四環素分子印跡電化學傳感器的制備及快速檢測牛奶和豬肉中四環素類藥物殘留

高　林,高文惠，*

(1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050000;2.河北省發酵工程技術研究中心，河北石家莊 050000)

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四環素分子印跡電化學傳感器的制備及快速檢測牛奶和豬肉中四環素類藥物殘留

高林1,2,高文惠1,2，*

(1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050000;2.河北省發酵工程技術研究中心，河北石家莊 050000)

以四環素(TC)為模板分子,鄰苯二胺(OPD)為功能單體,在磷酸緩沖液中采用電聚合的方法在玻碳電極表面制備了能夠特異識別模板分子及其結構類似物的分子印跡電化學傳感器。實驗選用含1 mol/L KCl及5 mmol/L K3[Fe(CN)6]的HAc-NaAc緩沖液為表征溶液,應用差分脈沖伏安法(DPV)和循環伏安法(CV)研究了傳感器的電化學響應特性,并優化制備與檢測條件。結果表明,在最佳條件下,DPV峰值電流差與四環素及其結構類似物土霉素和鹽酸強力霉素在0.002～0.02 mmol/L 濃度范圍內線性關系良好,檢出限在6.0×10-7～7.5×10-7mol/L之間。傳感器在H2SO4-甲醇混合液中可再生,且具有良好的穩定性,對四環素以及結構類似物具有良好的選擇性。采用該傳感器對實際樣品牛奶和豬肉中四環素、土霉素和鹽酸強力霉素進行檢測,加標回收率在82.8%～97.4%之間,相對標準偏差(RSD)≤4.43%。該傳感器操作簡便、檢測快速靈敏、成本低,穩定性好,有良好的應用前景。

四環素,分子印跡聚合物,電化學傳感器,快速檢測

四環素類抗生素可利用放線菌發酵或半合成的方法生產,是一類廣譜抑菌劑,高濃度時具有殺菌作用,對多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有較好的抑制和殺滅效果。四環素類藥物不僅可以作為獸藥對畜禽類、魚類疾病起到預防及治療的作用,而且可以作為飼料添加劑促進畜禽成長,因此被廣泛應用于畜禽、水產養殖業中[1]。而四環素類藥物濫用,會在動物源食品中造成殘留,引起人體過敏性反應和抗藥性等。因此,食品中四環素類藥物殘留檢測引起人們關注。

目前,檢測四環素類藥物殘留的方法主要包括高效液相色譜法[2-3]、高效液相色譜-質譜聯用法[4-5]、微生物法[6]、免疫法[7]、毛細管電泳法[8]等。色譜及色譜-質譜聯用方法是目前檢測四環素最常用的方法,但該方法儀器昂貴、樣品處理要求高,需要專業操作人員;微生物法可以實現大量樣品的檢測,但假陽性幾率較大且耗時長,不適合定量分析;免疫分析法檢測快速,適合現場檢測,但生物性抗體不穩定,重現性較差;毛細管電泳法分離效率高,樣品處理簡單,但重現性較差,靈敏度較低。

分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymer,MIP)具有較高的靈敏度、較強的抗干擾能力、良好的穩定性以及較強特異性識別能力,在電化學傳感器的制備方面得到廣泛的應用[9]。基于分子印跡聚合物膜的電化學傳感器不僅具有MIP的優點,而且具有造價低廉、操作簡單、響應快速以及易于實現自動化等優勢,近年來得到人們的廣泛關注。有關四環素分子印跡電化學傳感器的研究雖已有報道[10-11],但主要是關于傳感器制備和性能研究或針對模板物質的測定,而對其結構類似物的測定鮮有報道。本研究電聚合鄰苯二胺,并優化制備與檢測條件,制備了檢測四環素及其結構類似物的分子印跡電化學傳感器。該傳感器選擇性好,靈敏度高,響應迅速,在食品安全快速檢測中有良好應用前景。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

伊利純牛奶,豬后座肉均為市售。

LK98BII型電化學工作站天津市蘭立科化學電子高技術有限公司;三電極系統(CHI104玻碳電極(直徑3 mm),CHI115鉑絲電極,CHI111 Ag/AgCl電極)、拋光材料(氧化鋁粉、麂皮)天津艾達恒晟科技發展有限公司。

