信號轉導工程及基因工程在懸浮培養靈芝細胞生產靈芝酸中的應用

岳同輝,姜露熙,李煥軍,李　娜,徐軍偉,*

(1.昆明理工大學 生命科學與技術學院,云南昆明 650500;2.昆明理工大學 理學院,云南昆明 650500)

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信號轉導工程及基因工程在懸浮培養靈芝細胞生產靈芝酸中的應用

岳同輝1,姜露熙1,李煥軍1,李娜2,徐軍偉1,*

(1.昆明理工大學 生命科學與技術學院,云南昆明 650500;2.昆明理工大學 理學院,云南昆明 650500)

靈芝酸是靈芝中的主要活性成分之一,現代藥理和臨床研究表明,靈芝酸具有毒殺腫瘤細胞、抑制癌細胞轉移、抗 HIV-1 和 HIV-1 蛋白酶等功能。目前懸浮培養靈芝細胞法是大規模生產靈芝酸的重要策略,具有很好的應用潛力和前景。近些年,有大量的文獻報道通過不同方式提高靈芝細胞中靈芝酸的含量,并取得了一定進展。文章主要從信號轉導調控、誘導子策略和基因工程等方面綜述了近年來懸浮培養生產靈芝酸的研究進展,并對以后通過調控代謝通路和合成生物學實現靈芝酸的高效生產進行了展望。

懸浮培養,生物合成,信號轉導工程,誘導策略,基因工程

靈芝是一種傳統的中藥材,在亞洲已有上千年的藥用歷史,隨著近些年人們對中藥認識度的提升,靈芝也越來越受到重視。靈芝酸是靈芝中的主要活性成分之一。目前,發現的靈芝酸單體有上百種,不同的單體具有不同的藥理功能,如GA-U、GA-V、GA-W、GA-X和GA-Y能夠在體外抑制腫瘤細胞[1];GA-C1、GA-α和GA-H能夠抑制HIV-1的蛋白酶活性[2];GA-T可抑制肺癌細胞的增殖、轉移等,GA-S刺激血小板聚集[3];GA-Me可有效地抑制腫瘤生長、肺癌細胞轉移和腫瘤入侵等[4-5]。

圖1　靈芝酸的生物合成途徑Fig.1　Ganoderic acid biosynthetic pathway注:P450(細胞色素P450酶家族)。

由于靈芝酸具有以上重要的生理活性,目前它已成為國內外對靈芝研究的一個熱點。懸浮培養是生產靈芝酸的重要策略,具有很好的應用潛力[6]。早期的研究主要通過加速靈芝細胞生長和優化培養條件使靈芝酸產率有一定程度的提高,但是仍不能滿足市場的需要。靈芝酸的低生產率仍是制約其市場化應用的核心問題之一。靈芝基因組和轉錄組測序已經完成,為解析靈芝酸的生物合成途徑、了解相關分子調控機制奠定了基礎。近年來隨著對靈芝酸生物合成途徑及其調控機制研究的深入,信號轉導工程、誘導子策略和基因工程等一些新的方法開始應用于提高靈芝酸的生產。本文主要就近年來懸浮培養靈芝細胞生產靈芝酸的相關研究進展進行了綜述,并對其進一步高效生產進行了展望。

1　靈芝酸的生物合成

靈芝酸作為一類四環三萜類化合物,是高度氧化的羊毛甾烷類衍生物。早期的同位素實驗表明靈芝酸是由甲羥戊酸/類異戊二烯途徑合成的(如圖1)[7],反應過程涉及法呢酯焦磷酸在鯊烯合酶的催化下合成鯊烯,后經鯊烯單加氧酶催化產生鯊烯2,3-氧化物,再經羊毛甾醇合成酶形成羊毛甾醇[8-11]。Shiao等[12]通過同位素標記實驗證實了羊毛甾醇可以轉化為靈芝酸。近年來,相關的研究表明細胞色素 P450 酶可能參與了羊毛甾醇的后修飾(骨架的氧化和羥化)形成靈芝酸的過程[13-14]。

表1　不同氮源限制對靈芝酸合成的影響Table 1 Effect of limitation of different nitrogen sources on GA biosynthesis

