響應面法優化ClO2溶液對牡蠣中沙門氏菌的殺菌動力學

林佳揚,陳小藝,周愛蓮,方　婷

(福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002)

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響應面法優化ClO2溶液對牡蠣中沙門氏菌的殺菌動力學

林佳揚,陳小藝,周愛蓮,方婷*

(福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002)

為了探究ClO2溶液處理牡蠣中沙門氏菌的最佳殺菌條件,本文選用鼠傷寒沙門氏菌(CICC22956)和腸炎沙門氏菌(CICC21482)混合菌株,在單因素實驗的基礎上,運用響應面實驗設計方法探討料液比、ClO2溶液濃度和殺菌時間對牡蠣中的沙門氏菌殺菌效果的影響。通過響應面優化模型確定ClO2溶液殺菌的最佳條件為:料液比1∶7 g/mL,ClO2濃度93 g/mL,殺菌時間30 min。在此條件下模型優化出最優的沙門氏菌菌落降低值為3.13 lg cfu/g。實驗結果表明,采用上述分析的最佳條件不僅有效防止牡蠣中沙門氏菌的污染,還可以提高生鮮牡蠣的品質和安全性。

牡蠣,沙門氏菌,ClO2殺菌,響應面設計

牡蠣是一種藥食兩用的海中珍品,但是牡蠣在生長、捕獲、運輸以及銷售的過程中經常會受到各種致病菌的污染,尤其是沙門氏菌[1-2]。Tingfang等[3]研究了鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌混合菌株在牡蠣中的不同溫度下微生物的生長特性,同時指出,牡蠣在生食過程中,極易受到這兩種血清型感染,從而引發諸多沙門氏菌食物中毒事件,對消費者帶來極大的健康威脅。目前貝類凈化技術基本上是用臭氧、ClO2、紫外線這3種方法對進行處理[4-5]。而對牡蠣中沙門氏菌殺菌效果的研究未見相關報道。

二氧化氯(ClO2)是目前國際上公認的高效A1級滅菌消毒劑,它殺菌力極強、殺菌速度快、效率高、副產物少,適合作為食品消毒劑[6-8]。我國國標GB2760-2014中規定ClO2可以在水產品加工中應用[9]。陶晶等[10]采用簡單的單因素實驗法研究表明,當海水中ClO2濃度為18.75 mg/g時,在30 h內可使牡蠣內的細菌總數降低2.61,消毒效果較好。

響應面分析法(response surface methodology,RSM)是利用合理的實驗設計,解決多變量問題的一種統計方法,它與過去廣為使用的正交實驗設計法不同,具有實驗周期短,求得的回歸方程精度高,能研究幾種因素間交互作用等優點[11]。

本實驗根據實驗室的實際條件出發,擬以ClO2溶液為殺菌劑,參考Fang[3]實驗方法,選用鼠傷寒沙門氏菌(CICC22956)和腸炎沙門氏菌(CICC21482)混合菌株為研究對象,通過響應面分析優化確定出ClO2殺菌劑處理牡蠣中沙門氏菌的最佳工藝條件,旨在為進一步提高牡蠣的品質和延長產品的保藏期,為其在食品工業中的應用提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

近江牡蠣福建省福州市郭厝里永輝超市;胰蛋白胨大豆瓊脂TSA,北京雙旋微生物培養基制品廠;腦心浸液肉湯培養基BHI,廣東環凱微生物科技有限公司;蛋白胨Peptone,青島高科園海博生物技術有限公司;利福平國藥集團;二氧化氯(ClO2含量10%)華星牌;鼠傷寒沙門氏菌(CICC22956)和腸炎沙門氏菌(CICC21482)均采購于中國工業微生物菌種保藏中心。

