沉默Ska2基因?qū)θ四z質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

賀小軍，馬春春，卞爾保，王洪亮，宗 鋼，趙 兵

?

沉默Ska2基因?qū)θ四z質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

賀小軍，馬春春，卞爾保，王洪亮，宗 鋼，趙 兵

目的 采用siRNA沉默Ska2基因，探討其對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響及其潛在的分子機(jī)制。方法 對照組人膠質(zhì)瘤細(xì)胞予以siRNA陰性序列轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)組予以siRNASka2序列轉(zhuǎn)染。每組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后應(yīng)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析Ska2 mRNA表達(dá)情況。Western blot法分析Ska2、PCNA和Cyclin D1蛋白表達(dá)情況，MTT法及細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)分析Ska2對A172細(xì)胞增殖及克隆形成能力的影響。結(jié)果 qRT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組Ska2 mRNA表達(dá)較對照組顯著減少（P＜0.01），Western blot結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組Ska2、PCNA和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平亦較對照組顯著降低（P＜0.01），MTT實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組中活細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組（P＜0.05）；細(xì)胞克隆法顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖克隆形成能力明顯低于對照組（P＜0.01）。結(jié)論 沉默Ska2基因、減少人膠質(zhì)瘤細(xì)胞Ska2基因的表達(dá)能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。

Ska2；膠質(zhì)瘤；細(xì)胞增殖

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-6-6 13：52：31 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.006.html

紡錘體與動粒相關(guān)復(fù)合物（spindle and kineto-chore associated complex，Ska）包括Ska1、Ska2和Ska3［1］。Hanisch et al［2］發(fā)現(xiàn)了Ska1，并通過酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)一步篩選得到一個新的能夠與Ska1結(jié)合的蛋白即FAM33A，將其重新命名為Ska2。近年，Ska家族的第3個成員Ska3也幾乎同時被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道［3］。Ska2是一個最近鑒定的參與細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤發(fā)生發(fā)展的新基因［2，4］。Ska2在細(xì)胞周期中的作用，目前認(rèn)為該基因可通過與Ska1、Ska3形成Ska復(fù)合體，維持有絲分裂中期赤道板和關(guān)閉紡錘體檢測點(diǎn)，保證細(xì)胞能夠“適時”完成有絲分裂中期并進(jìn)入有絲分裂后期［2，5］。Hanisch et al［2］采用RNA干擾技術(shù)抑制Ska2表達(dá)后，大量細(xì)胞被停滯或延遲在有絲分裂中期，雖然細(xì)胞仍能最終完成有絲分裂，但細(xì)胞從有絲分裂前期進(jìn)入后期所需的時間明顯延長。Shi et al［6］發(fā)現(xiàn)Ska2在小細(xì)胞肺癌和乳腺癌中呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。此外，Ska2還可通過糖皮質(zhì)激素受體等途徑參與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生發(fā)展［7-10］。然而，Ska2基因在人膠質(zhì)瘤的作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，該研究旨在探討siRNA沉默Ska2后對人膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞增殖的影響，為進(jìn)一步深入研究Ska2在膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要材料及試劑 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株A172購自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清、胰酶消化液均購自美國Hyclone公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、TRIzol均購自美國Invitrogen公司；Ska2抗體購自英國Abcam公司；PCNA、Cyclin D1抗體購自北京博奧生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）購自日本TaKaRa公司；7900型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；20 μl的反應(yīng)體系包括10 μl 2×SYBR Green PCR Master Mix購自美國ABI公司；5′和3′端引物（3 μmol/L）各1 μl和1 μl的cDNA模板、7 μl dd H2O購自上海生物科技有限公司；兔抗人Ska2、羊抗人β-actin多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG、兔抗羊IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL購自美國Thermo Fisher公司；FlexCycler多功能PCR儀購自德國Jena公司；MTT試劑購自美國Sigma公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、DMSO試劑、Western一抗稀釋液及RIPA裂解液（強(qiáng)）均購自上海碧云天公司；NanoPhotometer Pearl 330購自德國IMPLEN公司；siRNA寡核苷酸片段由上海吉瑪公司合成；Ska2引物由上海生物工程公司合成。siRNA-Ska2序列和siRNA陰性對照序列見表1。