Shi等[7]已經克隆了靈芝酸生物合成途徑上游編碼3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶、法呢酯焦磷酸合成酶、鯊烯合成酶和羊毛甾醇合成酶的基因。但是至今,對于參與羊毛甾醇后修飾形成靈芝酸的相關 P450 酶和基因了解尚少。

2　信號轉導工程及基因工程在懸浮培養靈芝細胞生產靈芝酸中的應用

懸浮培養是在液體培養基中不斷攪動或搖動條件下培養細胞或細胞團,它具有快速、低消耗、易控制等優點,是高效生產靈芝酸的一種非常有潛力的培養方式[15]。近些年在提高靈芝酸生產方面有大量的文獻報道,早期的研究主要集中在優化培養條件,改變培養方式、培養策略等方面[16]。近幾年信號轉導調控、誘導子策略和基因工程等方法也開始應用到懸浮培養條件下提高靈芝酸產量的研究上。

2.1信號轉導調控

近些年,通過信號轉導調控提高次級代謝產物的生產方面受到廣泛關注。2012年Xu等[17]發現鈣調磷酸酶信號通路調節可以明顯提高靈芝中三萜類化合物的生物合成,在液體靜置培養基中添加Ca2+,可以使總靈芝酸的產率達到(86.45±5.42)mg/g DW(細胞干重),單體靈芝酸的產量(GA-Mk,GA-T,GA-S和GA-Me)分別是不添加時的2.6,4.5,3.2、3.8倍,靈芝酸生物合成通路相關基因hmgr、sqs和ls以及靈芝酸合成調控相關基因cam(鈣調蛋白基因)、can(鈣調神經磷酸酶A亞基基因)以及Crz1(轉錄因子)的表達水平均有上調。后來Xu等[18]還發現,在培養基中添加Na+,可以分別使GA-Mk,GA-T,GA-S和GA-Me達到263.73±9.06、237.62±5.89、83.13±2.76、100.16±6.12 mg/L,分別是未添加組的3.65、4.30、2.74、3.18倍,并且證明了Na+的誘導作用是通過提高細胞質內Ca2+的濃度以利于靈芝酸的合成。進一步研究表明Mn2+添加也有同樣的效果[19]。

真菌中許多次級代謝產物的合成受到細胞內氮源的調控[20-21],調控通過細胞內鋅指蛋白轉錄因子AreA/NZT-2的介導[20-22]。Zhao等[23]發現靈芝酸的合成受靈芝內氮源的影響,并發現在不同氮源(硫酸銨、谷氨酰胺、天冬酰胺和甘氨酸)限制條件下——每種氮源在3 mmol/L(氮限制條件)下,均提高了靈芝酸產量(如表1),尤其是硫酸銨、谷氨酰胺和天冬酰胺效果較明顯;并進一步研究了效果最好的谷氨酰胺在不同濃度條件下對靈芝酸產量的影響,發現當谷氨酰胺濃度為3 mmol/L時,靈芝酸產量達到最大,GA-Mk、GA-T、GA-S和GA-Me分別達到了2.16±0.19,11.76±1.82,31.09±2.67,7.04±0.64 μg/mg DW,分別是基本培養基中的2.81,5.84,8.33、5.12倍,總靈芝酸是基本培養基的4.19倍,靈芝酸合成相關基因hmgr、fps、sqs、ls和areA的表達量分別上調了37,18,4.5,3.2、13倍。

Li等[24]在Ca2+添加和氮缺陷實驗基礎上,發現整合Ca2+添加和氮缺陷策略,在培養基中添加10 mmol/L Ca2+同時將氮源含量限制在3 mmol/L時,可使GA-T的含量達到了1.87 mg/100 mg DW,分別是單獨Ca2+添加策略和氮缺陷策略的2.1～4.2倍。組合策略中中間代謝產物鯊烯的含量分別是Ca2+添加和氮缺陷策略的3.9、2.2倍,HMGR和LS基因的表達量分別提高到3.3～7.5倍和 1.3～2.3倍。

阿司匹林在酵母細胞和動物細胞中可以誘導細胞的凋亡,但在高等真菌中凋亡信號對次級代謝產物合成的影響仍不清楚。You等[25]研究了阿司匹林作為一種細胞凋亡誘導信號對靈芝細胞的影響,發現阿司匹林可通過誘導ROS(活性氧)的產生介導靈芝細胞的凋亡,同時通過Hog1(絲裂原活化蛋白激酶)磷酸化參與靈芝酸的合成,使GA-24和總靈芝酸的產量分別提高了2.7倍(515.2 μg/100 mg DW)和2.8倍(5385 μg/100 mg DW)。

