響應面法優化植物乳桿菌高密度發酵參數

周金雨,龐雪輝,吳　桐,張秋雪,孟祥晨

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

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響應面法優化植物乳桿菌高密度發酵參數

周金雨,龐雪輝,吳桐,張秋雪,孟祥晨*

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

本研究應用響應面法優化植物乳桿菌KLDS 1.0391的高密度發酵參數。以玉米漿粉為培養基,活菌數為指標,在單因素實驗基礎上,采用中心組合實驗設計優化發酵溫度、發酵pH以及接種量。結果發現三個因素對發酵液中活菌數影響大小依次為:發酵溫度>接種量>pH;獲得的最優發酵參數為:發酵溫度為34.7 ℃、pH為6.2、接種量為3.1%。在此條件下,發酵11 h后,發酵液中的活菌數達到9.58 lg CFU/mL,與模型預測值的相對誤差為1.33%,差異不顯著。說明所建立的模型能夠較好地反映實際發酵情況。

植物乳桿菌,響應面,高密度培養,發酵條件優化

植物乳桿菌是常用的益生菌之一,在發酵乳制品、肉、蔬菜和飼料等中應用廣泛,通常作為發酵劑或者附屬發酵劑使用,植物乳桿菌的高密度發酵是生產植物乳桿菌粉進行應用的前提。由于乳酸菌對環境和營養的需求比較苛刻,因此適宜的培養基和發酵條件對菌種的良好生長至關重要。影響乳酸菌生長的條件很多,包括發酵溫度、pH、接種量、溶氧量等。針對乳酸菌及其代謝產物(如乳酸、細菌素等),多采用分批或分批補料方式發酵[1-7],Hwang等人曾使用分批補料方法發酵植物乳桿菌LP02,使細胞干重從2.53 g/L達到10.12 g/L[8]。Hwang等人將葡萄糖、酵母膏和玉米漿作為高密度培養基的成分,并對其進行了優化,使植物乳桿菌Pi06的細胞干重達到8.94 g/L[9]。Zixing Dong等人對唾液乳桿菌BBE 09-18高密度培養基(碳源、氮源和生長因子)等進行了優化,最終選擇葡萄糖、酵母膏和吐溫-80作為培養基的主要成分,使其最終菌濃度達到9.77 log CFU/mL[10]。上述這些研究通過優化培養基和發酵參數提高了發酵時的菌體密度。在這些研究中,大多使用MRS培養基[9-12]進行發酵,發酵參數也基本設定為:發酵溫度37 ℃、發酵pH為6.0、接種量3%[13-14],采用這樣的條件,發酵后的活菌數在9.53[15]～12.48 lg CFU/mL[16]范圍內。雖然MRS培養基能夠獲得比較好的發酵效果,但是在成本和處理方便性等方面不及天然培養基,而目前針對植物乳桿菌發酵用的天然培養基發酵時間長且報道很有限。

本實驗研究的植物乳桿菌KLDS 1.0391是分離自內蒙古傳統發酵乳制品—“焦克”的一株乳酸菌,能代謝產生對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抑制作用的細菌素[17],可以作為生物保護菌種用于食品生產。以直投式發酵劑形式使用時,需經過高密度發酵、濃縮、干燥等環節,這些環節都會影響最終菌粉的活力。因此針對具有工業化應用潛力的菌株進行發酵參數的優化對于產品的開發至關重要。本課題組前期優化出了一種用于該菌發酵的天然培養基——玉米漿粉,本研究以玉米漿粉為培養基,進一步優化發酵工藝參數。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌KLDS 1.0391乳品科學教育部重點實驗室(東北農業大學);玉米漿粉山東省濟寧市雙華工貿有限公司;其他試劑均為分析純。

KRH-BIO300型發酵罐控制系統江蘇科海生物工程設備有限公司;HIRAYAMA HVE-50型高壓滅菌器日本HIRAYAMA公司;BCN1360型生物潔凈工作臺上海佳勝實驗設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌種的活化與培養植物乳桿菌KLDS 1.0391于-80 ℃冰箱中冷凍保存,使用前將凍存菌種接種于MRS液體培養基中,活化傳代2次,于37 ℃培養16 h,然后劃線培養,37 ℃培養48 h,挑取單菌落,繼續液體培養。