表1　引物序列

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 購買50代以內(nèi)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株A172，將其培養(yǎng)于含10%新生胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，恒溫恒濕培養(yǎng)箱設(shè)定參數(shù)為37℃、5%CO2濃度。取對數(shù)生長期A172細(xì)胞，用0.25%胰酶消化液消化，800 r/min離心5 min，取適量培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，按40×104個/瓶接種于培養(yǎng)瓶中；接種24 h后，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞匯合達(dá)約70%時即可進(jìn)行脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。第一組予以siRNA陰性對照序列（對照組）、第二組予以siRNA-Ska2序列（實(shí)驗(yàn)組）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以此建立細(xì)胞模型。

1.2.2qRT-PCR檢測A172細(xì)胞中Ska2 mRNA表達(dá)變化 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，提取實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞總RNA，分別將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用7900型熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增，Ska2上游引物：5′-CCGCTTTAAACCAGTTGCTG-3′，下游引物：5′-CTCTGCCGCAGTTTTCTCTT-3′；GAPDH上游引物：5′-AGCAAGAGCACAAGAGGAAG-3′，下游引物：5′-GGTTGAGCACAGGGTACTTT-3′。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)熱10 min；95℃變性15 s；60℃退火1 min，共45個循環(huán)。并于反應(yīng)結(jié)束后記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組結(jié)果。以GAPDH作為內(nèi)參，相對表達(dá)量=2-ΔΔCt值，以對照組mRNA表達(dá)量的均數(shù)為1，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3Western blot法檢測A172細(xì)胞中Ska2、PCNA和Cyclin D1蛋白表達(dá)情況 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，提取實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑檢測各組蛋白濃度并定量。取20 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳（濃縮膠濃度5%，分離膠濃度8%），電轉(zhuǎn)30 min后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h；加入一抗為兔抗人Ska2抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，洗膜；加入二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG（1∶10 000），室溫輕搖1 h，洗膜；加入ECL反應(yīng)液，暗室顯影、定影后掃描。以β-actin作為參照。

1.2.4MTT法檢測A172細(xì)胞生長 細(xì)胞培養(yǎng)和處理同前，將對照組正常A172細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后A172細(xì)胞按1×104/孔接種于96孔板，每組設(shè)復(fù)孔5個，作常規(guī)培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)后0、12、24、48、72 h 5個時間點(diǎn)的培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)基，每孔依次加入MTT（5 mg/ml）10 μl，繼續(xù)孵育4 h后吸盡每孔中的培養(yǎng)液；加入DMSO 150 μl/孔，于水平搖床上振蕩6 min，測定492 nm的吸光度（absorbance，A）值。以時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線圖。存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞A值/對照組細(xì)胞A值×100%。

1.2.4細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)和處理同前，將轉(zhuǎn)染后的A172細(xì)胞按200個/孔接種于6孔板，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；取相同數(shù)目的正常A172細(xì)胞接種于6孔板，設(shè)為對照組；每組各設(shè)3個復(fù)孔進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。每孔加入培養(yǎng)基2 ml，每3 d換液并觀察細(xì)胞增殖情況，10 d后棄培養(yǎng)基，每孔加入4%多聚甲醛1 ml固定30 min后，再加入美蘭染料0.8 ml染色，20 min后棄去染料，輕輕漂洗數(shù)次后晾干，在顯微鏡下觀察并進(jìn)行拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。

2　結(jié)果

2.1A172細(xì)胞Ska2基因表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Ska2 mRNA水平的表達(dá)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.28，P＜0.01），見圖1。

圖1　實(shí)驗(yàn)組與對照組Ska2 mRNA的表達(dá)情況

2.2A172細(xì)胞Ska2蛋白表達(dá)變化 Western blot結(jié)果顯示，兩組內(nèi)參β-actin蛋白的表達(dá)相近，而與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組Ska2蛋白表達(dá)明顯減少（t= 9.12，P＜0.01），見圖2。

圖2　Ska2蛋白的表達(dá)情況

2.3Ska2基因?qū)172細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染0、12、24 h時A172細(xì)胞生長差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但轉(zhuǎn)染48 h 及72 h后，實(shí)驗(yàn)組A172細(xì)胞較對照組生長明顯受抑制（t=8.27，P＜0.05），見圖3。

圖3　不同時間點(diǎn)A172細(xì)胞增殖生長情況

2.4Ska2基因?qū)172細(xì)胞增殖克隆形成能力的影響 10 d后將做細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)的6孔板放置在顯微鏡下，觀察實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞克隆增殖的情況。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖明顯受到抑制（t= 10.45，P＜0.01），見圖4。