以上研究表明,采用合適的信號轉導調控策略可以提高靈芝酸的產量,同時靈芝酸生物合成途徑的相關基因(hmgr、fps、sqs和ls)的表達量也有上調。但是相關調控的分子機制需要進一步深入研究。

2.2誘導子策略

誘導子可以影響真菌的生長、孢子的形成、次級代謝的產生以及真菌的細胞形態。常用于真菌的誘導子主要有茉莉酸甲酯、水楊酸、苯巴比妥、乙酸、蘆丁等[26,30]。

茉莉酸甲酯(MeJA)是與損傷相關的植物激素和信號分子,廣泛地存在于植物體中,外源添加能夠誘導植物防御相關基因的表達,并促使次級代謝產物的積累。它已應用到植物中誘導人參皂甙、紫杉醇和萜類次級代謝產物的生物合成。

靈芝酸合成途徑中FPS基因的啟動子序列上存在MeJA應答元件,可能調控了FPS基因的表達。任等[26]在靈芝懸浮培養基中添加MeJA,研究了MeJA的添加濃度、添加時間和所用溶劑對靈芝酸產量的影響,發現254 μmol/L的MeJA溶于吐溫20在培養第6 d添加到培養基中效果最好,使靈芝酸產率達到4.52 mg/100 mg DW,提高了45.3%,且靈芝酸生物合成通路相關基因fps、sqs、hmgr、mvd(mdd)和osc(se)等的表達水平均比對照組要高。

苯巴比妥是一種典型的P450誘導劑,可增加幾種植物細胞色素P450的酶活和相應基因的轉錄[27]。Liang等[28]在靈芝培養基中添加苯巴比妥后提高了靈芝酸的產量,并通過研究苯巴比妥的不同添加劑量和添加時間對靈芝酸產量的影響,發現在懸浮培養轉到靜置培養后第5 d添加100 μmol/L苯巴比妥可使總靈芝酸產量達到(41.4±0.6)mg/g DW,四種單體靈芝酸產量(GA-Mk,GA-T,GA-S和GA-Me)分別提高了47%,28%,36%,64%;同時,相關基因(hmgr、sqs和ls)的表達水平均有上調。

乙酸是一種安全而又經濟的誘導劑,已用于降低血清膽固醇、誘導脂肪酸合成酶基因的表達、增加蛋白質乙酰化以及刺激動物、植物和真菌的生長。Ren等[29]研究了在培養基中添加乙酸誘導靈芝酸的合成,并通過響應面法優化培養條件,結果表明乙酸的添加量在5～8 mmol/L時,總靈芝酸最高產率提高了105%(5.5 mg/100 mg DW),中間代謝產物羊毛甾醇和鯊烯的產率分別達到了47、15.8 μg/g DW,分別提高了2.5、1.8倍;乙酸添加誘導了靈芝酸合成通路相關基因fps、ls、cyp51(細胞色素P450家族基因之一)和hmgs轉錄水平的提高。

2.3基因工程調控

基因工程已成為從微生物以及高等植物中大量生產生物醫學及工業相關化合物的重要工具[30]。隨著靈芝酸生物合成途徑相關基因(hmgr、fps、sqs和ls等)的克隆,通過基因工程手段增強靈芝酸的生物合成通路,已成為提高靈芝酸積累的一種有效策略。

在萜類的生物合成途徑中,HMGR是MVA(甲羥戊酸)途徑中一個關鍵酶(限速酶),它催化HMG-CoA生成甲羥戊酸,然后甲羥戊酸被用于合成各種萜類。不同物種的HMGR一般由三部分組成:N-端跨膜區域(調節區)、連接區和非常保守的催化區域。

應用基因工程策略的前提是首先獲得穩定的遺傳轉化方法。Xu等[31]將sdhB(編碼琥珀酸脫氫酶鐵-硫蛋白亞基)基因進行定點突變,并且獲得了cbx(萎銹靈)抗性,建立了靈芝的同源基因轉化系統,并利用該轉化系統成功在靈芝中高表達了HMGR基因的催化區域,使總靈芝酸產率達到29.4 mg/g DW,是野生型菌株的約2倍(14.1 mg/g DW);使靈芝酸合成通路相關基因(fps,sqs,ls)分別提高了6.8、6.8、9.1倍。說明,通過高表達靈芝酸合成途徑中的關鍵基因是提高靈芝酸的產量一種有效策略。