1.2.2菌落總數的測定采用平板菌落計數法[18]。

1.2.3發酵培養基的制備配制4%(w/v)的玉米漿粉溶液6 L,放入10 L發酵罐中,然后添加2%乳糖,121 ℃滅菌15 min后,降至發酵溫度后進行發酵。

1.2.4發酵條件的優化

表1　Central composite實驗因素水平及編碼Table1　Codes and levels of factors in central composite design

1.2.4.1單因素實驗將1.2.3制備的培養基,pH調為6.0,以3%接種量接種發酵罐,發酵溫度分別設為32、34、36、38和40 ℃。發酵11 h后,放罐,取樣,測定菌落總數；pH調為6.0,發酵溫度為37 ℃,接種量分別設為1%、2%、3%、4%和5%。發酵11 h后,放罐,取樣,測定菌落總數；將1.2.3制備的培養基,發酵溫度為37 ℃,接種量為3%,培養基pH分別設為5.0、5.5、6.0、6.5和7.0。恒pH發酵11 h后,放罐,取樣,測定菌落總數。

1.2.4.2響應面優化實驗根據單因素實驗結果,得出的最佳水平,設計三因素五水平的響應面優化實驗(見表1),以發酵溫度(A)、接種量(B)和pH(C)為自變量,以菌落總數(R)為響應值,進行中心組合實驗設計。

1.3數據處理

每個實驗重復3次,運用Design-Expert 8.0.6和Microsoft Excel 2003軟件進行數據分析。

2　結果與分析

2.1發酵條件的優化

2.1.1單因素實驗

2.1.1.1發酵溫度植物乳桿菌KLDS 1.0391在34 ℃時進行發酵,獲得的活菌數最高,偏離該溫度時,活菌數均下降(圖1)。發酵溫度會直接影響菌體細胞內酶、RNA等的活性。溫度低時,會降低酶活力,引起細胞膜流動性的變化,從而影響菌體的正常生長。溫度高時,會使細胞內蛋白質變性,影響RNA、核糖體等大分子的穩定性。因此,在32～40 ℃范圍內選擇實驗點進行響應面實驗設計。

圖1　發酵溫度對植物乳桿菌KLDS 1.0391活菌數的影響Fig.1　Effect of fermentation temperature on total number of colonies by Lactobacillus plantarum KLDS 1.0391

2.1.1.2發酵pH發酵pH5.5時,植物乳桿菌的活菌數最大,其余均低于該值(圖2)。發酵pH過高,影響酶的活性,抑制菌體中某些酶的活性,并且還影響細胞膜所帶電荷的狀態,改變細胞膜的通透性,影響微生物對營養物質的吸收和代謝產物的排泄,從而阻礙菌體的生長。發酵pH過低,菌體受酸脅迫的影響較大,所以菌體生長緩慢。因此,在pH5.0～7.0范圍內選擇實驗點進行響應面實驗設計。

圖2　發酵pH對植物乳桿菌KLDS 1.0391活菌數的影響Fig.2　Effect of fermentation pH on total number of colonies by Lactobacillus plantarum KLDS 1.0391

2.1.1.3接種量接種量為3%進行發酵時,獲得的活菌數最高,其余均低于該值(圖3)。接種量過高,菌體生長不佳,可能是因為在發酵初始階段培養基中的營養物質不能滿足大量菌體生長的需求。因此在1%～5%的接種量范圍內選擇實驗點進行響應面實驗設計。

圖3　接種量對植物乳桿菌KLDS 1.0391 發酵后活菌數的影響Fig.3　Effect of inoculation on total number of colonies by Lactobacillus plantarum KLDS 1.0391

表3　響應面二次回歸模型的方差分析Table 3　Analysis of variance for response surface quadratic regression equation