圖4　細(xì)胞克隆增殖形成情況 ×100

2.5A172細(xì)胞中PCNA和Cyclin D1蛋白表達(dá)變化 Western blot結(jié)果顯示，兩組內(nèi)參β-actin蛋白的表達(dá)相近，而與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組PCNA和Cyclin D1蛋白的表達(dá)明顯減少（t=12.13，P＜0.01），見圖5。

圖5　PCNA與Cyclin D1蛋白的表達(dá)情況

3　討論

膠質(zhì)細(xì)胞瘤是人腦組織中最常見的原發(fā)惡性腫瘤，有高度侵襲性、神經(jīng)破壞性，被認(rèn)為是人類最致命的癌癥之一［11］。人類對惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其治療策略相對有限，目前最主要的治療手段是手術(shù)聯(lián)合放化療，但治療效果仍然不甚理想。因此，研究膠質(zhì)瘤基因改變的分子機(jī)制有助于從根源上發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的基因位點(diǎn)，通過阻斷和促進(jìn)某位點(diǎn)基因的表達(dá)情況來說明此位點(diǎn)對膠質(zhì)瘤致瘤性的影響。無限、不受控制地增殖是腫瘤細(xì)胞的特性，通過阻斷腫瘤細(xì)胞無限增殖的致癌基因無疑是研究的熱點(diǎn)。

Ska2是細(xì)胞分裂過程中必不可少的調(diào)控因子。文獻(xiàn)［6，12-13］證實(shí)Ska2參與肺癌、乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。本實(shí)驗(yàn)采用siRNA沉默Ska2，探究其對人膠質(zhì)細(xì)胞瘤A172增殖的影響，將膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ska2基因沉默作為實(shí)驗(yàn)組，同時建立僅予以siRNA陰性對照序列的對照組與之相比較。對兩組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，首先qRT-PCR和Western blot結(jié)果均證實(shí)Ska2-siRNA可明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Ska2 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。隨后，驗(yàn)證Ska2是否影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染Ska2-siRNA后，細(xì)胞增殖生長顯著受到抑制；克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖克隆形成能力顯著受到抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均支持沉默Ska2后，可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性。由此可見Ska2基因是一種重要潛在的原癌基因，在促進(jìn)腫瘤增殖生長中有重要作用。

文獻(xiàn)［12］報(bào)道Ska2可通過參與糖皮質(zhì)激素受體相關(guān)信號通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。糖皮質(zhì)激素因能抑制腫瘤細(xì)胞生長而被廣泛用作腫瘤化療藥物。某些小細(xì)胞肺癌細(xì)胞也因本身糖皮質(zhì)激素受體缺陷而表現(xiàn)出對糖皮質(zhì)激素的耐藥性［14］。Ska2通過與糖皮質(zhì)激素受體的直接相互作用而調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體的功能及糖皮質(zhì)激素的細(xì)胞增殖抑制作用。過表達(dá)Ska2可導(dǎo)致Dex激活的糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄激活活性得到進(jìn)一步增強(qiáng)；而采用RNAi技術(shù)抑制Ska2的表達(dá)后，Dex激活的糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄激活活性和細(xì)胞增殖抑制能力均顯著削弱或喪失［12］。此外，敲減糖皮質(zhì)激素受體β可特異性的抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的能力［15］。

為進(jìn)一步深入研究Ska2是如何調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖分子機(jī)制，本研究檢測了增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1與PCNA在實(shí)驗(yàn)組和對照組中的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果提示敲減Ska2基因后，實(shí)驗(yàn)組增殖相關(guān)蛋白PCNA與Cyclin D1的表達(dá)含量與對照組比較明顯抑制。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明沉默Ska2基因從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖可能與減少了增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1與PCNA的表達(dá)有關(guān)。

結(jié)合本次研究結(jié)果及Ska2對肺癌、乳腺癌等多種腫瘤的表達(dá)情況綜合考慮，Ska2基因與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。siRNA特異性沉默Ska2基因后，明顯抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172的增殖活性，因此Ska2基因可能是治療膠質(zhì)瘤及其他腫瘤潛在的理想靶點(diǎn)。然而對于Ska2基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的確切作用機(jī)制、作用途徑及Ska2基因與其他和膠質(zhì)瘤相關(guān)的基因相互作用的關(guān)系尚有待于進(jìn)一步闡明。

［1］Jeyaprakash A A，Santamaria A，Jayachandran U，et al.Structur-al and functional organization of the ska complex，a key component of the kinetochore-microtubule interface［J］.Mol Cell，2012，46 （3）：274-86.