GNP-9080型隔水式恒溫培養箱上海精宏實驗設備有限公司;THZ-C型恒溫振蕩器太倉市實驗設備廠;QL-866型快速混合器海門市其林貝爾儀器制造有限公司;大容量電動移液器大龍興創實驗儀器有限公司;YXQ-LS50型高壓滅菌鍋上海博訊實業公司;BagMixer100型均質拍打器上海思伯明儀器設備有限公司;FA1004A 型電子天平上海精天電子儀器有限公司;PT919型秒表深圳市超速達實業有限公司;H1850R型高速冷凍離心機湘儀離心機儀器有限公司;YB-40-60LA型超低溫冰箱上海億倍實業有限公司;無菌均質袋。

1.2實驗方法

1.2.1ClO2消毒液的配制1 g ClO2粉劑溶解于1000 mL無菌水中可制得有效ClO21000 mg/L的消毒液。

1.2.2細菌培養采用Fang[3]的方法,保存并制備每次實驗所需的接種菌液。

1.2.3原料準備與接種牡蠣的預處理采用Fang[3]的方法進行樣品的制備與接種。

1.2.4沙門氏菌和背景菌的菌落數測定采用Fang[3]的方法進行測定。

1.2.5單因素實驗

1.2.5.1料液比對沙門氏菌殺菌效果的影響選取ClO2濃度為100 mg/L、殺菌時間20 min,溫度為25 ℃的一定條件下,探討不同料液比(0、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)g/mL對牡蠣中沙門氏菌和背景菌的菌落數變化影響。

1.2.5.2ClO2濃度對沙門氏菌殺菌效果的影響選取料液比1∶6 g/mL,處理時間20 min,溫度為25 ℃的一定條件下,探討不同ClO2濃度(0、30、50、60、100、120 mg/L)對牡蠣中沙門氏菌和背景菌的菌落數變化影響。

1.2.5.3處理時間對沙門氏菌殺菌效果的影響選取料液比1∶6 g/mL,ClO2濃度為100 mg/L,溫度為25 ℃的一定條件下,探討不同處理時間(0、10、20、30、40、50 min)對牡蠣中沙門氏菌和背景菌的菌落數變化影響。

1.2.6響應面實驗根據Box-Behnken Design(BBD)實驗設計原理[12-13],以沙門氏菌菌落數降低值為響應值,結合上述單因素實驗結果,選取與之密切相關的ClO2濃度、料液比、殺菌時間3個因素為自變量,設計了3因素3水平響應面分析實驗。實驗因素水平見表1。

表1　響應面實驗因素水平表Table 1　Factors and levels of the response surface experiment

1.3數據處理

采用Design-Expert V8.0.6統計軟件。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1料液比對牡蠣中沙門氏菌和背景菌數的影響由圖1所示,隨著ClO2溶液用量的不斷增加,沙門氏菌和背景菌數先下降后趨于平緩,當料液比為1∶10時,沙門氏菌的菌落數下降了3.07 lg cfu/g,背景菌的菌落數下降了2.71 lg cfu/g。其中,料液比小于1∶6范圍區間,沙門氏菌和背景菌菌落數下降值存在顯著差異(p<0.05);料液比為1∶8～1∶10之間時,增加ClO2溶液用量,沙門氏菌和背景菌菌落數沒有顯著變化。因此,當料液比為1∶6時,ClO2溶液對牡蠣進行殺菌處理效果好。

圖1　不同料液比對沙門氏菌和背景菌數的影響 Fig.1　Effects of different proportion on the number of Salmonella and background microorganisms

2.1.2ClO2溶液濃度對牡蠣中沙門氏菌和背景菌數的影響由圖2可知,隨著ClO2溶液濃度的不斷增加,沙門氏菌和背景菌數先降低后趨于平緩,當ClO2溶液濃度為120 mg/L時,沙門氏菌的菌落數下降了3.02 lg cfu/g,背景菌的菌落數下降了2.62 lg cfu/g。其中,當ClO2溶液濃度在0～100 mg/L時,沙門氏菌和背景菌數下降值存在顯著差異(p<0.05);當ClO2溶液濃度在100～120 mg/L時,沙門氏菌和背景菌數下降值沒有明顯變化。說明當ClO2溶液達到一定濃度時,對菌體的殺菌效果無法起到顯著作用,考慮到原材料的消耗率,節約經濟成本,故本實驗選用ClO2溶液對牡蠣進行殺菌處理的濃度為75 mg/L。