注:“*”表示影響顯著(p<0.05),“**”表示影響極顯著(p<0.01)。

表2　響應面實驗設計及結果Table 2　Design and result of response surface

對上述回歸方程分析(表3),發酵溫度(A)的影響達到極顯著,發酵溫度、接種量的交互項(AC)和A2影響顯著,其他均不顯著。各因素對發酵活菌數影響的大小順序為:發酵溫度(A)>接種量(C)>pH(B)。

Expert 8.0.6軟件對各因素及其之間的交互作用進行分析(僅列出交互作用顯著項見圖4),發現3個響應曲面均為開口向下的凸形曲面,每個響應面都有極高值。通過各因素之間的交互作用發現,發酵溫度(A)與pH(B)之間的交互作用對活菌數的影響最小,發酵溫度(A)與接種量(C)之間的交互作用影響則最大。

圖4　發酵溫度與接種量交互作用 對菌落總數影響的響應面圖Fig.4　Response surface graph of fermentation temperature and inoculation on total number of colonies

通過軟件分析,獲得以玉米漿粉為發酵培養基時,高密度發酵參數如下:發酵溫度34.70 ℃,發酵pH6.18,接種量3.13%,在此條件下,活菌數的預測值為9.71 lg CFU/mL。考慮到實際的可操作性,設定發酵溫度為34.7 ℃,發酵pH為6.2,接種量為3.1%,在此條件下進行發酵,獲得的發酵活菌數為9.58 lg CFU/mL,與理論值相對誤差為1.33%,說明實驗結果與模型符合良好。

2.2發酵時間的確定

由圖5可知,1～6 h為發酵的遲滯期,6～11 h為發酵的對數生長期,之后進入穩定期,確定發酵時間為11 h,此時,植物乳桿菌KLDS 1.0391的菌落總數達到9.58 lg CFU/mL。與已經發表的文獻對比發現,該水平能夠達到采用MRS進行發酵的水平(9.53 lg CFU/mL)[17],雖然與目前已知的最高水平有一定差距[16],但是在培養基成本與處理方式等方面存在一定優勢。

圖5　以玉米漿粉為培養基時的發酵時間確定Fig.5　Determine fermentation time of corn steep powder medium

3　結論

以玉米漿粉為發酵培養基,通過響應面法優化獲得植物乳桿菌KLDS 1.0391的發酵條件為:發酵溫度34.7 ℃,pH6.2,接種量3.1%。在此條件下發酵11 h后,發酵液中活菌數的預測值為9.71 lg CFU/mL,實際發酵測得值為9.58 lg CFU/mL,與模型預測值的相對誤差為1.33%,說明實驗結果與模型符合良好。本研究結果為工業化發酵生產植物乳桿菌KLDS 1.0391奠定了基礎,后續將進一步放大發酵規模來檢驗發酵效果。

[1]Bustos G,Moldes A B,Alonso J L,et al. Optimization of D-lactic acid production byLactobacilluscoryniformisusing response surface methodology[J]. Food Microbiology,2004,21(2):143-148.

[2]Delgado A,López F N A,Brito D,et al. Optimum bacteriocin production byLactobacillusplantarum17.2b requires absence of NaCl and apparently follows a mixed metabolite kinetics[J]. Journal of Biotechnology,2007,130(2):193-201.

[3]Desai K M,Akolkar S K,Badhe Y P,et al. Optimization of fermentation media for exopolysaccharide production fromLactobacillusplantarumusing artificial intelligence-based techniques[J]. Process Biochemistry,2006,41(8):1842-1848.

[4]Li C,Bai J,Cai Z,et al. Optimization of a cultural medium for bacteriocin production by Lactococcus lactis using response surface methodology[J]. Journal of Biotechnology,2002,93:27-34.

[5]Mu W,Chao C,Li X,et al. Optimization of culture medium for the production of phenyllactic acid byLactobacillussp. SK007[J]. Bioresource Technology,2009,100(3):1366-1370.

[6]Tari C,Ustok F I,Harsa S. Optimization of the associative growth of novel yoghurt cultures in the production of biomass,β-galactosidase and lactic acid using response surface methodology[J]. International Dairy Journal,2009,19(4):236-243.

