重組TACI-Ig融合蛋白抑制抗CD3抗體誘導T淋巴細胞增殖與活化

楊思民，汪慶童，劉亢亢，汪龍生，吳　莉，魏　偉

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◇基礎醫學研究◇

重組TACI-Ig融合蛋白抑制抗CD3抗體誘導T淋巴細胞增殖與活化

楊思民，汪慶童，劉亢亢，汪龍生，吳莉，魏偉

目的 探討抗CD3抗體誘導小鼠T淋巴細胞增殖與活化的機制并觀察重組人TACI-Ig融合蛋白（rhTACI-Ig）對其的影響。方法 免疫磁珠純化得到小鼠T淋巴細胞，用抗CD3抗體刺激，同時給予rhTACI-Ig、rhTNFR∶Fc或IgG-Fc。［3H］-TdR參入法檢測T細胞增殖能力，流式細胞術檢測T細胞亞群比率，Western blot法檢測B淋巴細胞刺激因子、BAFF受體（BAFFR）和跨膜激活劑及鈣調親環素配體相互作用分子（TACI）兩個受體及IL-2受體（IL-2R）表達水平和NF-κB活性，采用小干擾RNA（siRNA）抑制T細胞BAFFR 或TACI的表達。結果 抗CD3抗體體外可促進T細胞增殖與活化，BAFF、白細胞介素-2（IL-2）、γ-干擾素（IFN-γ）和轉化生長因子-β（TGF-β）分泌，BAFFR、TACI、IL-2R表達升高和NF-κB活性增強（P＜0.05）。RhTACI-Ig（0.1、1、10、100 μg/ml）體外給藥可抑制抗CD3抗體誘導的T淋巴細胞增殖（P＜0.05）；rhTACI-Ig（1、10、100 μg/ml）可明顯降低抗 CD3抗體誘導產生的細胞因子水平（P＜0.05，P＜0.01），顯著抑制CD4+CD69+T細胞、CD4+CD154+T細胞比率，提高CD4+CD62L+T細胞比率（P＜0.05，P＜0.01），且 rhTACI-Ig （10、100 μg/ml）能降低 T細胞上BAFFR、TACI、IL-2受體的表達，抑制NF-κB活性（P＜0.05）。沉默BAFFR或TACI對抗CD3抗體誘導的T細胞增殖有抑制作用（P＜0.01）。結論 抗CD3抗體部分通過產生BAFF，激活BAFFR信號而促進T細胞增殖與活化，rhTACI-Ig中和BAFF，抑制BAFF相關受體的表達和NF-κB活性，減少T細胞表達IL-2受體，阻止T細胞過度增殖與活化。

B淋巴細胞刺激因子；重組TACI-Ig融合蛋白；T淋巴細胞；免疫治療；自身免疫病

網絡出版時間：2016-6-6 13：52：31 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.002.html

抗CD3抗體可以上調T淋巴細胞白細胞介素2受體（interleukine-2 receptor，IL-2R）表達，誘導細胞增殖與活化［1］。活化的T細胞能分泌IL-1、IL-2、IL-6、IL-10和B淋巴細胞刺激因子（B lymphocyte stimulator，BlyS or BAFF）等多種細胞因子［2］。BAFF及APRIL水平的異常與類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）等自身免疫病的發病密切相關［3］。BAFF與APRIL有兩個共同受體，即跨膜激活劑及鈣調親環素配體相互作用分子（transmembrane activator or calcium-modulating cyclophylin ligand-interactor，TACI）和 BAFF受體 （receptor for B-cell activating factor，BAFFR）。重組TACI-Ig融合蛋白（rhTACI-Ig）是TACI的胞外部分和人IgG1的Fc段鏈接而成，能競爭性結合BAFF和APRIL。該實驗觀察rhTACI-Ig對抗CD3抗體活化的T淋巴細胞及其相關受體和細胞因子的調節作用，并從BAFFR和TACI及其下游信號分子通路的角度，進一步探討BAFF影響T細胞的機制，為rhTACI-Ig控制T細胞增殖與活化提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物 雄性SPF級C57BL/6J小鼠，7～8周齡，（20±2）g，購于上海實驗動物研究中心。實驗中涉及的小鼠實驗方案均經安徽醫科大學臨床藥理研究所動物倫理委員會批準。

