不同溫度培養誘導金黃色葡萄球菌對超高壓失活的抗性及其建模

韓洪玲,袁先雯,高瑀瓏,馮燕玲,董　月,朱　蕾,夏　凡,唐瑞麗

(南京財經大學食品科學與工程學院 江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室,江蘇南京 210023)

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不同溫度培養誘導金黃色葡萄球菌對超高壓失活的抗性及其建模

韓洪玲,袁先雯,高瑀瓏*,馮燕玲,董月,朱蕾,夏凡,唐瑞麗

(南京財經大學食品科學與工程學院 江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室,江蘇南京 210023)

探討不同培養溫度處理誘導金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)對超高壓的抗性,并建立不同培養溫度下金黃色葡萄球菌的超高壓抗性模型。金黃色葡萄球菌經不同溫度培養,在100～500 MPa的超高壓條件下,選用線性、Weibull和Gompertz三種模型來擬合超高壓抗性曲線,以決定系數(R2),均方誤差(RMSE),精確因子(Af)和偏差因子(Bf)作為模型擬合度優劣的評判指標。實驗結果表明,在100～500 MPa壓力的作用下,線性模型的擬合效果不佳,R2最小值達到0.8870,Weibull和Gompertz模型對超高壓的抗性具有較好的擬合性(R2≥0.9467),且Weibull模型的擬合效果最好,R2最大值達到0.9956,RMSE最小值為0.0312。因此,Weibull模型可以很好地擬合金黃色葡萄球菌以不同的培養溫度脅迫后在超高壓作用下的抗性曲線,隨著培養溫度的升高,金黃色葡萄球菌的超高壓抗性呈增加趨勢。

超高壓,金黃色葡萄球菌,Weibull模型

在食品加工過程中,微生物常常遭到酸、堿、鹽、饑餓和生長溫度等非致死性條件的脅迫[1],菌體經歷某一種不適環境的脅迫,之后再遇到同種類型的不適環境時,其存活能力明顯升高,我們把這種作用稱之為同源性保護作用;而菌體經某一種不適環境脅迫,隨后在遇到其它別的不適環境時,其存活能力明顯提高,這種作用稱之為交叉保護作用。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是人類的一種主要的病原菌[2],在自然界中廣泛分布,極易污染各類食品[3]。因此金黃色葡萄球菌常常要面臨一系列的酸、堿、滲透壓、高溫、低溫等不適環境的脅迫,由于不適條件脅迫,使金黃色葡萄球菌誘導出對脅迫環境的自我保護機制。Cebrian等[4]通過對金黃色葡萄球菌進行酸、熱和過氧化氫的脅迫處理,發現與未經處理的菌株相比,經脅迫處理后的菌株對熱處理的抗性均有所增加。即金黃色葡萄球菌經過酸、過氧化氫脅迫處理產生了對熱處理的交叉保護作用。超高壓殺菌技術是目前備受關注的一項現代食品低溫殺菌技術[5-6]。因此研究金黃色葡萄球菌遭受各種不適環境的脅迫,誘導其對超高壓產生交叉保護作用,有利于精準控制超高壓殺菌的關鍵因素,避免盲目、隨意地選用殺菌條件,合理優化食品超高壓操作條件,對超高壓殺菌的工業化應用具有重要的理論和實踐指導意義。

同時,在傳統熱力殺菌中,通常采用一級動力學方程,D值和Z值作為熱力學參數;隨著非熱力殺菌技術的廣泛研究,許多研究表明,非熱力殺菌所造成的微生物失活曲線并不一定完全遵循一級動力學方程與對數線性關系,而存在“肩部”(shoulder)和“拖尾”(tailing)現象[7]。近年來,Weibull模型以及Gompertz模型被廣泛地應用于非熱力殺菌的模型擬合[8-9]。Sagarzazu等[10]應用Weibull模型擬合空腸彎曲菌超高壓失活模型。盧蓉蓉等[11]用線性和Weibull模型來研究超高壓殺菌的動力學方程。Kim等[12]將Gompertz模型應用于超臨界二氧化碳殺菌效果的研究中;馮曉慧等[13]應用Gompertz模型擬合不同熱處理條件下李斯特菌的失活曲線。目前已有的這些相關研究均以線性、Weibull以及Gompertz模型來擬合加熱、超高壓等殺菌的動力學曲線,旨在比較、分析和確定適合描述和預測加熱、超高壓等殺菌過程的動力學模型,而未涉及菌體經不利條件脅迫后對超高壓抗性的變化,即菌體耐壓性的變化。對于金黃色葡萄球菌經不利培養溫度脅迫后,是否可誘導其對超高壓抗性的變化？即是否產生交叉保護作用目前尚不清楚,國內外鮮見相關報道。