四環素(TC)純度98%,土霉素純度98%,安徽酷爾生物工程有限公司;鄰苯二胺(OPD)純度98%,鹽酸強力霉素純度98%,氯霉素純度98%,阿拉丁試劑有限公司;K3[Fe(CN)6]、氯化鉀、甲醇、濃硫酸、醋酸鈉、冰乙酸、無水乙醇、高氯酸、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均為分析純,實驗用水為超純水。

1.2玻碳電極的預處理

將玻碳電極(GCE)依次用0.5、0.3、0.05 μm粒度的α-Al2O3粉在麂皮表面研磨拋光成鏡面,用超純水沖洗干凈后再依次于0.5% HNO3、超純水、無水乙醇中超聲清洗(每次5～6 s)1 min;氮氣吹干,再將電極置于0.5 mol/L H2SO4溶液中,采用電化學方法對電極進行活化處理,以達到電極最佳狀態,取出電極再次用超純水沖洗后氮氣吹干;然后將其置于表征溶液(1 mol/L KCl及5 mmol/L K3[Fe(CN)6]的HAc-NaAc緩沖液)中采用循環伏安法循環掃描。重復以上操作直至對電極表征得到對稱且可逆的氧化還原峰,峰電位差在85 mV以下,最后取出電極待用[12]。

1.3四環素分子印跡及非分子印跡電化學傳感器的制備

稱取0.0086 g鄰苯二胺(OPD)溶于磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.2)中,加入2 mL 10 mmol/L四環素溶液混合均勻,超聲10 min,通氮氣除氧5 min。將三電極體系置于配制好的含有TC與OPD的磷酸緩沖液,采用循環伏安法掃描15圈,掃描電位為0～0.8 V,掃描速度為50 mV/s,在玻碳電極表面得到一層致密的不導電的聚合物薄膜,氮氣吹干,即制得嵌有四環素分子的印跡聚合物膜電極(TC-MIP-OPD/GCE),將此電極置于0.5 mol/L H2SO4-甲醇(1∶5,v/v)溶液中浸泡10 min,洗脫掉鑲嵌在聚合物薄膜內的四環素模板分子,即成功制得對四環素分子敏感的印跡聚合物膜電極(MIP-OPD/GCE)。非分子印跡聚合膜電極(NMIP-OPD/GCE)的制備除不添加模板分子四環素外,其他條件均與印跡電極的制備完全相同。

1.4電化學測量

實驗過程中,在室溫下用CV和DPV法優化實驗條件并表征電化學傳感器性能,將三電極系統置于含電活性探針K3[Fe(CN)6]的溶液中測量電極的電流響應。設定測量參數如下:CV,掃描電位和掃描速率分別為-0.3～0.7 V和50 mV/s;DPV,起止電位為-0.2～0.6 V、電位增量0.004 V、脈沖寬度0.05 V、脈沖幅度0.05 V、脈沖間隔0.1 s。每次測量后,將工作電極浸泡在0.5 mol/L H2SO4-甲醇(1∶5,v/v)溶液中洗脫,除去模板分子后用超純水沖洗電極,氮氣吹干,再進行下一次測量。

1.5線性關系和檢出限

配制不同濃度的四環素標準溶液(0.0002～0.08 mmol/L),采用DPV對洗脫后的分子印跡聚合物膜電極在空白溶液與配制好的不同濃度四環素標準溶液吸附后的電流響應進行測定,以ΔI為縱坐標,以四環素標準溶液濃度為橫坐標,作圖得出二者線性范圍,以S/N=3確定目標物質的檢出限。用上述同樣方法研究傳感器對土霉素和鹽酸強力霉素標準溶液檢測的線性關系和檢出限。

1.6樣品處理

牛奶樣品的前處理:取5 mL市售純牛奶置于50 mL離心管中,加入10 mL 5% Na2EDTA-McIlvaine提取劑,振蕩混勻2 min,超聲提取10 min,4000 r/min離心10 min,取上清液,殘渣再次加入10 mL提取劑按上述方法處理,合并兩次上清液,并用提取劑定容至25 mL,過膜待用。

豬肉樣品的前處理:取5 g市售豬肉,切碎后置于三角瓶中,加入5% HClO4溶液20 mL,振蕩混勻,超聲提取10 min后移入50 mL離心管中,4000 r/min離心10 min,取上清液,殘渣再次加入15 mL提取劑按上述方法處理,合并兩次上清液,濃縮后用提取劑定容至25 mL,經0.45 μm濾膜過濾待用[12]。