1.2藥物和試劑 小鼠淋巴細胞分離液購于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；全T細胞分選試劑盒購于德國美天旎生物技術有限公司；DMEM培養基購于美國Gibco公司；氚標記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）購于中國科學院上海應用物理研究所；T細胞培養上清液IL-2、IL-4、干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ）和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平ELISA試劑盒購于美國R&D公司；兔抗CD3多克隆抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；rhTNFR：Fc購于上海中信國健藥業有限公司；重組TACI-Ig融合蛋白（批號：20120607）和陰性對照IgG-Fc（批號：20120603）由煙臺榮昌生物制藥有限公司提供；流式抗體CD69/PE、CD154/ PE、CD62L/PE、CD4/FITC購于美國Biolgend公司；抗BAFFR、TACI、IL-2R一抗購于美國Santa Cruz公司；抗NF-κB p100/p52和抗磷酸化NF-κB p100/ p52（S865）一抗購于英國Abcam公司；辣根酶標記的山羊抗兔IgG及山羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）購于上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.3方法

1.3.1小鼠脾臟T淋巴細胞的分離 處死小鼠，無菌剝離脾臟，常規制備小鼠脾臟細胞懸液后用小鼠淋巴細胞分離液純化，分離得脾臟單個核細胞懸液后進行細胞計數。調節細胞濃度至每40μl含107個細胞。每107個細胞加入10 μl非T細胞的生物素化抗體混合物，輕輕震蕩混合經4℃孵育后再按照每107個細胞加入20 μl抗生物素微珠的比例，輕輕震蕩混合經4℃孵育后，將細胞懸液在沖洗的PBS流凈前加入處于磁場中的分離柱，收集流出液，再用500 μl PBS沖洗3遍后得到未被磁性標記的T淋巴細胞。將得到的T淋巴細胞重新計數鋪板培養。

1.3.2分組和給藥 將收集到的T淋巴細胞分為正常組、刺激組、rhTACI-Ig濃度組（0.01、0.1、1、10、100 μg/ml）、IgG-Fc（10 μg/ml）陰性對照組和重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白（tumour necrosis factor Fc fusion protein，rhTNFR：Fc）（10 μg/ml）陽性對照組。除正常組外，其余各組均用anti-CD3（10 μg/ml）刺激。T淋巴細胞給藥培養72 h后分別用于細胞增殖檢測、細胞因子水平測定、細胞亞群檢測以及受體和信號分子表達水平測定。

1.3.3T淋巴細胞增殖檢測 在96孔培養板上，每孔加入100 μl純化T淋巴細胞懸液（終濃度為1 ×107/ml）及anti-CD3（終濃度為10 μg/ml），同時每個孔加入不同濃度的rhTACI-Ig（終濃度為0.01、0.1、1、10、100 μg/ml）、rhTNFR：Fc（終濃度為10 μg/ml）或IgG-Fc（終濃度為10 μg/ml），每孔的終容積為200 μl，置37℃、5%CO2培養箱培養。在收集細胞前12 h時每孔加入25μl3H-TdR（105Bq/ml）后培養結束，用多頭細胞收集器收集細胞于玻璃纖維濾紙上，用液閃儀測其放射性。

1.3.4T淋巴細胞培養上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4、TGF-β水平檢測 在24孔培養板上，每孔加入500 μl純化T淋巴細胞懸液（1×107/ml）和anti-CD3（終濃度為10 μg/ml），同時每個孔加入不同濃度的rhTACI-Ig、rhTNFR：Fc或IgG-Fc，每孔的終容積為1 ml。培養72 h后離心（3 000 r/min，10 min），取上清液，采用ELISA法檢測IL-2、IFN-γ、IL-4、TGF-β水平。

