丁香有效部位清除超氧陰離子及對LDL糖基化抑制作用

杜余輝,蔡志鵬,江慎華,2,3,*,楊瓊玉,萬　嚴,張良慧,馬海樂,2,曲文娟,2,張愛琳,3

(1.九江學院藥學與生命科學學院,江西九江 332000;2.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇省農產品物理加工重點實驗室,江蘇鎮江 212013;3.天津農學院食品科學與生物工程學院,天津 300384)

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丁香有效部位清除超氧陰離子及對LDL糖基化抑制作用

杜余輝1,蔡志鵬1,江慎華1,2,3,*,楊瓊玉1,萬嚴1,張良慧1,馬海樂1,2,曲文娟1,2,張愛琳1,3

(1.九江學院藥學與生命科學學院,江西九江 332000;2.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇省農產品物理加工重點實驗室,江蘇鎮江 212013;3.天津農學院食品科學與生物工程學院,天津 300384)

為研究丁香對低密度脂蛋白(LDL)的抑制效果,本文通過生物活性追蹤法得到丁香有效部位(乙酸乙酯相),并采用分光光度法和熒光分析法對丁香有效部位清除超氧陰離子自由基(SAR)及LDL糖基化終產物(AGEs)和戊糖素的抑制效果進行了研究。結果表明,濃度為50 μg/mL和100 μg/mL的乙酸乙酯相對SAR清除率最高,分別達46.112%±0.820%和69.168%±2.637%,顯著高于陽性對照(p<0.05),為有效部位。丁香有效部位(500 μg/mL)對AGEs及戊糖素抑制率可達88.328%±0.037%、84.365%±0.302%,顯著高于陽性對照氨基胍(AG)(p<0.01)。本文表明丁香對SAR及LDL糖基化終產物AGEs和戊糖素具有較好的抑制效果,可為后續功能食品研發提供參考。

丁香,超氧陰離子,低密度脂蛋白,糖基化,糖基化終產物

超氧陰離子自由基(Superoxide anion radical,SAR)是一種活性氧,可參與血管功能紊亂的信號傳遞[1-2]，含量過高會導致低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)誘導內皮細胞功能紊亂[3]及晚期糖基化終產物(advanced glycosylation end products,AGEs)形成[4]。戊糖素是已證明的一種特定AGEs熒光產物[5]。體內血糖過高易誘發、促進LDL糖基化修飾,并導致過多SAR及其他活性氧產生[6-7]。植物提取物抑制糖基化修飾活性與其自由基清除及抗氧化性能顯著相關[8]。

LDL是人體血液中運載膽固醇及其酯類的主要轉運體,其糖基化修飾后會產生和累積AGEs,從而導致糖尿病并發癥、細胞和組織損傷[8-9]。因此,研究AGEs抑制劑有望降低因其誘導產生糖尿病并發癥的風險。與人工合成抑制劑相比,很多天然產物對蛋白質糖基化修飾的抑制作用更安全、有效[8,10-11]。

丁香,為桃金娘科植物丁香(EugeniacaryophyllaThunb.)的干燥花蕾,又稱公丁香,被國家列入第一批既是食品又是藥品的名單[12],屬于國家公布的藥食兩用植物[13],具有抑制LDL氧化修飾[12]、抗炎、抗應激、抗菌、抗真菌、抗氧化等眾多功能活性[13]。實驗室前期研究表明,丁香在國家公布的87種藥食兩用材料中多酚含量最高、具有最強的抗氧化活性[14-15],其抗氧化功能的主要物質基礎是黃酮和多酚類化合物[16-17]。

國內外研究結果表明,很多藥用植物的抗糖基化性能對治療糖尿病及其相關并發癥有一定優勢[10,18]。有學者發現,丁香可抑制高密度脂蛋白所含apoA-I[19]及牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)[9]糖基化修飾。而本實驗室在前期工作基礎中發現,乙酸乙酯部位是丁香抗氧化、抑制LDL氧化修飾的有效部位[17,20]。盡管丁香具有很強的抗氧化作用[13,17,20],但是,丁香有效部位對SAR的清除能力及LDL糖基化修飾過程中AGEs產生的抑制效果尚不明確。因此,本文在實驗室前期工作基礎上,對丁香有效部位清除SAR及其對LDL糖基化終產物(AGEs)產生的抑制效果展開研究,以期為后續研發丁香緩解糖尿病并發癥相關功能食品提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