本研究基于線性、Weibull和Gompertz模型擬合金黃色葡萄球菌在不同培養溫度下誘導其對超高壓抗性的變化,篩選最佳擬合模型,并獲得可以描述金黃色葡萄球菌耐壓性的特征參數值,以期為超高壓殺菌技術食品工業中的應用奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

HHP-3型超高壓設備(壓力范圍為0～ 800 MPa)內蒙古包頭市科發新型高技術食品機械有限公司;Allegra64R型高速低溫離心機美國Beckman公司;UV-9100型紫外可見分光光度計北京北分瑞利分析儀器有限責任公司;FR-900型多功薄膜封口機上海麥爾多食品機械有限公司;BSA3202S型Sartorious精密電子天平北京塞多斯天平有限公司;Millipore一次性針頭過濾器(0.22 μm)北京智杰方遠科技有限公司;XW-80型旋渦混合器上海醫科大學儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1不同培養溫度下金黃色葡萄球菌生長曲線的建立將金黃色葡萄球菌菌種轉接至TSB中,置于15、25、36、45 ℃的溫度下振蕩培養,在15 ℃的溫度培養下,每隔12 h取樣一次;而25、36、45 ℃的溫度培養下,每隔2 h取樣一次,在600 nm波長下,用紫外可見分光光度計測定吸光度值(OD)來建立其生長曲線。根據上述建立的生長曲線,將金黃色葡萄球菌菌種轉接至TSB中,置于15、25、36、45 ℃的溫度下振蕩培養至所對應的穩定期,以備超高壓處理。

1.2.2金黃色葡萄球菌菌懸液的制備和超高壓處理分別取經過上述不同培養溫度下培養至穩定期的金黃色葡萄球菌菌懸液100 mL,離心(3000 r/min,10 min),棄上清液,沉淀下的菌體以PBS洗滌1次,再以PBS制成菌懸液,調整菌體濃度,使起始菌數N0約為107CFU/mL,將其分裝于5 mL的醫用無菌塑料瓶,熱封口,不留頂隙,冷藏。按照實驗設計控制高壓介質溫度,待樣品溫度與高壓介質溫度達到平衡后,進行超高壓處理,升壓速度為150 MPa·min-1,卸壓速度為300 MPa·s-1,每個樣品重復處理3次[16]。

1.2.3金黃色葡萄球菌存活的測定對1.2.2節所制備的金黃色葡萄球菌菌懸液經高壓處理后,立即進行菌落總數的測定,以無菌生理鹽水適當稀釋對照及超高壓處理后的供試菌懸液,于胰酪蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)平板36 ℃培養72 h后,按文獻[17]進行菌落計數,檢測限為1 CFU/mL。存活的表達:經高壓處理后每毫升菌懸液的菌落數為Nt(CFU/mL),未經超高壓處理的對照組每毫升菌懸液的菌落數為N0(CFU/mL)。

1.3模型的建立

這時，一隊鋼盔閃亮，皮鞋锃亮的憲兵隊走了過來，憲兵們個個戴著白手套，緊握著胸前的湯姆森，領隊的是幾個官長。一個看來是最大的長官皺著眉頭停在如玉豆腐坊前，抬眼看了看字號，指指滿堂的黑布白字：“你家還在辦喪事？為什么還留在城里？”