圖2　不同ClO2消毒液濃度 對沙門氏菌和背景菌數的影響Fig.2　Effects of ClO2disinfectant density on the number of Salmonella and background

2.1.3殺菌時間對牡蠣中沙門氏菌和背景菌數的影響由圖3可知,隨著ClO2溶液處理時間的不斷增加,沙門氏菌和背景菌數先降低后趨于平緩,當處理時間為50 min時,沙門氏菌的菌落數下降了3.09 lg cfu/g,背景菌的菌落數下降了2.65 lg cfu/g。其中,當處理時間在0～20 min時,沙門氏菌和背景菌數下降值存在顯著差異(p<0.05);當處理時間在40～50 min時,菌落數沒有較大變化,原因可能在于隨著時間的延長,ClO2消毒液的濃度降低,菌體產生應急反應,造成菌體抗性增加,ClO2溶液的殺菌效果減弱[14]。由此可說明,ClO2溶液對牡蠣進行殺菌處理的最佳處理時間為20 min。

圖3　不同處理時間對沙門氏菌和背景菌數的影響Fig.3　Effects of different times on the number of Salmonella and background

2.2ClO2溶液殺菌工藝優化

2.2.1響應面設計與結果分析該研究選用BBD實驗設計,整個實驗設計在四個中心點處進行17次實驗,其中13次是分析實驗,實驗結果隨機完成,結果見表2。

表2　實驗設計及其結果Table 2　The design and results of experiments

通過Design-Expert V8.0.6 統計軟件擬合響應指標對自變量的回歸曲線,建立數學模型并進行統計分析,結果如下:

Y=2.82+0.14A+0.37B+0.41C-2.500E-003AB+0.057AC+0.052BC-0.21A2-0.37B2-0.25C2,對回歸曲線進行方差分析,結果見表3。

2.2.2響應面圖分析經Design-Expert V 8.0.6統計軟件分析,由回歸方程分析得到沙門氏菌菌落降低值與各因素的響應面結果見圖4～圖6。在響應面圖中,曲面越陡峭,表明該實驗因素對響應值的影響越顯著。等高線圖與響應面圖相對應,等高線圖隨著響應面圖的變化而變化,其曲線越接近中心,則對應的響應值也就越大[15]。

圖4表示固定殺菌時間為20 min,料液比和ClO2溶液濃度對牡蠣中沙門氏菌殺菌效果的影響。從圖4可看出,A、B交互作用不顯著。圖4中隨著料液比和ClO2濃度的增大,沙門氏菌菌落數減少值均呈上升趨勢,到達某一定值時曲面趨于平緩,說明隨著殺菌時間的延長,ClO2容易揮發,影響殺菌效果;由圖4可以確定最佳水平范圍即料液比為1∶6.5～1∶7,ClO2溶液濃度為75～95 g/mL。

表3　回歸模型方差分析Table 3　The variance analysis of the regression model

圖4　料液比和ClO2濃度交互作用 對沙門氏菌菌落數降低值的響應面圖Fig.4　The response surface map of the effect of interaction between different proportion and concentration of ClO2 on the viscosity of sol solution

注:*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01)。

圖5表示固定ClO2溶液濃度為75 g/mL時,料液比和殺菌時間對牡蠣中沙門氏菌殺菌效果的影響。由圖5顯示,A、C交互作用顯著。隨著料液比和殺菌時間的增大,沙門氏菌菌落數減少值呈先升高后降低的趨勢;由圖5可以確定最佳水平范圍即料液比為1∶6.5～1∶7,殺菌時間為25～30 min。

圖5　料液比和殺菌時間交互作用 對沙門氏菌菌落數降低值的響應面圖Fig.5　The response surface map of the effect of interaction between different proportion and different sterilization times on the viscosity of sol solution