2　結果與討論

2.1四環素分子在裸玻碳電極上的電化學行為

四環素電活性的大小影響到其檢測方法的選擇,若四環素分子電活性較強則可采用電化學方法直接對其進行檢測,否則采用電化學的方法對其進行檢測很難實現。實驗考察了四環素的電活性,圖1為1 mmol/L四環素分子在裸電極上循環伏安曲線圖。由圖可以看出,在聚合前2圈時循環伏安曲線出現并不明顯的氧化與還原峰,隨后逐漸消失,表明四環素電活性較小,且在聚合電位下分解成非電活性的物質,因此不宜直接采用電化學的方法對四環素分子進行檢測。因此實驗采用通過制備四環素分子印跡電化學傳感器間接對四環素類藥物進行檢測。

圖1　四環素在PBS緩沖液(pH7.2)中的循環伏安曲線Fig.1　Cyclic voltammograms for 1 mmol/L TC on GCE in PBS(pH7.2)

2.2功能單體的選擇

實驗采用電聚合的方法制備四環素分子印跡聚合物膜電極。電聚合是一種利用電化學方法促使功能單體在電極表面直接進行聚合的方法,可利用此類方法進行聚合的功能單體范圍較廣[13]。實驗依據模板分子與功能單體以氫鍵鍵結合的原則進行功能單體的篩選,鄰苯二胺和吡咯作為此類功能單體成功用于實驗的報道較多[14-16]。

實驗研究了目前較常用的鄰苯二胺作為功能單體進行電聚合的性質。聚合曲線如圖2所示。

圖2　鄰苯二胺在磷酸緩沖液中(pH7.2)電聚合曲線Fig.2　Cyclic voltammograms of OPD electropolymerization in PBS(pH7.2)

將覆蓋有鄰苯二胺聚合薄膜的玻碳電極置于經除氧處理的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH3.2)中浸泡10 min后,用超純水沖洗,氮氣吹干,對電極進行表征。結果在表征電位-0.3～0.7 V范圍內沒有氧化還原峰出現,且電流強度幾乎為零,表明鄰苯二胺聚合膜在該酸性環境下穩定,適用于電極的修飾,因此,本實驗選擇OPD為電聚合的功能單體。

2.3電聚合制備四環素分子印跡膜

以OPD為功能單體,在模板分子TC存在的情況下,玻碳電極上OPD電聚合過程的CV曲線如圖3所示。由圖可以看出在0.39 V處出現一個明顯的氧化峰,且在聚合的第2圈電流值驟減,并且隨著CV掃描圈數的增加,電流強度逐漸降至接近于0,表明隨著電聚合的進行玻碳電極表面逐漸覆蓋了一層不導電的薄膜,聚合液中OPD無法進一步氧化,電流響應也受到抑制。與圖2相比,圖3未見顯著差異,表明OPD的電聚合不會因為TC的存在而受到干擾。

圖3　4 mmol/L四環素存在情況下OPD在磷酸緩沖液中(pH7.2)電聚合曲線Fig.3　Cyclic voltammograms of OPD electropolymerization in PBS(pH7.2)under the presence of 4 mmol/L tetracycline

2.4洗脫劑及洗脫時間的選擇

實驗分別考察了乙醇-水(1∶1,v/v)、0.5 mol/L H2SO4-甲醇(1∶5,v/v)、0.5% HNO3作為洗脫劑時,對聚合物薄膜中模板分子的洗脫效果。結果發現0.5% HNO3、乙醇-水(1∶1,v/v)不能將模板分子洗脫,或對模板分子洗脫效果不佳;而采用0.5 mol/L H2SO4-甲醇(1∶5,v/v)為洗脫劑時,洗脫效果良好。

隨后,實驗對最佳洗脫時間做了考察,對比了TC-MIP-OPD和NMIP-OPD,在相同洗脫條件下,隨洗脫時間的增加,二者響應電流的變化規律。結果如圖4所示。從圖中可以看出,NMIP-OPD在洗脫過程中始終無電流響應;TC-MIP-OPD隨洗脫時間的延長,響應電流值逐漸增大,表明TC-MIP-OP中模板分子逐漸被洗脫,印跡空穴增多,電活性探針透過空穴到達電極表面產生響應電流逐漸增大,當洗脫時間為10 min時,峰電流值達到平衡。因此,選擇10 min作為最佳洗脫時間。

