糖尿病大鼠病程不同階段角膜上皮緊密連接蛋白claudin-1表達的變化

倪夢圓，廖榮豐

?

糖尿病大鼠病程不同階段角膜上皮緊密連接蛋白claudin-1表達的變化

倪夢圓，廖榮豐

目的 動態(tài)觀察不同階段糖尿病（DM）大鼠和正常（NC）大鼠角膜上皮緊密連接蛋白claudin-1的表達變化。方法 雄性SD大鼠80只，隨機均等分為DM組和NC組，以高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射建立Ⅱ型DM模型，分別于造模后4周、8周、16周處死大鼠，取角膜組織；以HE染色法比較DM組和NC組大鼠角膜形態(tài)學變化，以免疫熒光染色和Western blot法檢測大鼠角膜上皮緊密連接蛋白claudin-1的表達。結果 造模后8周和16周，DM組大鼠角膜上皮細胞排列疏松，基質(zhì)層水腫明顯。造模后16周DM組和NC組大鼠角膜上皮claudin-1蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在造模后4周和8周表達差異無統(tǒng)計學意義。結論 隨DM病程延長，Ⅱ型 DM可能導致大鼠角膜上皮緊密連接蛋白claudin-1表達降低。

糖尿病；角膜上皮；緊密連接蛋白；免疫熒光染色；Western blot

網(wǎng)絡出版時間：2016-6-6 13：52：32 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.018.html

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種以糖代謝紊亂為特征的全身代謝性疾病，患病率逐年提高。引起眼部多種并發(fā)癥，并成為致盲的主要原因［1］。近年來，DM引起的角膜改變逐漸引起人們的重視。角膜上皮病變主要包括持續(xù)性上皮缺損、角膜知覺下降、上皮再生遲緩等［2］，而緊密連接作為角膜上皮細胞間最為重要的一種方式，在維持上皮功能中起著關鍵作用［3］。然而，DM眼表改變是否對角膜上皮連接存在影響目前尚不明確。該實驗通過建立Ⅱ型DM大鼠模型，檢測不同階段標志性緊密連接蛋白claudin-1的表達，探討DM眼表改變對角膜上皮緊密連接的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康成年雄性SD大鼠80只，約200 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，發(fā)育正常，使用前檢查無眼部疾患。隨機均等分為正常（normal control，NC）組和DM組。

1.1.2主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素（streptozotoein，STZ）（美國Sigma公司）；兔抗claudin-1多克隆抗體（美國Abcam公司）；FITC標記的羊抗兔IgG抗體（武漢博士德公司）；抗熒光淬滅劑、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、蛋白Marker（上海碧云天公司）；血糖分析儀（美國強生公司）；冰凍切片機（德國Leica公司）；-80℃低溫冰箱（美國Thermo Forma公司）；熒光顯微鏡（日本 Nikon Eclipse 80i型）；電泳儀（北京六一儀器廠）；凝膠電泳成像系統(tǒng)（美國Kodak公司）；圖像分析軟件Quantity One（美國Biorad公司）。

1.2方法

1.2.1動物模型建立 NC組大鼠給予正常飼料，DM組大鼠給予高脂飼料。8周后DM組大鼠腹腔注射小劑量STZ（30 mg/kg），NC組注射等劑量檸檬酸鹽緩沖液。1周后尾靜脈采血檢測空腹血糖，血糖值大于11.1 mmol/L為造模成功，若造模未成功則小劑量補打1次。造模成功后每周同一時間點空腹監(jiān)測血糖和體質(zhì)量變化。實驗過程均符合《實驗動物管理條例》的有關要求。

1.2.2角膜標本制備 分別于造模成功后第4周、第8周和第16周隨機取NC組和DM組大鼠各5只，以過量水合氯醛腹腔注射處死大鼠，迅速用PBS沖洗角膜；手術剪摘除眼球，眼科剪沿角鞏膜緣剪下角膜，放入已墊有包埋劑（opti-mum cutting temperature compound，OCT）的24孔板中；將角膜處于正上方，-80℃冰箱保存，用于HE染色和免疫熒光染色分析。用于Western blot分析的角膜上皮則以直徑為4 mm的環(huán)鉆標記，用刀片夾持器夾取鈍刀片機械分離標記內(nèi)完整的角膜上皮組織后，置于液氮中保存。