1.3.5T淋巴細胞亞群比例檢測 在50 ml培養瓶中，每瓶分別加入2×107個經純化T淋巴細胞懸液和抗CD3（終濃度為10 μg/ml），加入后最終的容積為2 ml，加入不同濃度的rhTACI-Ig、rhTNFR：Fc或IgG-Fc，培養72 h后，收集細胞，每管300 μl細胞懸液（1×106/ml），分別加入5 μl適當稀釋的CD154-PE/CD4-FITC一抗、CD69-PE/CD4-FITC一抗、CD62L-PE/CD4-FITC一抗，4℃避光孵育30 min后用流式細胞儀檢測。

1.3.6T淋巴細胞BAFFR、TACI、IL-2R、磷酸化和總NF-κB p100/p52檢測 將6孔板內給藥處理后的T淋巴細胞轉移至2 ml EP管中，離心（3 000 r/ min，5 min），棄去培養液。每管加入50 μl蛋白裂解液（PMSF 1∶100），充分混勻，冰上靜置裂解30 min后，在-80℃和4℃冰箱間反復凍融3次，離心（14 000 r/min，15 min），小心吸取上清液即得總蛋白，用Western blot法檢測BAFFR、TACI、IL-2R、磷酸化和總NF-κB p100/p52的表達。將提取的蛋白定量后加入上樣緩沖液，進行SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜后，用封閉液封閉2 h，洗脫緩沖液洗3次，4℃冰箱孵育一抗過夜。次日，室溫下復溫10 min，洗脫緩沖液洗3次，37℃搖床孵育對應的二抗2 h，洗脫緩沖液洗3次，ECL試劑盒顯色。用凝膠成像系統掃描結果，以特異性條帶的灰度值來反映蛋白表達水平。

1.3.7siRNA轉染 將分離的T淋巴細胞按3×106/孔接種在12孔培養板中，1 000 r/min，離心10 min，棄上清液。每管加入100 μl Nucleofector Solution、100 nmol/L siRNA，使用細胞核轉染儀進行電轉。電轉后，立即補充培養液至1.5 ml，培養24 h后加BAFF繼續作用24 h。TACI siRNA序列為5′-CAGCGGAGTGGAGAAGTTGAA-3′；BAFFR siRNA序列為5′-TGTGGAAAGGACGAAACACC-3′。

1.4統計學處理 應用SPSS 17.0軟件處理和分析數據，結果以表示，兩組均數間差異比較用t檢驗，多組均數間差異的比較采用One Way Anova檢驗。

2　結果

2.1抗CD3抗體誘導T淋巴細胞BAFF分泌和增殖及hTACI-Ig的作用 抗CD3抗體不同濃度梯度和作用時間實驗顯示，10 μg/ml抗體刺激T淋巴細胞72 h為體外刺激的亞適濃度和最適時間。抗CD3抗體（10 μg/ml）刺激72 h，T淋巴細胞分泌大量BAFF且增殖功能明顯亢進（F=2.869，P= 0.000 4）。rhTACI-Ig（0.1、1、10、100 μg/ml）和rhTNFR∶Fc（10 μg/ml）可明顯抑制異常活化的T淋巴細胞增殖反應（F=51.75，P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

2.2抗CD3抗體刺激對T淋巴細胞培養上清液中細胞因子水平的影響以及rhTACI-Ig對其的影響抗CD3抗體刺激可使T淋巴細胞培養上清液中IL-2、IFN-γ和TGF-β水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），IL-4濃度升高但無顯著性。rhTACI-Ig（1、10、100 μg/ml）可明顯降低IL-2（F=5.571，P＜0.01）和IFN-γ（F=3.876，P＜0.01）水平；降低IL-4 （F=7.105，P＜0.05）和TGF-β（F=1.663，P＜0.05）水平。RhTNFR：Fc可以顯著降低抗CD3抗體刺激后升高的 IL-2、IL-4水平（P＜0.05），但對IFN-γ和TGF-β無明顯作用；IgG-Fc組對上述經抗CD3刺激后升高的細胞因子水平均無明顯影響。見圖2。

