乳扇菌群的PCR-DGGE分析及其中乳酸菌的分離與特性研究

侯　宇,范金波,*,張　明,趙　亮,任發政,王靜璇,李秋妍

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.北京工商大學食品學院,北京 100048;3.中國農業大學,教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室,北京 100083;4.中國農業大學,北京市高等學校畜產品工程研究中心,北京 100083)

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乳扇菌群的PCR-DGGE分析及其中乳酸菌的分離與特性研究

侯宇1,范金波1,*,張明2,*,趙亮3,4,任發政3,4,王靜璇3,4,李秋妍3,4

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.北京工商大學食品學院,北京 100048;3.中國農業大學,教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室,北京 100083;4.中國農業大學,北京市高等學校畜產品工程研究中心,北京 100083)

傳統乳制品微生物資源豐富,其中菌種的分離及特性研究是菌株開發應用的基礎。本文采用聚合酶鏈式反應變性梯度凝膠電泳(Polymerase Chain Reaction-Denatured Gradient Gelelectrophoresis,PCR-DGGE)確定乳扇中菌種的組成,并結合隨機擴增多態性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)技術與傳統培養方法成功得到PCR-DGGE確定的所有菌株:包括StreptococcusthermophilusS1、StreptococcusthermophilusS2、LactobacillusbulgaricusB14、L.paracaseLP9、L.caseiLC6。同時對5株菌進行發酵特性評價,發現嗜熱鏈球菌S1、S2產酸速度快且后酸化程度低;保加利亞乳桿菌B14具有良好的產黏特性;S2同樣具有良好的產香性能。最終確定S1、S2、B14是具有潛力的優良發酵劑菌株。

乳扇，乳酸菌，PCR-DGGE,RAPD,分離,發酵特性

云南傳統乳制品乳扇中蘊含豐富的微生物資源,針對乳扇中微生物的分離鑒定已有報道[1]。然而,這些研究中,菌株分離鑒定多采用傳統微生物分離、培養和鑒定方法,這種方法存在篩選目標不明確、工作大量重復的局限性,對于篩選出的生理生化特性相似的菌株也難以準確區分和鑒定[2]。運用PCR-DGGE和RAPD技術并結合傳統培養方法輔助實驗,可以大大改善傳統方法的缺點。既可以全面了解樣品中微生物組成和數量情況,有目的性的進行菌株篩選,避免遺漏;又可以對篩選出的菌株進行差異分析,提高篩選效率。這兩種技術在酸奶、干酪的乳酸菌鑒定及菌群動態分析中已有成功報道[3-4]。Tabasco[5]等表明PCR-DGGE能夠快速準確分析鑒定乳樣中菌株的數量與種類,避免了菌株的遺漏。因此,基于PCR-DGGE與RAPD新型分子分析技術對乳扇中的微生物進行分析,可更加準確、快速、全面地掌握乳扇中的微生物菌群特征,為菌株分離鑒定提供新思路。

乳酸菌發酵特性主要是酸度、黏度的增強與風味物質的產生[6]。Marshall[7]用酸度、風味、黏度篩選用于發酵劑的乳酸菌。杜昭平等[8]用黏度、酸度等指標分析兩株嗜熱鏈球菌與一株保加利亞乳桿菌的發酵特性。乳酸菌發酵產生的酸度是決定酸乳食用品質與生產效率的一個重要因素。黏度對酸乳的流變特性及組織狀態有很大影響,黏度的增大既可抑制酸乳的乳清析出,又可有效提高酸乳在口腔中的口感[9]。乳酸菌除促使乳中酪蛋白凝固,還產生許多風味物質,主要為乙醛、丁二酮等,這些風味物質決定了產品的適口性。

本實驗運用PCR-DGGE、RAPD技術并結合傳統培養方法對乳扇中的菌種進行有效的分離,并對菌株產酸、后酸化、黏度、產乙醛、產丁二酮等發酵特性進行研究,以期為發酵劑的開發提供理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