1.3.1線性模型線性模型是描述微生物失活的經典模型,采用D值或Z值(使D值減少90%所需升高的溫度)來確定食品中微生物的熱殺菌工藝條件,用方程(1)來表示:

式(1)

式中:S(t)表示菌體存活分數,即Nt/N0;N0為初始菌體的數量,t為熱處理時間(min),Nt為t時刻的菌體數量;D值表示在一定溫度下使微生物的存活數量降低一個對數單位所需的時間。

1.3.2Weibull模型基于概率分布的Weibull模型將微生物失活曲線看作是其失活分布的積累形式,能較好地擬合其失活[18],適于熱力和非熱力殺菌下微生物失活模型的擬合,用方程(2)來表示:

式(2)

式中,S(t)表示菌體存活百分數,即Nt/N0;N0為初始菌體數量,t為處理時間(min),Nt為t時刻的菌體數量;δ和ρ分別為規模和形態參數,其中δ表示菌體數量首次減少一個數量級所需的時間;ρ代表曲線的形狀參數,當ρ=1時,所得出的曲線為直線;當ρ>1時,曲線為凸形曲線;當ρ<1時,曲線為凹形曲線[19]。

圖1　在25 ℃培養金黃色葡萄球菌在不同壓力下的失活曲線Fig.1　Curves of inactivation of Staphylococcus aureus incubated at temperature of 25 ℃ under different pressures

1.3.3Gompertz 模型近年來,許多研究表明Gompertz模型也能夠較好地擬合微生物的失活曲線,用方程(3)來表示:

式(3)

式中,S(t)表示菌體存活分數,即Nt/N0;N0為初始菌體數量;t為處理時間,min;Nt為t時刻的菌體數量;A為菌體數量的最大減少值,A=lg(Nmin/N0);Nmin為剩余的最小菌量;B菌體最大比失活率(min-1);C為菌體失活延滯時間(min)。

1.3.4模型擬合度的比較采用JMP10.0軟件(SAS公司)對實驗數據分別進行線性、Weibull和Gompertz模型的擬合,得到3種金黃色葡萄球菌的超高壓抗性模型。以決定系數R2、均方根誤差RMSE、精確因子Af和偏差因子Bf四個參數來評判模型擬合度的優劣[20]。RMSE和Af、Bf的值分別按式(4)、式(5)和式(6)計算[21]。

式(4)

式(5)

式(6)

式(4)、式(5)和式(6)式中,n為測定值數。

1.3.5數據處理數據處理通過JMP(10.0)軟件,采用Duncan新復極差法(SSR)進行多重比較,結果以平均值±標準差表示,p<0.05為差異顯著。

2　結果與分析

2.1不同生長溫度下金黃色葡萄球菌生長曲線

金黃色葡萄球菌在15、25、36、45 ℃的溫度培養下,通過繪制不同培養溫度下的生長曲線,發現其所對應生長穩定期的分別為:360、22、18、20 h。

2.2三種模型擬合曲線

以線性、Weibull和Gompertz模型擬合不同培養溫度下,金黃色葡萄球菌在100、200、300、400、500 下的超高壓抗性曲線,培養溫度為25 ℃時,結果見圖1;15、36、45 ℃三種培養溫度的抗性曲線未列出。從圖1曲線的走勢可以直觀判斷出Weibull和Gompertz模型較線性模型有更好的擬合性,15、36、45 ℃三種培養溫度也有同樣的結果。

2.3Weibull和Gompertz模型的參數分析

Weibull模型與Gompertz模型分別有2個和3個參數,通過模型擬合得到參數的相應值見表1。Weibull模型中,規模參數δ與曲線的形狀無關,反映了超高壓滅菌效果及對超高壓抗性的大小,即δ表示金黃色葡萄球菌對超高壓作用的抗性參數,抗性大小與參數δ呈正比,δ值越大表示抗性越強;對表1中δ進行分析,發現在相同壓力下,隨著培養溫度的增加,δ值呈明顯增加趨勢,以上實驗結果表明,較高的生長溫度可誘導金黃色葡萄球菌對超高壓抗性的增加。相同培養溫度下,隨著壓力的增加,δ值呈下降趨勢,表明壓力越高,超高壓的殺菌效果越明顯。