丁香(批號:1409006,生產日期:2014年9月30號),購自江西黃慶仁棧華氏大藥房(江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司分裝),產地廣西。買回后立即粉碎干燥、過40目篩后置冰箱中備用。LDL從健康人血漿中分離得到。肝素鈉(185 U/mg),購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氨基胍鹽酸鹽和疊氮化鈉,購自成都格雷西亞化學技術有限公司,其余化學試劑均為國產分析純或優級純。

DFY-C高速粉碎機溫嶺林大機械公司;DL-5C離心機上海安亭科學儀器廠;UNIC-7200可見分光光度計尤尼柯(上海)公司;SHA-B恒溫振蕩器常州國華電器有限公司;FD-1A-50冷凍干燥機北京博醫康實驗儀器有限公司;RE-52型旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠;PB-10 pH計Sartorius儀器設備有限公司;CT15RT型高速冷凍離心機上海天美生化儀器設備工程有限公司;LS-55熒光/磷光/發光分光光度計美國Perkin Elmer公司。

1.2實驗方法

1.2.1丁香有效部位對SAR清除能力

1.2.1.1丁香不同極性部位及有效部位制備參考文獻[20-21]等方法,稍作修改,具體步驟如下。

稱取200.00 g丁香原料粉末,采用料液比1∶10(g/mL)、溫度60 ℃、水浴振蕩提取2次,提取液合并、濃縮。取1/10體積溶液濃縮、凍干后獲得丁香粗提物。剩余部分加入適量蒸餾水,超聲輔助溶解至懸濁液后,分別采用極性逐漸增大的有機溶劑石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取,最后剩下水相,各萃取液真空濃縮、冷凍干燥后得到丁香粗提物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相干粉,放置干燥箱備用,處理流程如圖1所示。各樣品均采用甲醇溶解至合適濃度待用。

圖1　生物活性追蹤法制備丁香有效部位Fig.1　The preparation of clove effective fraction based on bio-assay guided

1.2.1.2丁香不同極性部位對SAR自由基清除率測定采用文獻[17,22-23]等方法。

取2.7 mL 14.5 mmol/L蛋氨酸,依次加入0.1 mL 3.0 mmol/L乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA),0.1 mL 1.89 mmol/L氯化硝基四氮唑藍(Nitro Blue Tetrazolium Chloride,NBT),1.0 mL不同濃度(50,100 μg/mL)樣液,0.1 mL 39 μmol/L核黃素,振蕩混合均勻。2個20 W熒光燈均勻一致地照射20 min,于波長560 nm處測定吸光度。吸光度越小,清除能力越強。以甲醇代替樣品作空白對照,計算SAR清除率。其中蛋氨酸、EDTA、NBT、核黃素全部由0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.8)配制。SAR清除率計算公式為:

清除率(%)=(1-(A空白-A背景)/(A樣品-A背景))×100

式中:A空白-波長560 nm處空白樣品的吸光度；A樣品-波長560 nm處樣品的吸光度；A背景-波長560 nm處甲醇(背景)不光照的吸光度。

1.2.2LDL制備

1.2.2.1試劑準備沉淀劑A液:0.064 mol/L檸檬酸三鈉溶液(肝素鈉濃度為50000 U/L),用5 mol/L鹽酸溶液,調節pH至5.04;沉淀劑B液:0.064 mol/L檸檬酸三鈉溶液,用5 mol/L鹽酸溶液,調節pH至5.11;磷酸緩沖高鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)溶液:160 g/L NaCl,8.1 mmol/L Na2HPO4·12H2O,1.5 mmol/L KH2PO4,2.7 mmol/L KCl,pH7.4。