云南傳統乳制品乳扇共三份,采自云南大理洱源縣,置于4 ℃冰箱保存;三氯乙酸、酚酞、鄰苯二胺、碘、碘化鉀、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、無水乙酸鈉、吐溫-80、氫氧化鈉、瓊脂、硫酸鎂、亞硫酸氫鈉、一水合硫酸錳、鹽酸、乙醇等均為分析純,北京科百奧生物技術公司;丁二酮德國Sigma公司;脫脂乳粉新西蘭OCC公司;Taq酶、DNA Marker、DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒北京天根生物公司;引物上海英濰捷基公司設計。

CJ-2S超凈工作臺天津市泰斯特儀器有限公司;DELTA320數顯pH計梅特勒-托雷多;ZDX-35BI座式自動高壓滅菌鍋上海申安醫療器械廠;電子天平Mettler-Toledo公司;DNP-9082電熱恒溫培養箱上海精宏實驗設備有限公司;XSZ-4G顯微鏡COIC公司;UV-2102 PC型紫外可見分光光度計UNICO公司;PTC-200基因擴增儀美國MJ公司;DYY-6C 電泳儀北京市六一儀器廠;Gel-Pro 4400 凝膠成像分析系統BINTA公司;TDL-5-A低速冷凍離心機上海安亭科學儀器廠;AR系列旋轉流變儀美國TA公司。

1.2菌群分析

運用傳統方法提取乳樣DNA[10],進行PCR-DGGE實驗,PCR上下游引物分別為341F-GC和534R[11],引物序列見表1。PCR反應體系(50 μL):上下游引物各2.5 μL、模板DNA 2 μL、無菌水18 μL、Taq酶25 μL;PCR程序:94 ℃預變性3 min,98 ℃變性10 s、65～55 ℃退火5 s(每次循環降0.5 ℃)、72 ℃延伸30 s,20個循環;98 ℃變性10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸30 s,然后72 ℃延伸10 min。DGGE膠體濃度確定在30%～55%,對 DGGE圖譜上的條帶切膠回收測序,初步確定樣品中的菌株種類。

1.3菌株的分離與鑒定

根據DGGE分析結果,將乳樣涂布于MRS、M17、MRS(pH=5.4)選擇性培養基固體平板,并于43 ℃培養48 h,觀察菌落生長情況,挑取典型菌落,進行鏡檢,并純化鑒定,對相同鑒定結果的菌株進行RAPD分析。RAPD隨機選取7個隨機引物a～g(表1);PCR反應體系(20 μL):引物2 μL、模板DNA 1 μL、無菌水7 μL、Taq酶10 μL;PCR程序:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性30 s、36 ℃退火60 s、72 ℃延伸90 s,6個循環,94 ℃變性20 s、36 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s,30個循環,然后72 ℃延伸10 min。最終確定菌株數量與種類。

表1　引物名稱及序列Table 1　Names and sequences of primers

1.4菌株發酵特性測定

1.4.1酸度的測定酸度根據GB 5413.34-2010進行測定,取10 mL發酵乳樣,加入20 mL蒸餾水,加2～3滴酚酞,用0.1 mol/L的NaOH滴定至微紅色,30 s不褪色為終點,記錄消耗的NaOH的體積,用°T表示[12]。

1.4.2黏度的測定根據Masson[13]研究方法并加以改進,采用旋轉流變儀,60 mm steel plate,恒溫(4 ℃)、剪切頻率0～200 s-1、時間間隔為10 s條件下,連續測量60個數據點,檢測樣品的黏度隨剪切時間的變化情況,測定時間為10 min,黏度為50 s-1時對應的黏度值。