圖1　rhTACI-Ig體外對抗CD3抗體誘導的T淋巴細胞增殖能力的影響

2.3rhTACI-Ig對抗CD3抗體刺激的T淋巴細胞亞群比率的影響 抗CD3抗體體外刺激T淋巴細胞，可使CD4+CD69+和CD4+CD154+細胞比率顯著升高（P＜0.01），同時顯著降低CD4+CD62L+細胞比率（P＜0.01）。rhTACI-Ig（1、10、100 μg/ml）可顯著抑制被升高的CD4+CD69+細胞比率（F= 14.19，P＜0.05，P＜0.01）；rhTACI-Ig（0.1、1、10、100 μg/ml）可明顯降低CD4+CD154+細胞比率（F=19.31，P＜0.05，P＜0.01）；rhTACI-Ig（10、100 μg/ml）可顯著升高CD4+CD62L+細胞比率（F= 12.69，P＜0.05）；rhTNFR∶Fc可以明顯升高CD4+CD62L+細胞比率（P＜0.05），但對CD4+CD69+和CD4+CD154+無影響；IgG-Fc組對上述細胞亞群比率均無影響（圖3）。

圖2　抗CD3抗體刺激對于T淋巴細胞培養上清液中細胞因子水平的影響以及RhTACI-Ig對其的影響

2.4RhTACI-Ig對T淋巴細胞BAFFR、TACI、IL-2R表達和NF-κB p100/p52蛋白表達情況活性的影響 純化培養T細胞，抗CD3抗體體外刺激可顯著升高T淋巴細胞TACI、BAFFR、IL-2R的表達；rhTACI-Ig（1、10 μg/ml）體外給藥對異常升高的TACI（F=562.3，P＜0.01）、BAFFR（F=1032，P＜0.01）、IL-2R（F=9.126，P＜0.05）水平有抑制作用，提示rhTACI-Ig抑制BAFF受體信號通路，并阻止T細胞活化。抗CD3抗體可促進T細胞NF-κB p100/p52 865位點絲氨酸磷酸化活化，不改變總NF-κB p100/p52水平；rhTACI-Ig（1、10 μg/ml）阻止了抗CD3抗體誘導的NF-κB p100/p52磷酸化（F= 20.60，P＜0.05）。見圖4。

圖4　RhTACI-Ig對T淋巴細胞BAFFR、TACI、IL-2R表達和NF-κB活性的影響

2.5T淋巴細胞BAFFR或TACI受體對抗CD3抗體誘導細胞增殖的影響 用電轉法將BAFFR或 TACI siRNA分別轉染入分離純化的小鼠T淋巴細胞內，轉染48 h后用Western blot法檢測轉染效率，篩選最佳siRNA序列。實驗表明BAFFR siRNA的最高沉默率為58.3%（F=64.05），TACI siRNA的最高沉默率為 63.4%（F=41.35）（圖 5）。沉默BAFFR后，抗CD3抗體雖然仍能刺激T細胞輕度增殖，但增殖程度顯著低于對照組（F=51.49，P＜0.01）；沉默TACI也對抗CD3抗體誘導的T細胞增殖有抑制作用（F=57.63，P＜0.001）（圖6），提示抗CD3抗體體外促進T細胞增殖和活化的作用部分通過分泌BAFF，激活BAFFR和TACI受體及下游信號通路來實現。