高表達HMGR基因的催化亞基雖然使總靈芝酸的產率提高了2倍,但是并沒有影響四種主要單體靈芝酸(GA-Mk、GA-T、GA-S和GA-Me)的產率,由于不同的單體靈芝酸具有的生理活性不同,因此提高單體靈芝酸的產率具有重要意義。sqs是催化從甲羥戊酸途徑到三萜生物合成的第一個酶基因,Zhou等[32]又通過在靈芝中高表達sqs,使四種主要的單體靈芝酸(GA-Mk、GA-T、GA-S和GA-Me)的最大產率分別達到16、40、43、53 μg/100 mg DW,是野生型菌株的2.86、2.67、1.95、1.25倍;并且工程菌株中鯊烯和羊毛甾醇含量分別是野生菌株的1.55倍和1.68倍,sqs和ls的表達量分別上調了15.6倍和1.93倍。

除了對靈芝酸合成通路上相關基因進行高表達外,我們實驗室在靈芝細胞中異源表達了透明顫菌血紅蛋白基因。它是一種氧結合蛋白,可以在低氧條件下,將氧運輸給末端呼吸氧化酶,有效提高細胞的呼吸作用[33]。懸浮培養靈芝細胞發酵后期,由于細胞密度較大,氧成為其主要限制條件之一,表達透明顫菌血紅蛋白基因將有利于細胞的生長和代謝物的合成。我們的結果表明表達透明顫菌血紅蛋白基因的菌株中四種主要的靈芝酸單體含量提高了1.4～2.2倍,總靈芝酸也提高了50%[34]。

3　展望

雖然已經成功在靈芝中高表達了HMGR和SQS基因,并且提高了總靈芝酸及單體靈芝酸的產量,但靈芝酸合成通路中還有許多相關基因可以進行基因工程操作(高表達或者沉默),因此共表達多個合成途徑結構基因,增強代謝流量,是進一步大幅提高靈芝酸產量的一個方向。

鑒定靈芝酸合成途徑相關的P450基因對于深入解析靈芝酸的生物合成及代謝調控具有重要意義[35]。以后對相關P450基因進行基因工程操作,可以改變靈芝酸單體的多樣性,提高特定靈芝酸單體的產量,方便高效地制備和回收靈芝酸單體。

采用合成生物學方法異源合成次級代謝產物也備受關注,很多重要的次級代謝產物已經實現了在大腸桿菌、酵母等細胞中異源生產,如利用釀酒酵母生產丁醇、大腸桿菌或者酵母細胞生產單萜等[36-37]。解析靈芝酸的合成途徑,并實現其異源表達,是高效生產靈芝酸另一個很有潛力的方向。

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Applications of signal transduction engineering and genetic engineering in production of ganoderic acid in submerged culture ofGanodermalucidum

YUE Tong-hui1,JIANG Lu-xi1,LI Huan-jun1,LI Na2,XU Jun-wei1,*

(1.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;2.Faculty of Science,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

Ganoderic acids(GAs)are important bioactive constituents produced byGanodermaspp.Modern pharmacological and clinical studies have shown that GAs had extraordinarily pharmacological functions,such as anti-viral,anti-tumor,immuno-modulating effect,etc. Submerged fermentation ofG.lucidumis a promising technology for efficient production of GAs. Recent publication about fermentation production of GAs in the last decade,especially the progresses toward signal transduction strategies,induction strategies and genetic engineering were summarized in this paper. Moreover,metabolic engineering and synthetic biology approaches for efficient production of GAs were also proposed in this paper.

Submerged culture;biosynthesis;signal transduction;induction strategies;genetic engineering

2015-12-14

岳同輝(1992-)，男，碩士研究生,研究方向：高等真菌代謝工程,E-mail:tonghui_yue@163.com。

徐軍偉(1979-)，男，博士，副教授,研究方向：生物技術，應用微生物，微生物代謝工程,E-mail:xjuwei@163.com, jwxu@kmust.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31360495, 21566016)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)15-0370-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.064