[7]Tsapatsaris S,Kotzekidou P. Application of central composite design and response surface methodology to the fermentation of olive juice byLactobacillusplantarumandDebaryomyceshansenii[J]. International Journal of Food Microbiology,2004,95(2):157-168.

[8]Hwang C F,Chen J N,Huang Y T,et al. Biomass production ofLactobacillusplantarumLP02 isolated from infant feces with potential cholesterol-lowering ability[J]. African Journal of Biotechnology,2011,10(36):7010-7020.

[9]Hwang C F,Chang J H,Houng J Y,et al. Optimization of medium composition for improving biomass production ofLactobacillusplantarumPi06 using the Taguchi array design and the Box-Behnken method[J]. Biotechnology & Bioprocess Engineering,2012,17(4):827-834.

[10]Dong Z,Gu L,Zhang J,et al. Optimisation for high cell density cultivation ofLactobacillussalivariusBBE 09-18 with response surface methodology[J]. International Dairy Journal,2014,34(2):230-236.

[11]趙玉鑒,李盛鈺,趙玉娟,等. 益生性植物乳桿菌C88的高密度培養條件優化研究[J]. 中國乳品工業,2014,42(1):7-10.

[12]李冬華. 直投式植物乳桿菌發酵劑生產工藝及應用的研究[D].廣州:華南理工大學,2010.

[13]Krzywonos M,Eberhard T. High density process to cultivateLactobacillusplantarumbiomass using wheat stillage and sugar beet molasses[J]. Electronic Journal of Biotechnology,2011,14(2):1-9.

[14]Horn S J,Aspmo S I,Eijsink V G H. Growth ofLactobacillusplantarumin media containing hydrolysates of fish viscera.[J]. Journal of Applied Microbiology,2005,99(5):1082-1089.

[15]梁璋成,何志剛,任香蕓,等. MLF植物乳桿菌R23培養基優化[J]. 福建農業學報,2009,24(6):570-574.

[16]Jurado-Gámez H,Ramírez C,Aguirre D. Fermentation kinetics ofLactobacillusplantarumat a rich culture medium as a potential probiotic[J]. Veterinariay Zootecnia,2013,7(2):37-53.

[17]貢漢生. 植物乳桿菌KLDS 1.0391所產細菌素的分離純化與部分特性[D].哈爾濱:東北農業大學,2009.

[18]李二衛. 食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定方法的探討[J]. 中國衛生檢驗雜志,2010(8):1940-1941.

Optimization of high-density fermentation conditions forLactobacillusplantarumby response surface methodology

ZHOU Jin-yu,PANG Xue-hui,WU Tong,ZHANG Qiu-xue,MENG Xiang-chen*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In this study,response surface methodology was applied to optimize high density fermentation parameters forLactobacillusplantarumKLDS 1.0391. Central composite design was used to optimize fermentation temperature,fermentation pH and inoculation following the single factor tests. Corn steep powder was used as fermentation medium and the total number of viable bacteria was used as the main indicator. The results showed that the influence of three factors on the number of viable bacteria in the fermentation broth was in order as follows:fermentation temperature>inoculation>fermentation pH. The number of viable bacteria achieved 9.58 lg CFU/mL under the optimum fermentation parameter which included fermentation temperature of 34.7 ℃,fermentation pH of 6.2,inoculation of 3.1% and fermentation time of 11 h. There’s no significant difference between the results obtained according to optimum conditions and the predicted value,and the relative error was 1.33% between them. The established model can effectively reflect the actual fermentation conditions.

Lactobacillusplantarum;response surface method;high-density culture;fermentation conditions optimization

2015-12-25

周金雨(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail：zjy984697957@outlook.com。

孟祥晨(1970-)，女，博士，教授，研究方向：食品微生物與生物技術，乳品科學與技術，乳酸菌與益生菌的功能及應用等，E-mail：xchmeng@163.com。

TS201.1

A

1002-0306(2016)14-0206-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.033