 1961.1-2007》中將ELISA法運用于花生過敏成分的檢測上。但是,關于牛乳過敏原檢測方法的標準還未出臺。ELISA法的局限性主要是基質成分的交叉反應性和動物抗體抗原表位無法真正地反映過敏患者抗原表位,且一次只能檢測一種過敏原。在實際情況下,過敏原種類繁多,再加之交叉污染的存在,如何快速、準確、高通量地檢測出食物中的過敏原成為該領域需重點關注的問題。

4　展望

牛乳營養價值高,是嬰兒的主要食物來源,但是可能會導致嬰幼兒過敏,嚴重影響了其生長發育。在中國,治療嬰幼兒過敏患者采用的手段都是暫時的避免牛乳制品的攝入,容易造成嬰幼兒營養不良。因此,開發低敏性牛乳制品是解決牛乳過敏問題的有效途徑。目前,關于牛乳過敏原表位方面的研究已經取得一些成績,但是酪蛋白的T細胞表位定位,乳鐵蛋白線性表位定位等尚未解決,需要對其過敏原抗原表位進行更為系統的研究,從而為開發低致敏牛乳制品提供理論依據。通過控制處理條件,一些加工技術已經可以有效降低牛乳蛋白的致敏性,但是加工過程中可能引起新的抗原表位的暴露,某些加工副產物的安全性需要進行評估。另外,大多數過敏原和殘余抗原性的測定來源于體外ELISA法,需要結合生物信息學、免疫血清學、動物或者細胞致敏模型的建立等多種手段開展多級評價模式,得到更加全面準確的結果。

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Cow’s milk allergen and effects of processing technology on its allergenicity

TAN Meng1,HUA Jia-cai1,FENG Feng-qin1,2,3

(1.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.Fuli Institute of Food Science,Hangzhou 310058,China;3.Zhejiang Key Laboratory for Agro-Food Processing,Hangzhou 310058,China)

Cow’s milk has rich nutrition and it is the best substitute for breast milk. However,its protein may cause allergy. The major allergen is casein,β-lactoglobulin andα-lactalbumin. This paper firstly illustrated the structure and epitope of cow’s milk major allergen,and then discussed the effects of milk processing technology including heat treatment,fermentation and enzymatic hydrolysis on its allergenicity,and finally introduced the labeling and detection methods of allergen,which can provide reference for producing hypoallergenic dairy products.

milk allergen;processing technology;detection

2015-06-18

譚夢(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：功能蛋白改性，E-mail：sherrytan0813@163.com。

國家高技術研究發展計劃(2013AA102207-3)。

TS252.1

A

1002-0306(2016)05-0384-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.070