表1　不同壓力下基于線性、Weibull和Gompertz模型擬合曲線參數Table 1　Fitting parameters of linear,Weibull and Gompertz models under different pressure

ρ作為形狀參數,一方面反映了抗性曲線的形狀,當ρ=1時,所得出的曲線為直線;當ρ>1時,曲線呈凸形,向下彎曲;當ρ<1 時,曲線呈凹形,向上彎曲[22]。對表1中ρ值進行分析,并結合圖1擬合曲線可以發現在壓力較低時(100～ 200 MPa),ρ<1,所得抗性曲線向上彎曲;在300～ 500 MPa處理條件下,ρ>1,曲線向下彎曲。ρ值的大小除了反應抗性曲線的形狀,其值的大小也反映了特定的生物學意義[23],當ρ<1時,表明模型曲線隨著時間的延長下降趨勢減緩,金黃色葡萄球菌失活率減小;當ρ>1,表明抗性模型曲線隨著時間的延長下降趨勢變快,菌體失活率變快,金黃色葡萄球菌存活率隨著壓力的增大而迅速減小,即隨著時間的延長其越容易死亡,失活率增大。

Gompertz模型中,參數A表示菌體數量的最大減少值,反映超高壓的殺菌效果。由表1可知,隨著壓力的增大,參數A呈增加趨勢,表明壓力越大,金黃色葡萄球菌失活數量越大;而在相同的壓力作用下,隨著培養溫度的提高,參數A基本表現為降低的趨勢,表明隨著培養溫度的提高,金黃色葡萄球菌對壓力的抗性在增加,即提高金黃色葡萄球菌培養溫度可誘導其抗性增加。B值為超高壓處理過程中菌體最大比失活率;C值表示菌體失活延滯時間,由表1可知,壓力較低時(100～200 MPa),0.02≤B≤0.17;在300～500 MPa的處理條件下,金黃色葡萄球菌的比失活率增大,失活延滯時間縮短,表明高壓力下,可以達到快速高效滅菌的效果。

2.4擬合模型的合適性評價

經不同的培養溫度,金黃色葡萄球菌在100、200、300、400、500 MPa的作用下,超高壓抗性擬合曲線的參數R2、RMSE、Af和Bf見表2。其中,決定系數R2和RMSE表示模型的精確度、可靠度,R2越接近于1,RMSE越小,模型擬合度越高;由表2可知,100 MPa和200 MPa的壓力下,線性、Weibull和Gompertz模型R2均大于0.9422,Weibull模型均方根誤差0.0312≤RMSE≤0.1403,Gompertz模型均方根誤差0.0294≤RMSE≤0.1076,這3種模型都可以用來擬合金黃色葡萄球菌的超高壓抗性曲線。

表2　不同壓力下線性Weibull和Gompertz抗性模型曲線擬合效果對比Table 2　Comparing the fitting effects of linear,Weibull and Gompertz models under different pressures

注:R2表示決定系數;RMSE表示均方根誤差;Af表示精確因子;Bf表示偏差因子。

隨著壓力的增大,Weibull和Gompertz模型則表現出較好的擬合性,如在300～500 MPa的處理條件下,線性模型的R2值最小為0.8870,而Weibull和Gompertz模型的R2值均大于0.9467,表明Weibull和Gompertz模型的擬合效果優于線性模型。

為了進一步評價Weibull和Gompertz模型擬合效果,比較這兩種模型的精確因子Af和偏差因子Bf。Af反映了預測值與實測值偏離的程度,Af值越小表明模型預測值與實測值越接近,模型越精確,Af越接近于1模型的擬合度越好;Bf>1表示模型預測值比實測值高,當Bf<1表示模型預測值比實測值低,Bf越接近1,模型擬合度也越高。由表2可知,Weibull模型精確因子1.0272≤Af≤1.4153,Gompertz模型精確因子1.0522≤Af≤2.1450。均方根誤差RMSE越小,模型擬合度越高;而Af值越接近于1模型的擬合度越高,說明Weibull模型較Gompertz模型擬合效果較好。偏差因子Bf在0.901.15,認為模型擬合效果不可接受[24]。由表2可知,Weibull模型0.9018≤Bf≤1.0483;Gompertz模型0.4662≤Bf≤1.0642;所以,Gompertz模型擬合效果可接受,而Weibull模型擬合效果最好。