圖5　沉默BAFFR或TACI對抗CD3抗體受體表達水平的影響

圖6　沉默BAFFR或TACI對抗CD3抗體誘導T淋巴細胞增殖的影響

3　討論

免疫調節的異常在自身免疫病的發病機制中起著關鍵作用，涉及到多種免疫性細胞，其中T淋巴細胞的異常增殖與活化在自身免疫性疾病的發生發展及病理損傷起著重要的作用［4］。CD3分子作為分布于所有T淋巴細胞膜上的重要分化抗原，是T淋巴細胞共有的分子表面標志物。當CD3與T淋巴細胞上的T淋巴細胞受體（TCR）特異性識別結合后，CD3通過TCR-CD3復合體將信號轉導到T淋巴細胞胞質內，在誘導T淋巴細胞活化過程中起著關鍵的作用，從而促進T淋巴細胞的增殖以及各種細胞因子的分泌［5］。因此，抗 CD3抗體能夠模擬抗原與TCR結合，向T淋巴細胞傳遞有效的信號模擬CD3與TCR結合后產生的效應。靜息T細胞不表達IL-2R，一旦被活化，T細胞分泌大量IL-2并迅速表達IL-2R［6］。本實驗顯示，抗CD3抗體促進T淋巴細胞高表達IL-2R，活化NF-κB p100/p52，產生大量BAFF，進一步促進T細胞的增殖活化。抑制BAFF受體BAFFR或TACI表達可減弱抗CD3抗體對T細胞的刺激作用，提示BAFF通路是除TCR信號外，抗CD3抗體活化T細胞的重要通路之一。

目前，在B淋巴細胞中作為BAFF的競爭性拮抗劑rhTACI-Ig對其作用以及相關的作用機制的研究［7］已較深入，但在T淋巴細胞中rhTACI-Ig的影響及相關作用機制尚未清楚。然而在RA、SLE等自身免疫病中，CD4+T淋巴細胞對于炎癥免疫反應的誘發和持續起重要作用。CD4+T細胞被自身抗原或細胞因子刺激活化后，分化為不同的功能亞群，如Th1、Th2細胞或調節性T細胞。這些CD4+T細胞通過與其他免疫細胞的相互作用，形成復雜的功能網絡，釋放Th1（IL-2、IFN-γ）、Th2（IL-4）、Treg（TGF-β）型細胞因子［8］。本實驗表明，經抗CD3抗體刺激的T淋巴細胞上清中上述細胞因子均出現了不同程度的升高，而在rhTACI-Ig體外用藥時發現其能不同程度地降低其水平。

CD62L表達于初始T淋巴細胞，在相關特異性細胞因子或趨化因子激活淋巴細胞后，可使其細胞表面CD62L表達迅速下調［9］。CD69在T淋巴細胞活化后很短時間即可表達并迅速達到高峰，也是最早表達的分子表面標志，其作為細胞共刺激信號可進一步增強T淋巴細胞的活化或增殖分化［10］。CD154（CD40L）與B淋巴細胞表面的CD40結合，CD154與CD40這對共刺激分子在B淋巴細胞中產生關鍵的作用，可以活化B淋巴細胞、刺激抗體產生以及免疫球蛋白類型轉換等，同時，對于T淋巴細胞活化與增殖及調節其所分泌的細胞因子等過程中也起重要的作用。未活化Th細胞（CD4+CD62L+）、表達活化誘導分子 Th細胞（CD4+/CD69+）和表達CD40L的Th細胞（CD4+/CD154+）比例及其所分泌的細胞因子在RA、SLE等自身免疫疾病的發病機制中起著關鍵作用，其比例變化可反映機體的免疫功能狀態及藥物的作用療效［11］。RhTACIIg可調節T細胞表面活化標志分子的表達。

TACI和BAFFR與腫瘤壞死因子受體相關因子（TNF receptor-associated factor，TRAF）偶聯，活化核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p52，降解促凋亡蛋白 Bim，介導細胞活化［12］。RhTACI-Ig作為一種誘騙受體，可作為競爭性拮抗劑結合BAFF和APRIL，阻止它們與其表達在細胞上的相應受體結合，從而阻斷其下游信號通路，減少炎性免疫細胞因子的產生［13］。在一些自身免疫病的報道中，使用rhTACI-Ig后病情可以得到一定的緩解，體內的血清中免疫球蛋白和自身抗體水平快速降低，并且能使病人體內表達水平升高的BAFF/APRIL同源三聚體及異源三聚體降低［14-15］。本研究顯示，rhTACIIg可以通過中和抗CD3抗體刺激T細胞產生的BAFF，抑制BAFF受體信號和NF-κB活性，減少T細胞表達IL-2R，阻止T細胞增殖，顯著抑制Th1型細胞因子產生，明顯降低活化Th細胞（CD4+/ CD69+和CD4+/CD154+）比例，升高未活化T細胞（CD4+CD62L+）比例。綜上，rhTACI-Ig對治療T細胞反應依賴的自身免疫病有良好前景。