1.2.3角膜冰凍切片及HE染色 調(diào)節(jié)冰凍切片機的溫度為-20℃，切片厚度為6 μm，預冷一段時間后，取出-80℃冰箱保存的角膜標本進行切片。切片經(jīng)室溫干燥后，放入-20℃預冷的冰丙酮中固定10 min。稍水洗，60℃蘇木精染色，30～60 s，用流水沖洗蘇木精液5～10 s；加1%的鹽酸乙醇后稍水洗，加促藍液反藍后流水沖洗；0.5%伊紅染色液染色60 s后蒸餾水稍洗，依次放入80%乙醇溶液、95%乙醇溶液、無水乙醇溶液，再分別經(jīng)過石碳酸二甲苯、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫水后，中性樹膠封片。光鏡下觀察染色結果并拍照。

1.2.4免疫熒光染色 取出上述丙酮固定后的角膜冰凍切片，室溫干燥后PBS漂洗3次，每次10 min，5%脫脂奶粉封閉2 h。吸除脫脂奶粉后，加入1∶200兔抗claudin-1多克隆抗體（一抗），4℃冰箱孵育過夜。37℃復溫30 min，PBS沖洗3次，每次10 min；避光加入FITC標記的羊抗兔IgG抗體（二抗），常溫避光孵育1 h，PBS沖洗3次，每次5 min，加入抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5Western blot檢測 取出液氮中凍存的角膜上皮組織，加入RIPA蛋白裂解液，充分研磨成勻漿，4℃、12 000 r/min離心20 min；取上清液分裝轉(zhuǎn)移到0.5 ml離心管中，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取20 μl蛋白經(jīng) SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h；加一抗4℃冰箱孵育過夜，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗37℃孵育1 h，用ECL試劑盒進行顯影，以β-actin為內(nèi)參，Quantity One軟件分析灰度值。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示。對進行比較的兩組資料采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1NC組大鼠與DM組大鼠體重的比較 高脂喂養(yǎng)8周后（注射STZ之前）NC組大鼠的平均體重（381 g）較DM組大鼠（412 g）低7.5%（t=9.003，P＜0.01），但在造模成功后NC組大鼠維持正常體重增長，而DM組大鼠體重增長緩慢。造模成功后第4周時，DM組大鼠平均體重（418 g）較NC組大鼠（447 g）低6.4%（t=11.563，P＜0.01）；第8周時，DM組（422 g）較 NC組（509 g）低17.1%（t= 36.847，P＜0.01）；第16周時，DM組（428 g）較NC組（566 g）低24.4%（t=63.602，P＜0.01），見表1、圖1A。

2.2NC組大鼠與DM組大鼠空腹血糖比較 高脂喂養(yǎng)8周后（注射STZ之前）NC組大鼠的空腹血糖值約為5 mmol/L，DM組約為6 mmol/L（t= 7.472，P＜0.01）；造模成功后DM組大鼠空腹血糖濃度升高并維持在約21 mmol/L，而NC組大鼠的空腹血糖仍為5 mmol/L；兩組間造模后第4周、8周、16周空腹血糖值差異均有統(tǒng)計學意義（t=24.500，35.933，26.354，P＜0.01），見表2、圖1B。

表1　大鼠不同階段體重比較（n=10，g，±s）

表1　大鼠不同階段體重比較（n=10，g，±s）

與NC組比較：**P＜0.01

組別　高脂喂養(yǎng)第8周造模后第4周造模后第8周造模后第16周NC　381.30±7.62　446.90±5.28　509.00±4.90　565.60±5.85 DM　411.70±7.48**　418.20±5.81**　421.90±5.65**　428.40±3.50**

表2　大鼠不同階段空腹血糖比較（n=10，mmol/L，±s）

表2　大鼠不同階段空腹血糖比較（n=10，mmol/L，±s）

與NC組比較：**P＜0.01

組別　高脂喂養(yǎng)第8周造模后第4周造模后第8周造模后第16周NC　4.96±0.20　5.03±0.34　5.06±0.31　5.20±0.55 DM　5.94±0.37**　20.74±2.00**　20.67±1.34**　20.95±1.81**