圖6表示固定料液比為1∶6 g/mL時,ClO2溶液濃度和殺菌時間對牡蠣中沙門氏菌殺菌效果的影響。由圖6顯示,B、C交互作用顯著。隨著ClO2溶液濃度和殺菌時間的增大,沙門氏菌菌落數減少值先升高,達到某一定值時趨于平緩;由圖6可以確定最佳水平范圍即ClO2溶液濃度為85～95 g/mL,殺菌時間為25～30 min。

圖6　殺菌時間和ClO2濃度交互作用 對沙門氏菌菌落數降低值的響應面圖Fig.6　The response surface map of the effect of interaction between different sterilization times and concentration of ClO2 on the viscosity of sol solution

2.2.3最優殺菌條件的確定及模型驗證以沙門氏菌菌落數降低值為最終考察指標,根據Design-Expert V 8.0.6軟件對所得回歸方程的最優預測值求解,可得ClO2溶液殺菌處理牡蠣中沙門氏菌的最優殺菌參數,其分別為:料液比1∶6.88 g/mL、ClO2溶液濃度92.48 g/mL、殺菌時間30 min,最大沙門氏菌菌落降低值達到3.14 lg cfu/g。為方便實際操作將實驗條件校正為料液比1∶7 g/mL、ClO2溶液濃度93 g/mL、殺菌時間30 min,在上述最優條件下進行3次重復實驗,驗證實驗所得平均沙門氏菌菌落降低值為3.13 lg cfu/g,結果表明,經過響應面回歸方程擬合處理的理論值與實際值相吻合,用響應面法可以優化ClO2溶液對牡蠣中沙門氏菌的殺菌工藝。

3　結論

以牡蠣中沙門氏菌為研究對象,采用ClO2溶液可以有效減少牡蠣中沙門氏菌,根據Design-Expert V8.0.6軟件對所得回歸方程的最優預測值求解,可得ClO2溶液殺菌處理牡蠣中沙門氏菌的最優殺菌參數為:料液比1∶7 g/mL,ClO2溶液濃度93 g/mL,殺菌時間30 min,沙門氏菌菌落降低值為3.13 lg cfu/g。

經實驗驗證,模擬方程預測值具有較高的擬合度及可信度,可以應用該回歸模型分析和預測ClO2溶液對牡蠣中沙門氏菌殺菌效果的影響。因此,ClO2溶液不僅可以有效降低牡蠣中沙門氏菌的數量,還可以提高生鮮牡蠣的品質和安全性。

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Sterilizing dynamics ofSalmonellaspp. in oyster by chlorine dioxide

LIN Jia-yang,CHEN Xiao-yi,ZHOU Ai-lian,FANG Ting*

(College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

To optimize the sterilizing parameters of chlorine dioxide forSalmonellaspp. in oyster,the samples were inoculated with a cocktail of twoSalmonellaserotypes,S.Typhimurium(CICC22956)andS.Enteritidis(CICC21482). The single factor tests and response surface methodology(RSM)were applied. The impacts of different proportion,concentration of chlorine dioxide,sterilization timeSalmonellaspp. sterilization in oyster were investigated. Results showed that the optimal sterilizing conditions were as follows:the ratio of oyster to chlorine dioxide solution was 1∶7 g/mL,the concentration of chlorine dioxide was 93 g/mL,and operating time was 30 min. The repeated test under these conditions showed that the reduced number ofSalmonellapp. was 3.13 lg cfu/g. In conclusion,the optimal conditions for sterilization of fresh oysters could not only effectively prevent the contamination ofSalmonellaspp.,but also improve the quality and safety of fresh oysters.

oyster;Salmonellaspp.;chlorine dioxide sterilization;response surface design

2016-01-20

林佳揚(1991-),男,碩士研究生,研究方向:農產品加工與貯藏工程,E-mail:linjiayang065@163.com。

方婷(1981-),女,副教授,研究方向:農產品加工與貯藏工程,E-mail:fangting930@163.com。

國家自然科學基金(31401597);閩發改投資[2014]168號;福建省高水平大學建設項目(612014043)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)14-0108-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.013