2.5擬合模型的驗證

為了進一步驗證Weibull模型可以有效擬合金黃色葡萄球菌對超高壓失活的抗性曲線,實驗選取36 ℃下培養的金黃色葡萄球菌在150、250、350、450 MPa的條件下進行超高壓滅菌,相比之下,以Weibull模型擬合金黃色葡萄球菌在超高壓作用下的失活曲線,擬合程度高(R2≥0.9813),精確因子1.0105≤Af≤1.1151,偏差因子0.9120≤Bf≤1.031,均方根誤差0.0388≤RMSE≤0.1171,所以Weibull模型可用來擬合金黃色葡萄球菌對超高壓失活的抗性曲線。

3　結論

采用線性、Weibull和Gompertz模型擬合了不同培養溫度誘導金黃色葡萄球菌的超高壓抗性曲線,以決定系數R2、均方根誤差RMSE、精確因子Af和偏差因子Bf這4個參數來評判模型擬合度的優劣,結果表明Weibull模型能更好地擬合不同培養溫度誘導金黃色葡萄球菌的超高壓抗性,Weibull和Gompertz模型的擬合參數皆表明在不同培養溫度脅迫下,隨著培養溫度的升高,金黃色葡萄球菌的超高壓抗性呈增加趨勢。這為研究培養溫度及其它別的脅迫處理條件誘導微生物的超高壓抗性及其機理提供理論依據和新思路。

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Modelling and the induced resistance of inactivation ofStaphylococcusaureusto high hydrostatic pressure incubated at different culture temperatures

HAN Hong-ling,YUAN Xian-wen,GAO Yu-long*,FENG Yan-ling,DONG Yue,ZHU Lei,XIA Fan,TANG Rui-li

(Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing,Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety,College of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance and Economics,Nanjing 210023,China)

The resistance models ofStaphylococcusaureus(ATCC6538)were established in order to investigate the development of resistance responses to high hydrostatic pressure(HHP)treatment inS.aureuscultured at different temperatures. The resistance data forS.aureusincubated at different temperatures were obtained under the conditions of the pressures from 100 to 500 MPa. Then Linear,Weibull,and Gompertz models were selected to fit the curves of resistance to HHP ofS.aureus. Regression coefficients(R2),root mean square error(RMSE),accuracy factor(Af)and bias factor(Bf)were used to evaluate the goodness of fit for the three models. Results showed that the Linear model provided a poor fit for the data,which has minimumR2(0.8870),and Weibull model and Gompertz model showed suitable goodness-of-fit at five pressure levels between 100 to 500 MPa(R2≥ 0.9467). The Weibull model,which had maximumR2(0.9956)and minimum RMSE(0.0312),could be fitted perfectly to the curves of resistance to HHP in the three models. In conclusion,Weibull model showed ideal goodness-of-fit to the curves of resistance to HHP inactivation ofStaphylococcusaureus. Moreover,with increasing incubation temperatures,the pressure resistance ofS.aureusincreased.

high hydrostatic pressure(HHP);Staphylococcusaureus;Weibull model

2016-01-18

韓洪玲(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物與生物技術，E-mail:942924471@qq.com。

高瑀瓏(1974-)，男，博士，教授，主要從事食品微生物與生物技術方面的研究，E-mail:yulonggao19762001@163.com。

江蘇省自然科學基金(BK20131435)；江蘇省教育廳省屬高校自然科學研究(12KJB550003)；國家自然科學基金(31371864)；糧食公益性行業科研專項(201413007-05)；江蘇省高校優勢學科建設工程資助項目(PADP)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)14-0102-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.012