1.2.2.2從血漿中沉淀獲得LDL參考文獻[24-26]等方法制備,稍加改進,具體操作如下。

血漿和沉淀劑A液準確按1∶10體積比充分混勻(取新鮮人血漿300 mL和沉淀劑A液3000 mL充分混勻),磁力攪拌30 s混勻,37 ℃溫育靜置15 min;4 ℃ 3000 r/min離心10 min后有淡黃色沉淀析出,去上清。匯集每次離心后的沉淀并加入1500 mL沉淀劑B液混勻,洗滌沉淀,4 ℃ 3000 r/min離心10 min,去上清,獲得LDL沉淀。在LDL沉淀中加入100 mL PBS溶液(pH7.4,含160 g/L NaCl,8.1 mmol/L Na2HPO4·12H2O,1.5 mmol/L KH2PO4,2.7 mmol/L KCl),37 ℃溫育15 min,使LDL沉淀完全溶解后置于再生纖維素透析袋內,用PBS 4 ℃透析24 h(每4小時換一次透析液),即得LDL溶液。以BSA為標準品,采用Lowry’s法測定蛋白濃度,使用PBS溶液稀釋獲得實驗所需濃度,剩余部分4 ℃避光保存。

1.2.3丁香有效部位抑制LDL糖基化修飾作用

1.2.3.1LDL糖基化孵育方法采用Suantawee等[9]方法孵育LDL,稍作修改。

0.9 mL LDL溶液(1 mg/mL)+800 mmol/L葡萄糖+29 mL 0.01 mol/L PBS溶液(pH7.4,包含0.02%疊氮化鈉,1 mmol/L EDTA)+0.1 mL各濃度樣液(0、0.05、0.1 mg/mL),于37 ℃避光孵育4周后進行熒光測定。孵育體系總體積為30 mL,以上所有濃度均為終濃度。丁香有效部位干粉用甲醇溶解,陽性對照AG[27]用蒸餾水溶解。空白對照分別使用等體積的甲醇和蒸餾水代替丁香和AG溶液進行相同操作。

1.2.3.2熒光波長掃描過程中激發和發射波長的確定參考文獻[28]的方法,用LS-55熒光/磷光/發光分光光度計作AGEs激發和發射波長掃描,確定AGEs的激發波長和發射波長(如圖2)。首先,固定激發波長370 nm,同時設定發射波長掃描范圍300～500 nm后作發射波長掃描并確定最佳吸收峰值[28];然后以其最佳吸收峰值為發射波長固定值,同時設定激發波長范圍300～400 nm后掃描激發波長確定其最佳吸收峰;最后確定激發和發射波長340 nm/410 nm測定熒光。

1.2.3.3自然(未修飾)LDL和糖基化修飾LDL熒光波長掃描根據1.2.3.2的結果,固定激發波長340 nm,同時設定發射波長范圍300～500 nm后掃描發射波長[28]。

1.2.3.4總AGEs熒光強度及丁香有效部位對其清除率的測定根據1.2.3.2的結果設定激發波長340 nm和發射波長410 nm測定AGEs的熒光強度。對糖基化終末端產物(AGEs)產生的抑制率測定用以下公式計算:

抑制率(%)=(1-F樣品/F空白)×100

其中:F空白表示不含樣液的熒光強度；F樣品表示含各濃度樣液的熒光強度。

1.2.3.5特定熒光產物-戊糖素熒光強度及丁香有效部位對其清除率的測定戊糖素是一種氨基酸加合物,也是LDL糖基化終產物(AGEs)主要的熒光產物,由賴氨酸、精氨酸和糖類化合物反應產生,在激發波長335 nm和發射波長385 nm有最大熒光吸收[29-30]。對戊糖素抑制率測定可用以下公式計算:

抑制率(%)=(1-F樣品/F空白)×100

其中:F空白表示不含樣液的熒光強度；F樣品表示含各濃度樣液的熒光強度。

2　結果與分析

2.1丁香不同極性部位對SAR清除能力的測定

根據生物追蹤方法[17,20],稱取200 g丁香原料采用圖1所示流程制備獲得丁香不同極性部位,濃縮、凍干成干粉后分別得到粗提物6.2851 g、乙酸乙酯相13.5663 g、正丁醇相5.9182 g、水相7.5379 g。