1.4.3產香能力的測定將活化好的菌株接種于滅菌脫脂乳中,42 ℃培養,凝乳(pH=4.5)后4 ℃冷藏,測定冷藏20 d酸乳中乙醛和丁二酮的含量[14]。

1.5數據統計

每組實驗做3個平行,采用Excel軟件、SPSS17.0軟件對數據進行分析處理。測量數據均以Mean±SD表示,p<0.05認為有顯著差異。

2　結果與分析

2.1菌群分析

將采得的3份樣品提取DNA,PCR擴增后進行DGGE電泳,如圖1所示,樣品a、b有3條條帶,樣品c有4條條帶。將條帶依次切膠回收鑒定,樣品a、b、c相同位置條帶鑒定結果一致(表2),條帶1為保加利亞乳桿菌、條帶2為嗜熱鏈球菌、條帶3為干酪乳桿菌或副干酪乳桿菌、樣品c中的條帶4為嗜熱鏈球菌,相似度均大于98%。結合圖1中條帶的亮度發現樣品中嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌為優勢菌株。最后得出乳樣中可能存在嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌4種乳酸菌,其中嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌為乳樣中優勢菌株。

圖1　PCR-DGGE電泳圖Fig.1　PCR-DGGE electrophoretogram

條帶菌屬相似度(%)1Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusstrainTW51-2992StreptococcusthermophilusJIM8232993LactobacillusparacaseisubspparacaseiorLactobacilluscasei994StreptococcusthermophilusLMD-9100

2.2菌株分離與鑒定

在已知乳樣菌株組成的條件下,對樣品進行目的性分離,用MRS、M17與pH5.4的MRS培養,將菌落形態不同、鏡檢結果有差異的菌株進行純化培養,菌株16S rDNA測序結果為嗜熱鏈球菌15株(分于M17與MRS),干酪乳桿菌2株(分于MRS),副干酪乳桿菌3株(分于MRS),保加利亞乳桿菌6株(分于pH=5.4的MRS)。通過RAPD分析鑒定,干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌均為1種基因型;而嗜熱鏈球菌存在2種基因型。嗜熱鏈球菌2種基因型RAPD結果如圖2所示,2株菌分別命名為S1、S2,從圖2中看出隨機引物c、e、f、g所對應的泳道5和6、9和10、11和12、13和14均出現條帶大小不一,位置不同的現象,說明S1與S2為2株不同的嗜熱鏈球菌。樣品共分離出5株乳酸菌,圖3為各菌株在100倍顯微鏡下革蘭氏染色圖,a為干酪乳桿菌LC6,b為副干酪乳桿菌LP9,c為嗜熱鏈球菌S1,d為嗜熱鏈球菌S2,e為保加利亞乳桿菌B14。

圖2　S1、S2的RAPD圖譜Fig.2　RAPD pattern of S1 and S2 注:M為DL2000;S1為泳道1、3、5、7、9、11、13; S2為泳道2、4、6、8、10、12、14;隨機引物a～g分別為 泳道1、2,3、4,5、6,7、8,9、10,11、12,13、14。

圖3　菌株革蘭氏染色光學顯微圖(100×)Fig.3　Light micrograph of bacterial(100×)

2.3發酵過程中酸度變化與后酸化測定

乳酸菌的產酸能力是影響酸乳生產周期長短、生產效率高低和品質、風味優劣的重要標準,也是評價菌株發酵特性的重要指標[15]。通過繪制酸度隨時間的變化曲線來確定產酸能力的強弱,如圖4所示,發酵10 h，LC6、LP9酸度無明顯變化,分離得到的干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌產酸速度慢;發酵過程(0～8 h),嗜熱鏈球菌產酸能力高于保加利亞乳桿菌,嗜熱鏈球菌發酵完成產酸能力趨于穩定后,保加利亞乳桿菌產酸能力高于嗜熱鏈球菌,這與前人研究結果相符[16]。嗜熱鏈球菌S1、S2分別在6.7、6.1 h完成凝乳(pH達到4.5),酸度分別為(85.94±0.52)°T,(82.72±0.61)°T,10 h酸度達到(91.29±2.32)°T、(92.72±1.82)°T,酸度基本維持穩定,主要是pH下降球菌生長受到抑制。而B14雖然在發酵前8 h產酸速度低于2株球菌,但隨著pH下降,其產酸速度加快,8 h凝乳完成,酸度為(86.35±1.49)°T,發酵到10 h酸度達到(111.12±0.42)°T。