［2］Hanisch A，Sillje H H，Nigg E A.Timely anaphase onset requires a novel spindle and kinetochore complex comprising Ska1 and Ska2 ［J］.EMBO J，2006，25（23）：5504-15.

［3］Williams G H，Stoeber K.The cell cycle and cancer［J］.J Pathol，2012，226（2）：352-64.

［4］杜 剛，卜友泉，楊正梅，等.人FAM33A基因啟動子的克隆與鑒定［J］.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2009，6（3）：219-24.

［5］Chan Y W，Jeyaprakash A A，Nigg E A，et al.Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting ska complexkmn network interaction［J］.J Cell Biol，2012，196（5）：563-71.

［6］Shi W，Gerster K，Alajez N M，et al.MicroRNA-301 mediates proliferation and invasion in human breast cancer［J］.Cancer Res，2011，71（8）：2926-37.

［7］謝濛宇，張 瑩，張春冬，等.Ska2/FAM33A：一個參與細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤發(fā)生的新基因［J］.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（2）：234-9.

［8］Bertrand F E，Steelman L S，Chappell W H，et al.Synergy between an IGF-1R antibody and Raf/MEK/ERK and PI3K/Akt/ mTOR pathway inhibitors in suppressing IGF-1R-mediated growth in hematopoietic cells［J］.Leukemia，2006，20（7）：1254-60.

［9］Boks M P，Rutten B P，Geuze E，et al.Ska2 methylation is involved in cortisol stress reactivity and predicts the development of post-traumatic stress disorder（ptsd）after military deployment ［J］.Neuropsychopharmacology，2016，41（5）：1350-6.

［10］Wang Y，Zhang Y，Zhang C，et al.The gene pair prr11 and ska2 shares a nf-y-regulated bidirectional promoter and contributes to lung cancer development［J］.Biochim Biophys Acta，2015，1849 （9）：1133-44.

［11］Thakkar J P，Dolecek T A，Horbinski C，et al.Epidemiologic and molecular prognostic review of glioblastoma［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2014，23（10）：1985-96.

［12］Rice L，Waters C E，Eccles J，et al.Identification and functional analysis of SKA2 interaction with the glucocorticoid receptor［J］.J Endocrinol，2008，198（3）：499-509.

［13］Lu Z，Li Y，Takwi A，et al.miR-301a as an NF-kappaB activator in pancreatic cancer cells［J］.EMBO J，2011，30（1）：57-67.

［14］Patki M，Gadgeel S，Huang Y，et al.Glucocorticoid receptor status is a principal determinant of variability in the sensitivity of nonsmall-cell lung cancer cells to pemetrexed［J］.J Thorac Oncol，2014，9（4）：519-26.

［15］Wang Q，Lu P H，Shi Z F，et al.Glucocorticoid receptor β acts as a co-acivator of T-Cell factor 4 and enhances glioma cell proliferation［J］.Mol Neurobiol，2015，52（3）：1106-18.

Effects of Ska2 silencing on the cell proliferation of human glioma cells

He Xiaojun，Ma Chunchun，Bian Erbao，et al
（Dept of Neurosurgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To analyze the effects of Ska2 after siRNA silencing on human glioma cells growth and its potential molecular mechanisms.Methods The cultured human glioblastoma cell line A172 was divided into two different groups：the control group and the experimental group.The control group was treated with siRNA negative sequence transfection；the experimental group with siRNA-Ska2 sequence transfection.48 hours later，the expressions of Ska2 mRNA was analyzed by qRT-PCR.The protein expressions of Ska2，PCNA，and CyclinD1 were analyzed by Western blot.The proliferation ability and the colony-formation ability of cell were investigated through MTT Assay and cell cloning Assay.Results qRT-PCR analysis showed that mRNA expression in Ska2 of the experimental group was significantly reduced compared with the control group（P＜0.01）；Western blot indicated a great decline of Ska2 in PCNA and CyclinD1 protein expression in the experimental group（P＜0.01）；MTT Assay revealed that the number of viable cell was lower than that of the control group（P＜0.05）；cloning experiment indicated that colony-formation ability was weaker than that of the control group（P＜0.01）.Conclusion Silencing of Ska2 and reducing the gene expression of Ska2 in human glioma cells inhibit cell proliferation.

Ska2；glioma；cell proliferation

R 739.41

A

1000-1492（2016）07-0930-05

2016-03-23接收

國家自然科學(xué)基金青年基金（編號：81402078、81502149）；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：1508085MH194）

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，合肥 230601

賀小軍，男，碩士研究生；趙 兵，男，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhaopumcmd@yeah.net