通過光照核黃素使其還原產生SAR,然后還原NBT生成在波長560 nm有最大吸收的藍色甲臜。樣品在波長560 nm處吸光度越小,SAR清除能力越強[17,23]。丁香不同極性部位(50 μg/mL、100 μg/mL)對SAR清除率的測定結果如圖1所示。

圖1　丁香不同極性部位SAR清除率Fig.1　The superoxide anions scavenging activity of different fractions from clove注：不同字母表示差異顯著(p<0.05).

圖1表明,丁香不同極性部位對SAR均有一定的清除能力。包括兩個陽性對照(BHT和GBE)在內,乙酸乙酯相清除率能力最強。當濃度為50 μg/mL和100 μg/mL時,其清除率分別達46.112%±0.820%和69.168%±2.637%,顯著高于陽性對照GBE(25.828%±0.620%、39.013%±2.131%)和BHT(8.857%±2.878%、19.777%±0.507%)(p<0.05)。

國內外研究結果表明,體內高血糖環境可產生SAR、過氧化氫、羥基自由基等活性氧可導致氧化應激發生[6],過多的SAR產生會促使AGEs累積[6-7]。植物提取物富含多酚和黃酮類化合物,這些成分可通過其清除自由基及抗氧化作用抑制糖基化過程AGEs的產生[8]。上述測定結果發現丁香有效部位具有很強的SAR清除能力。基于SAR清除能力與AGEs產生的抑制作用顯著相關[8],因此,本實驗在此基礎上進一步對丁香有效部位抑制AGEs產生效果進行了相關測定。

2.2丁香有效部位對LDL糖基化終產物AGEs產生的抑制作用

上述分析表明,高血糖環境累積的AGEs易導致很多并發癥的產生[9]。本文對丁香有效部位抑制AGEs及戊糖素產生效果進行了測定,結果如圖4～圖7所示。

2.2.1LDL糖基化終產物(AGEs)熒光掃描LDL糖基化修飾會導致LDL結構、功能的改變及AGEs積累[30]。AGEs含有多種熒光產物,在一定激發和發射波長中有特定最佳吸收峰[31],使用熒光光度計可確定AGEs激發波長、發射波長及熒光強度。LDL糖基化前后熒光掃描及對比結果如圖2、圖3所示。

圖2　LDL糖基化孵育后AGEs激發和發射波長掃描結果Fig.2　The prescan spectrum of excitation/emission wavelengths for samples of AGEs after glycosylation

圖3　LDL糖基化孵育前、后發射波長掃描結果Fig.3　The spectrum of emission wavelengths for samples of nature or glycosylated LDL

由圖2可知,AGEs在激發波長和發射波長分別為340 nm/410 nm時有最佳吸收峰,Sattarahmady等[28]的研究也顯示類似結果。有學者報道,LDL在Ex360/Em430處有特定的熒光吸收[32]。從圖3可以看出,本實驗采用肝素鈉沉淀法獲得的自然LDL熒光最大吸收(360 nm/430 nm)與前人報道[32]相似。LDL糖基化修飾后其最佳吸收峰發生變化,表明糖化LDL與自然LDL的結構發生改變。

2.2.2丁香有效部位對AGEs熒光強度影響及對其產生的抑制效果根據圖2掃描結果,糖基化LDL分別添加丁香有效部位和陽性對照AG共同孵育后對AGEs形成的抑制效果如圖4、圖5所示。

圖4　丁香有效部位及陽性對照對LDL糖基化孵育后 AGEs熒光強度的比較Fig.4　The comparation of fluorescence intensity of AGEs between the effective fraction from clove and positive control after glycosylation注：不同字母表示顯著差異(p<0.01)，圖5～圖7同。

圖5　丁香有效部位及陽性對照對LDL糖基化孵育后 AGEs產生量的抑制效果Fig.5　The inhibition efficiency of AGEs production between the effective fraction from clove and positive control after glycosylation