圖1　NC組大鼠與　DM組大鼠體重和空腹血糖的比較

2.3HE染色觀察角膜組織病理學改變 造模成功后觀察兩組大鼠角膜形態(tài)，NC組大鼠角膜各層清晰可見，均無水腫，細胞輪廓清楚，排列整齊；DM組大鼠角膜在第8周和第16周時，角膜上皮細胞排列疏松，基質(zhì)層水腫，膠原纖維排列不規(guī)則，見圖2。

圖2　NC組大鼠和　DM組大鼠在不同病程角膜的染色 HE×200

2.4claudin-1蛋白免疫熒光染色結果 免疫熒光檢測角膜上皮顯示claudin-1蛋白主要分布在角膜上皮的表層細胞和翼狀細胞層。造模成功后第4周和第8周，NC組和DM組未觀察到有明顯差別。第16周時，DM組角膜上皮claudin-1蛋白表達較NC組明顯較弱且不規(guī)則，見圖3。

圖3　大鼠不同病程角膜上皮claudin-1蛋白表達免疫熒光染色檢測

2.5Western blot檢測結果 造模成功后第4周（t=0.637）和第8周（t=2.024），NC組和DM組角膜上皮claudin-1的表達量差異無統(tǒng)計學意義。第16周時，DM組角膜上皮claudin-1的表達量低于NC組（t=4.606，P＜0.05），見圖4。

3　討論

Ⅱ型DM會導致多種常見的眼部并發(fā)癥，如DM視網(wǎng)膜病變、青光眼以及白內(nèi)障等。DM患者發(fā)生在角膜的病變稱為DM性角膜病變［4］，有超過70%的DM患者存在角膜的異常病變［5］。角膜改變與 DM類型、病程有關［6］。

角膜上皮作為眼睛與外界環(huán)境的第一道屏障，保護眼睛免受各種外界因素的侵襲，同時也防止淚液及其化學成分的滲透。緊密連接作為細胞間連接的一種主要形式，在形成和維持角膜上皮功能、介導上皮細胞間粘合等方面起著關鍵的作用，也是上皮細胞屏障功能的重要基礎。claudins家族是構成緊密連接的主要成分，為緊密連接最重要的膜蛋白結構分子，目前已發(fā)現(xiàn)24個claudins家族成員［7］。claudins的分子質(zhì)量為23 ku，有4個跨膜區(qū)域，是唯一有組織特異性的緊密連接蛋白。claudins蛋白決定細胞的通透性，并且不同claudin蛋白對不同離子的通透性有選擇性［8］。claudin-1蛋白是緊密連接蛋白的一種，主要在角膜上皮的表層細胞和翼狀細胞層表達。

圖4　大鼠在不同病程角膜上皮claudin-1蛋白的表達

本實驗采用高脂聯(lián)合低劑量STZ腹腔注射成功建立了Ⅱ型DM大鼠模型，并觀察角膜病變情況。大鼠造模4周時并未出現(xiàn)明顯的角膜病變，在8周和16周時，發(fā)現(xiàn)DM大鼠角膜上皮細胞排列疏松，基質(zhì)層水腫。說明DM初期未累及角膜損傷，但隨著病程發(fā)展，角膜存在進行性病理損傷。研究［9］顯示DM患者角膜病理改變可能與機體糖基化終末產(chǎn)物堆積、炎性介導氧化應激等眼內(nèi)物質(zhì)代謝異常有關。此外，DM患者角膜慢性高糖狀態(tài)以及微血管的損傷導致角膜神經(jīng)營養(yǎng)障礙，不僅引起多種酶的改變，同時也破壞了炎癥神經(jīng)反饋通路［10］。

本實驗通過免疫熒光染色法發(fā)現(xiàn)造模成功后16周Ⅱ型DM大鼠角膜上皮緊密連接蛋白claudin-1較正常大鼠表達更低也更弱。而在第4周和第8周，2組間claudin-1表達量差異無統(tǒng)計學意義。Western blot也得出同樣的結果。這些結果顯示持續(xù)的高血糖狀態(tài)導致claudin-1蛋白表達量降低。研究［11］顯示在STZ誘導的DM大鼠模型中，視網(wǎng)膜緊密連接蛋白包括occludin、ZO-1、claudin-1/5的表達量均降低。DM導致緊密連接蛋白表達降低的機制可能與其持續(xù)的高血糖狀態(tài)以及代謝紊亂導致的微循環(huán)缺血低氧有關。慢性持續(xù)的高血糖狀態(tài)產(chǎn)生的過多氧自由基，可直接破壞緊密連接蛋白的表達，可能也與角膜上皮claudin-1蛋白表達量降低有關［12］。

綜上所述，DM角膜上皮claudin-1蛋白表達的降低可能會造成DM患者角膜對外界的防御功能降低，從而引起各種臨床表現(xiàn)。關于DM對角膜上皮緊密連接的影響機制尚需進一步的研究，可為臨床上治療DM眼表疾病提供理論依據(jù)。

［1］Xu K，Yu F S.Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52（6）：3301-8.