圖4　響應峰電流隨模板分子洗脫時間的變化Fig.4　The change of response current alongwith the elution time of template molecules

2.5吸附時間的確定

吸附時間是評價傳感器性能的一個重要的依據,選取1 mmol/L的四環素溶液做靜置吸附實驗,采用DPV,每2 min即在探針溶液中測量一次,峰值電流變化如圖5所示。由圖可以看出,吸附時間在8 min前,隨著吸附時間的增加,峰電流值逐漸下降,表明隨著空穴被模板分子重新占據,與電極表面接觸的電化學活性探針的量逐漸減少,當吸附時間超過8 min后,峰電流值達到平衡。因此,8 min為最佳吸附時間。

圖5　響應峰電流隨吸附時間的變化Fig.5　The change of response current alongwith adsorption time

2.6分子印跡效應

實驗分別采用CV和DPV兩種方法在探針溶液中對不同電極進行表征,圖6和圖7中表征曲線顯示了電流響應變化情況。由圖6中DPV表征曲線可知裸電極(曲線a)峰電流值較大,說明探針離子幾乎沒有阻礙的在裸電極發生氧化還原反應;而分子印跡聚合物膜電極未洗脫模板分子(曲線d)時,在電極表面幾乎沒有電流響應,這說明附著在電極表面的聚合物膜不導電,且阻礙了電活性探針離子向電極表面的傳遞,抑制了氧化還原反應;分子印跡聚合物膜電極洗脫模板分子后(曲線b),峰值電流較洗脫前有大幅度提高,這是由于分子印跡聚合物膜上模板分子被洗脫后,探針離子可通過印跡空穴與電極表面接觸,發生電化學反應;電極洗脫模板分子后再吸附(曲線c)與曲線b相比較,峰值電流下降,說明再吸附后,分子印跡聚合物膜上的空穴一部分被模板分子占據,探針離子通過膜的數量減少,響應電流強度減小。CV(圖7)和DPV表征效果一致。

圖6　不同電極在表征溶液(pH3.2)中差分脈沖伏安圖Fig.6　Differential pulse voltammograms of different electrodes in the characterization solution(pH3.2)

圖7　不同電極在表征溶液(pH3.2)中循環伏安圖Fig.7　Cyclic voltammograms of different electrodes in the characterization solution(pH3.2)

2.7分子印跡聚合物膜的選擇性研究

選擇鹽酸強力霉素、土霉素、氯霉素作為干擾物質對分子印跡聚合膜電極進行選擇性研究,采用DPV考察了分子印跡聚合膜電極對于相同濃度(0.01 mmol/L)下四環素及干擾物質的電流響應,計算相對峰值電流變化(Δi)情況,Δi表示分子印跡聚合物膜吸附目標物質前后峰值電流的差值,Δi越大,表明傳感器對目標物質選擇性越高。實驗結果如圖8所示,該傳感器對模板分子四環素電流響應值最大,其次是其結構類似物鹽酸土霉素、鹽酸強力霉素,而對氯霉素響應很微弱。這是由于鹽酸土霉素和鹽酸強力霉素在分子結構上與四環素較為相似,因此可以進入到印跡空穴中與功能單體結合,說明該傳感器能夠對四環素及其結構類似物進行測定;而氯霉素與模板分子的結構差異較大,所以傳感器對氯霉素選擇性較差,即氯霉素分子不會進入到印跡空穴中對四環素的測定形成干擾。由此可見,該傳感器選擇性好。

圖8　分子印跡聚合膜電極的選擇性Fig.8　Selectivity of the imprinted electrode 注:A:四環素;B:鹽酸強力霉素;C:土霉素;D:氯霉素。

2.8線性關系與檢出限

表1　三種四環素類藥物分子的線性關系及檢出限

表2　樣品的回收率和精密度(n=5)

按照1.5方法研究目標物質的線性范圍與檢出限,結果如圖9～圖11所示。結果表明,3種四環素類藥物在一定濃度范圍內與ΔI均呈線性關系,其線性方程、線性相關系數以及檢出限如表1所示。由表1可以看出,該傳感器線性關系良好,靈敏度高。

圖9 　不同濃度的四環素標準溶液差分脈沖伏安圖Fig. 9　Differential pulse voltammograms of the different concentration tetracycline standard solutions