圖4　發酵過程中酸度變化Fig.4　Change of acidity during yoghurt fermentation

后酸化是酸乳進入冷藏階段后,乳酸菌生長繁殖,乳的酸度繼續上升,出現消費者不可接受的酸味。乳酸菌后酸化是導致酸乳貯藏期品質變化主要原因之一。為保證酸乳品質,優良的酸奶發酵菌株應具備后酸化弱的特點[17]。將產酸性能良好的3株菌S1、S2和B14進行后酸化比較,從圖5可知,各菌株酸度均升高,冷藏20 d后,保加利亞乳桿菌B14酸度增加最多,達到25.44 °T(p<0.05),而嗜熱鏈球菌S1、S2分別增加了8.55 °T、13.13 °T(p<0.05),S1后酸化程度顯著低于S2、B14。郭清泉等[18]發現保加利亞乳桿菌是導致發酵乳發生后酸化的主要菌株,保加利亞乳桿菌細胞壁或細胞膜保護了細胞內的乳糖酶,從而使乳糖酶活性受到的影響小,使發酵乳繼續產酸。秦虹等人[19]研究中發現有的球菌在冷藏期間酸度可以增加30～45 °T,后酸化最弱的球菌Q3酸度增加了14.21 °T,酸度增加10～25 °T均可算為后酸化弱。本實驗中S1與S2具有后酸化弱的發酵特性,而保加利亞乳桿菌B14后酸化相對較強。

圖5　冷藏期間酸度的變化Fig.5　Change of acidity during storage

2.4發酵過程中黏度測定

黏度是評價發酵乳制品的重要指標,同時也是菌株重要的發酵特性之一[20]。對分離的5株菌進行發酵過程中黏度測定,可直觀看出菌株產黏能力,如圖6所示,發酵10 h LC6、LP9沒有到達凝乳狀態,無黏度。菌株S1、S2發酵凝乳后,黏度基本維持在400 mPa·s左右。B14黏度變化明顯,當開始凝乳(4～6 h之間)時隨發酵時間延長黏度顯著上升,凝乳完成時黏度趨于平穩,10 h黏度達到(1982.33±15.14)mPa·s,顯著高于其他4株菌(p<0.05)。Gisele等[21]測定了從傳統乳制品中“拉班”中分離到的嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌的黏度,研究者測出,各保加利亞乳桿菌株的黏度為350～740 mPa·s,各嗜熱鏈球菌為110～820 mPa·s,均低于本研究發現的保加利亞乳桿菌。可見B14是一株具有良好產黏特性的菌株。

圖6　發酵過程中黏度變化Fig.6　Change of viscosity during yoghurt fermentation

2.5產香測定

乙醛與丁二酮是酸乳中主要的風味物質,是評價菌株發酵特性的重要指標之一[22]。不同菌株產乙醛與丁二酮能力不同。由表3可知,S1、S2、B14發酵樣品在冷藏1 d后,乙醛的含量呈增多趨勢,這與劉景等人研究相符[23]。在冷藏20 d中,酸乳中乙醛含量除S2無明顯降低外,其余菌株均有下降趨勢。在凝乳完成時,S2產乙醛能力最強,顯著高于其他菌株(p<0.05)。冷藏20 d后,依然是S2產乙醛能力最強,顯著高于其他菌株(p<0.05),含量為(16.22±0.51)mg/L;S1雖然顯著低于S2,但顯著高于其他菌株(p<0.05);LP9含量最低,(5.65±0.25)mg/L,顯著低于其他菌株(p<0.05)。Routray等[24]指出乙醛含量高于8 mg/L時,酸乳才具有良好的風味,超過30 mg/L時發酵乳會產生不愉快的氣味。S2顯示出良好的產乙醛特性。