由圖4和圖5知,丁香有效部位能有效減少AGEs形成,在較低濃度(50 μg/mL和100 μg/mL)時抑制率可達到40.360%±0.184%、48.607%±0.232%,其抑制效果弱于陽性對照AG(53.646%±0.034%、56.152%±0.080%),這表明丁香在較低濃度對AGEs的抑制效果沒有陽性對照AG強。但是,當丁香有效部位濃度升高到500 μg/mL時,其對AGEs的抑制效果顯著性高于AG(p<0.01),達88.328%±0.03% AG抑制率比丁香有效部位抑制率低9.722%。

2.2.3丁香有效部位對LDL糖基化產物—戊糖素熒光強度影響及對其產生的抑制效果戊糖素是LDL糖基化過程中產生的一種具特定熒光吸收的氨基酸加合物,也是生物組織交聯、蛋白質老化、糖氧化應激等發生的標志[29]。丁香和AG對戊糖素產生的抑制作用如圖6、圖7所示。

圖6　丁香有效部位及陽性對照對LDL糖基化孵育后 戊糖素熒光強度的比較Fig.6　The comparation of fluorescence intensity of pentosidines between the effective fraction from clove and positive control after glycosylation

圖7　丁香有效部位及陽性對照對LDL糖基化孵育后 戊糖素產生量的抑制效果Fig.7　The inhibition efficiency of pentosidines production between the effective fraction from clove and positive control after glycosylation

由圖6和圖7可知,丁香對戊糖素形成的抑制作用也很顯著,與抑制AGEs形成效果相似。在低濃度時抑制效果弱于陽性對照AG(p<0.01)。50 μg/mL和100 μg/mL時的抑制率分別為52.443%±2.653%、53.193%±1.591%,與AG(61.931%±1.278%、66.285%±1.575%)相比,分別低9.488%、13.092%。但是,當濃度升高到500 μg/mL時,其抑制率(84.365%±0.302%)比AG抑制率(78.117%±1.416%)高出6.248%。

圖4～圖7結果分析表明,丁香可顯著抑制LDL糖基化修飾產物AGEs和戊糖素的形成。與陽性抑制劑AG相比,丁香在較低濃度時弱于AG;但在較高濃度(500 μg/mL)時抑制作用卻顯著強于AG(p<0.01)。原因可能是丁香有效部位是一種混合物,其內包含多種物質,而AG是一種分析純試劑,故丁香有效部位在較低濃度時抑制效果比AG弱;而當丁香有效部位濃度逐漸升高時,其所含對AGEs和戊糖素產生抑制效果的有效成分也升高,導致其抑制效果強于AG。另外,丁香屬于國家公布的藥食兩用植物[12],是天然抗氧化植物[17,20],與人工合成的陽性對照AG相比,對人類更健康、應用更安全。

有前人研究表明,糖基化LDL與未糖基化(自然)LDL相比,可明顯增加SAR、過氧化氫和α-酮醛等釋放并導致氧化應激產生[33-35]。Peng等[8]分析表明,天然抗AGEs材料包括藥用植物、蔬菜、水果、茶、谷類食物、香料、果仁和藻類等,這些材料都富含多酚和黃酮類物質[11]。相關研究表明,多酚和黃酮可抑制AGEs產生[8]。大部分植物抗糖基化功能與其抗氧化性能顯著相關[8]。丁香富含黃酮和其他抗氧化活性物質,具有很強抗氧化性能,在國家公布的87種藥食兩用原料中總多酚含量最高、抗氧化能力最強[13,15,17,20]。本實驗表明,丁香具有很強的SAR清除率(如圖1),乙酸乙酯相為其SAR有效部位。預示丁香可能通過其強SAR清除能力促進對AGEs和戊糖素產生的抑制作用,圖4～圖7的測定結果證實了這一點。因此,本實驗測定結果表明,丁香具有的強SAR清除能力可加強其對AGEs及戊糖素形成的抑制作用,與前人報道一致[8]。