圖10　不同濃度的土霉素標準溶液差分脈沖伏安圖Fig.10　Differential pulse voltammograms of the different concentration terramycin standard solutions

圖11　不同濃度的鹽酸強力霉素標準溶液差分脈沖伏安圖Fig.11　Differential pulse voltammograms of the different concentration doxycyclinehydrochloride standard solutions

2.9實際樣品的測定

牛奶和豬肉樣品按1.6方法處理,取過膜后待用液各2 mL分別置于電解杯中,并用醋酸緩沖液稀釋至10 mL作為待測樣品溶液。采用本實驗中1.5電化學測量方法對樣品進行檢測,檢測結果為樣品中未檢出四環素及其結構類似物。

2.10回收率和精密度實驗

取上述陰性樣品進行高、低水平的添加回收率實驗。每個水平均做5次平行實驗,采用DPV進行測定,結果如表2所示。由表2可以看出,樣品中3種四環素類藥物的平均回收率(AR)在82.8%～97.4%,相對標準偏差(RSD)≤4.43%。

2.11傳感器重現性與穩定性

實驗對該傳感器重現性進行了研究,同樣條件下使用傳感器20次,所得ΔI的RSD≤6.42%(n=20),傳感器性能基本無衰減,表明該傳感器重現性好。以四環素為例對傳感器進行穩定性研究,將電極在4 ℃下保存,一周后用傳感器在最佳檢測條件下對0.01 mmol/L四環素標準溶液進行測定,其響應值為初始值的95.3%,兩周后其響應值為初始值的90.1%,三周后其響應值為初始值的88.5%,四周后其響應值為初始值的84.6%,表明該傳感器的穩定性好。

3　結論

實驗采用電聚合鄰苯二胺的方法制備了一種具有特異識別性的分子印跡電化學傳感器,并采用CV和DPV研究了傳感器的電化學響應并優化制備條件,研究了傳感器印跡效應及選擇性。實驗對實際樣品中模板物質及其結構類似物均做了加標回收率及精密度實驗。結果表明,該傳感器可用于食品中四環素及其類似物的檢測,且傳感器選擇性及穩定性良好,抗干擾能力強。

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Preparation of tetracycline moleculary imprinting electrochemical sensor and rapid detection of tetracycline residues in milk and pork

GAO Lin1,2，GAO Wen-hui1,2，*

(1.College of Biological Science and Engineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050000,China;2.Center for Fermentation Engineering of Hebei Province,Shijiazhuang 050000,China)

A novel molecular imprinted electrochemical sensor was prepared by electro-polymerization on the surface of a glassy carbon electrode in phosphate buffer solution,and tetracycline was used as template moleculer,o-phenylenediamine(OPD)as functional monomer. The sensor could specifically recognize the template molecule and its analogues. In the experiment,the HAc-NaAc buffer solution containing 1 mol/L KCL and 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]was used as characterization solution,the electrochemical sensor response characteristics were researched,and the preparation and detection conditions of the sensor were optimized by differential pulse voltammetry(DPV)and cyclic voltammetry(CV). The results showed that the sensor had a good selectivity under the optimal conditions,the linear relationships between DPV peak current difference and the concentrations of tetracycline,oxytetracycline and doxycycline hyclate were found in the range of 0.002～0.02 mmol/L with the detection limits between 6.0×10-7and 7.5×10-7mol/L. The sensor in methanol-H2SO4solution was renewable,and had good reproduction,stability and good selectivity to tetracycline and its analogues. The tetracycline,oxytetracycline and doxycycline in real samples,such as milk and pork,were detected by the sensor,the average recoveries were between 82.8% and 97.4%,the relative standard deviations(RSD)were less than 4.43%. This sensor was simple,sensitive,low cost,and had a good stability,which provided it a good application prospect.

tetracycline;molecular imprinting polymer;electrochemical sensor;rapid detection

2015-11-05

高林(1990-)，男，在讀研究生，主要研究方向：食品安全與檢測，E-mail：13933859737@163.com。

高文惠(1963-)，女，博士，教授，研究方向：食品安全控制技術與檢測技術，E-mail：wenhuigao@126.com。

河北省科技計劃項目(16275503D)；河北省食品藥品監督管理局食品藥品安全科技計劃項目(ZD2015015)。

TS201.6

A

1002-0306(2016)11-0299-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.053