從表4結果來看,菌株產丁二酮的含量在3～19 mg/L,B14、LP9、LC6冷藏1 d后丁二酮含量出現最大值,繼續冷藏含量均減小。S1、S2在冷藏15 d出現含量最大值,分別為(15.01±0.98)、(19.12±0.33)mg/L,冷藏第20 d時有下降趨勢。凝乳完成時S2丁二酮含量顯著高于其他4株菌株(p<0.05),為(15.06±1.01)mg/L。冷藏20 d中,S1、S2產丁二酮含量存在顯著性差異(p<0.05),顯著高于其他3株菌,S2產丁二酮能力最強。周海珍[25]測定了從傳統乳制品中分離獲得的單菌株產丁二酮的能力,發現嗜熱鏈球菌產丁二酮能力最強。這與本實驗結果相符。Ao等[26]從甘孜和阿貝地區分離的優良乳酸菌產丁二酮含量最高為1.33 mg/L之間,明顯低于本實驗中菌株產丁二酮的含量。S2是一株具有良好產香特性的菌株。

表3　不同菌株發酵乳中乙醛含量測定結果(mg/L)Table 3　Determination of acetaldehyde content during yoghurt fermentation(mg/L)

注:同行不同小寫字母表示差異顯著,p<0.05,表4同。

表4　不同菌株發酵乳中丁二酮含量測定結果(mg/L)Table 4　Determination of diacetyl content during yoghurt fermentation(mg/L)

3　結論

采用PCR-DGGE和RAPD技術與傳統培養方法相結合的方式對云南傳統發酵乳制品乳扇中的微生物進行了分離和鑒定。發現乳扇中主要存在的微生物種類是嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌,經分離和RAPD鑒定,共得到了嗜熱鏈球菌2株、保加利亞乳桿菌1株、副干酪乳桿菌1株、干酪乳桿菌1株。隨后,對5株菌發酵特性進行評價,嗜熱鏈球菌S1、S2產酸速度快且后酸化速度慢;保加利亞乳桿菌具有良好的產黏特性;嗜熱鏈球菌S2同樣具有良好的產香性能,冷藏過程中產乙醛與丁二酮的量均顯著高于其他菌株。通過以上實驗,可以看出S1、S2和B14是發酵性能良好的乳酸菌,具有制備乳制品發酵劑的開發潛力,為今后自主研發菌株復合發酵劑提供支持。

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PCR-DGGE analysis of lactic acid bacteria and fermentation characteristics of strains isolated from dairy fan

HOU Yu1,FAN Jin-bo1,*,ZHANG Ming2,*,ZHAO Liang3,4,REN Fa-zheng3,4,WANG Jing-xuan3,4,LI Qiu-yan3,4

(1.College of Food Science and Technology,Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China;2.School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China;3.Key Laboatory of Functional Dairy,China Agricultural Univeristy,Beijing 100083,China;4.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Animal Product,China Agricultural Univeristy,Beijing 100083,China)

Traditional dairy products are rich in microbial resources. Isolation of specfic strains and exploration of their ability are the key steps to successfully use them in application. In this study,the polymerase chain reaction denaturing gradient gelelectrophoresis(PCR-DGGE)to confirm the miroflora in dairy fan was used. And using randomly amplified polymorphic DNA(RAPD)and traditional method,all strains detected by PCR-DGGE were successfully isolated. These incluedStreptococcusthermophilusS1 S2,Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus B14,Lactobacillusparacaseisubsp paracasei LP9,LactobacilluscaseLC6. The fermentation characteristics of 5 strains of bacteria were evaluated. It was found that S1 and S2 had high acid production rate and low post acidification degree,B14 had excellent viscosity characteristics and S2 had an excellent ability to produce fragrant. Finally,S1,S2 and B14 were ascertained that they were potential strains with excellent fermentation properties.

dairy fan;lactic acid bacteria;PCR-DGGE;RAPD;isolation;fermentation characteristics

2016-01-22

侯宇(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：農產品加工與貯藏，E-mail：houyu4166@163.com。

范金波(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物化學，E-mail：jinbo_fan@hotmail.com。

張明(1983-)，男，博士，講師，研究方向：益生菌，乳品科學，E-mail：zhangming@th.btbu.edu.cn。

北京市自然科學基金項目(6154022)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)14-0181-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.028