［2］Kaji Y.Prevention of diabetic keratopathy［J］.Br J Ophthalmol，2005，89（3）：254-5.

［3］Sugrue S P，Zieske J D.ZO1 in corneal epithelium：association to the zonula occludens and adherens junctions［J］.Exp Eye Res， 1997，64（1）：11-20.

［4］Schultz R O，Van Horn D L，Peters M A，et al.Diabetic keratopathy［J］.Trans Am Ophthalmol Soc，1981，79：180-99.

［5］Aiello L P，Gardner T W，King G L，et al.Diabetic retinopathy ［J］.Diabetes Care，1998，21（1）：143-56.

［6］Wiemer N G，Dubbelman M，Kostense P J，et al.The influence of chronic diabetes mellitus on the thickness and the shape of the anterior and posterior surface of the cornea［J］.Cornea，2007，26 （10）：1165-70.

［7］Tsukita S，F(xiàn)uruse M，Itoh M.Multifunctional strands in tight junctions［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2（4）：285-93.

［8］Koval M.Claudins-key pieces in the tight junction puzzle［J］. Cell Commun Adhes，2006，13（3）：127-38.

［9］Sato E，Mori F，Igarashi S，et al.Corneal advanced glycation end products increase in patients with proliferative diabetic retinopathy ［J］.Diabetes Care，2001，24（3）：479-82.

［10］Cisarik-Fredenburg P.Discoveries in research on diabetic keratopathy［J］.Optometry，2001，72（11）：691-704.

［11］Yu Z，Gong C，Lu B，et al.Dendrobium chrysotoxum Lindl.alleviates diabetic retinopathy by preventing retinal inflammation and tight junction protein decrease［J］.J Diabetes Res，2015，2015：518317.

［12］Schreibelt G，Kooij G，Reijerkerk A，et al.Reactive oxygen species alter brain endothelial tight junction dynamics via RhoA，PI3 kinase，and PKB signaling［J］.FASEB J，2007，21（13）：3666 -76.

Effects of hyperglycemia on the expression of corneal epithelial tight junction protein claudin-1 in type 2 diabetic rats

Ni Mengyuan，Liao Rongfeng
（Dept of Ophthalmology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To assess the expression of the corneal epithelial TJ protein claudin-1 in type 2 diabetic rats at different time points.Methods 80 eight-week-old male SD rats were randomly divided into the normal control and diabetic mellitus（DM）groups（n=40 each）.A high-fat diet combined with STZ injection was used to induce type 2 DM.Normal and diabetic rats were sacrificed at 4，8，16 weeks respectively（after STZ injection）before debridement.Hematoxylin and eosin was used to study the morphological differences between normal and diabetic cornea.Immunofluorescene and Western blot were used to determine the expression of corneal epithelial TJ protein claudin-1.Results Corneal epithelial cells reduction and stroma edema were evident at 8 and 16 weeks by HE. Claudin-1 expression in the corneal epithelium of the diabetic group was lower and fainter compared to the normal group at 16 weeks（after STZ injection）（P＜0.05），which were similar to the normal group at 4 and 8 weeks.Conclusion Continual hyperglycemia has a negative effect on ocular surface tissues and the expression of corneal epithelial tight junction protein claudin-1 with progressing of type 2 diabetic mellitus.

diabetes mellitus；tight junction；corneal epithelium；immunofluorescence staining；Western blot

R 772.2

A

1000-1492（2016）07-0961-04

2016-04-14接收

安徽高校省級自然科學基金（編號：KJ2012A166）；安徽省自然科學基金（編號：1408085MH191）

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院眼科，合肥 230032

倪夢圓，女，碩士研究生；廖榮豐，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：liaorfayfy @126.com