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Inhibitory effect of rhTACI-Ig on anti-CD3 antibody induced T lymphocytes proliferation and activation

Yang Simin，Wang Qingtong，Liu Kangkang，et al
（Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University，Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine of Education Ministry of China，Collaborative Innovation Center of Anti-inflammatory and Immune Medicine，Hefei 230032）

Objective To investigate the molecular mechanism of anti-CD3 antibody induced T lymphocytes proliferation and activation and observe the effect of recombination human TACI-Ig（rhTACI-Ig）.Methods T lymphocytes were purified from the spleens of mice by immunomagnetic beads and treated with anti-CD3 antibody with or without different concentrations of rhTACI-Ig，recombinant human tumor necrosis factor-α receptor II：IgG Fc（rhTNFR：Fc）or IgGFc.The proliferation of T lymphocytes was determined by［3H］-TdR incorporation，the percentages of T lymphocytes subsets were tested by flow cytometry.Western blot was applied to evaluate the expression of B cell activating factor receptor（BAFFR），transmembraneactivator or calcium-modulating cyclophylin ligand-interactor（TACI），IL-2 receptor（IL-2R）and the phosphorylation of NF-κB.Small interfering RNAs were used to block BAFFR or TACI expression.Results Anti-CD3 obviously induced the activation of T lymphocytes，upregulated BAFF，interleukin-2（IL-2），interferon-γ（IFN-γ）and transforming growth factor-β（TGF-β）secretion，promoted BAFFR，TACI and IL-2R expression，activated NF-κB（P＜0.05）.The administration of rhTACI-Ig（0.1，1，10，100 μg/ml）inhibited the proliferation of T lymphocytes induced by anti-CD3 antibody（P＜0.05）.RhTACIIg（1，10，100 μg/ml）significantly decreased the production of cytokines（P＜0.05，P＜0.01），markedly downregulated the percentage of CD4+CD69+and CD4+CD154+T lymphocytes，elevated the proportion of CD4+CD62L+T lymphocytes（P＜0.05，P＜0.01）.Meanwhile，rhTACI-Ig（10，100 μg/ml）treatment decreased the level of BAFFR，TACI，IL-2 on T lymphocytes，as well as attenuated the activation of NF-κB（P＜0.05）.Depletion of BAFFR or TACI markedly blocked anti-CD3 antibody dependent T cell proliferation（P＜0.05，P＜0.01）. Conclusion Anti-CD3 antibody promotes T lymphocytes activation partially through BAFF production and BAFF receptors signaling.RhTACI-Ig neutralizes BAFF，inhibits BAFF signaling and therefore attenuates T lymphocytes activation.

B-cell activating factor；recombination human TACI-Ig；T lymphocytes；immunological therapy；autoimmune diseases

R 593.22；R 392.3；R 392.5；R 967；R 979.5

A

1000-1492（2016）07-0919-07

2016-04-06接收

國家自然科學基金（編號：81173075、81330081、81202541）；安徽省自然科學基金（編號：1208085QH146）；安徽醫科大學青年拔尖人才支持計劃（2013）；第三批安徽醫科大學校級中青年學術技術帶頭人基金

安徽醫科大學臨床藥理研究所、抗炎免疫藥物教育部重點實驗室、安徽抗炎免疫藥物協同創新中心，合肥 230032

楊思民，男，碩士研究生；魏 偉，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：wwei@ ahmu.edu.cn；汪慶童，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：hfwqt727@163.com