目前,很多AGEs抑制劑已經被發現,且一些已經處于臨床研究階段。現有的AGEs抑制劑可以分為人工合成和天然兩類。AG是主要的人工合成AGEs抑制劑,也是唯一已經達到臨床研究第三階段的蛋白質糖基化抑制劑。但是,其本身同時具有很多毒副作用:如肝毒性、導致胃腸道紊亂、貧血和流感癥狀等,且由于治療時使用量很大,因此,氨基胍作為糖基化抑制劑也受到很多限制[8]。本實驗測定結果表明,丁香在較高濃度(≥500 μg/mL)時對AGEs和戊糖素產生的抑制效果要顯著強于氨基胍(p<0.01),且丁香比氨基胍具有更好的安全性和優越性,可為進一步尋找新的天然AGEs抑制劑提供參考。

3　結論

丁香乙酸乙酯相清除超氧陰離子自由基(SAR)能力最強,為有效部位。

LDL糖基化修飾后其熒光最佳吸收峰會發生明顯變化，表明糖化LDL與自然LDL相比其結構和性質改變。

丁香有效部位在低濃度(50、100 μg/mL)時對AGEs及戊糖素產生的抑制效果弱于陽性對照氨基胍;而當濃度升高到500 μg/mL時,其抑制效果卻顯著強于氨基胍(p<0.01)。

丁香對AGEs和戊糖素產生的抑制作用與其SAR清除能力密切相關。

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Efficiency of scavenging superoxide anions and inhibition on glycosylation of LDL of the effective fraction from clove

DU Yu-hui1,CAI Zhi-peng1,JIANG Shen-hua1,2,3,*,YANG Qiong-yu1,WAN Yan1,ZHANG Liang-hui1,MA Hai-le1,2,QU Wen-juan1,2,ZHANG Ai-lin1,3

(1.School of Pharmacy and Life Science,Jiujiang University,Jiujiang 332000,China;2.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Jiangsu Provincal Key Lab of Physical Processing of Agricultural Products,Zhenjiang 212013,China;3.Department of Food Science and Biotechnology,Tianjin agricultural University,Tianjin 300384,China)

In order to determine the inhibition efficiency on glycosylation of Low density lipoprotein(LDL)of clove,the preparation of clove effective fraction(the ethyl acetate fraction)based on bio-assay guided method and the inhibition efficiency on superoxide anion radicals and advanced glycosylation end products(AGEs)and pentosidines of clove effective fraction were studied by spectrophotometry and fluorescence analysis in this article. The results showed that the scavenging percentage on superoxide anions of ethyl acetate fraction was the highest among the different polar fractions of clove,and the scavenging percentages on superoxide anions were 46.112%±0.820% and 69.168%±2.637%,respectively,when the concentrations were 50 μg/mL and 100 μg/mL,which was significantly higher that of the positive control(p<0.05). The ethyl acetate fraction was proved to be the effective fraction of clove. The inhibition efficiencies(88.328%±0.037% and 84.365%±0.302%)were significantly stronger than those of the positive control(AG)when the concentration was 500 μg/mL,this inhibition efficiency was significantly higher than that of the positive control(AG)(p<0.01). The preferable inhibition efficiency on superoxide anions and AGEs was proved in this study,and this study laid the reference for further research and development of functional food.

clove;superoxide anion;Low density lipoprotein;glycosylation;advanced glycosylation end products

2016-01-29

杜余輝(1993-)，男，本科，研究方向：天然產物研究與開發，E-mail：429819408@qq.com。

江慎華(1973-)，男，博士，副教授，研究方向：天然產物研究與開發,E-mail：jiangshenhua66@163.com。

國家自然科學基金(31360371，31560308；31301423)；江西省自然科學基金(20132BAB204030)；江西省科技支撐計劃(20123BBF60150、20151BBF60026)；江西省衛生廳科研計劃(2013A017)；江蘇省農產品物理加工重點實驗室開放課題(JAPP2010-5)；江西省天然產物與功能食品重點實驗室開放基金資助項目；九江市科技支撐計劃(201438)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)15-0080-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.007