低氧對人牙周膜干細胞骨向分化的影響

劉衍釗，孫世林，顧 曠，劉 雨，鄒多宏，王元銀

?

低氧對人牙周膜干細胞骨向分化的影響

劉衍釗，孫世林，顧 曠，劉 雨，鄒多宏，王元銀

目的 探討低氧對人牙周膜干細胞（PDLSCs）骨向分化的影響。方法 采用組織塊法體外分離培養PDLSCs，分別在常氧和低氧條件下培養PDLSCs，低氧組在2%O2濃度下培養6、12、24、48 h后檢測其堿性磷酸酶（ALP）活性，并通過熒光定量PCR檢測低氧培養的PDLSCs中骨鈣素（OCN）、低氧誘導因子1α（Hif-1α）、堿性磷酸酶（ALP）以及成骨相關基因核心結合因子（Runx-2）等基因的表達變化；通過Western blot法檢測低氧培養的PDLSCs中Runx-2、Hif-1α等蛋白的表達變化。結果 低氧組的PDLSCs的ALP水平高于常氧組，但低氧48 h開始抑制ALP水平，熒光定量PCR和Western blot結果顯示低氧培養48 h內的PDLSCs的成骨能力高于常氧組，但低氧培養48 h則抑制其成骨能力。結論 48 h內低氧可顯著增強PDLSCs骨向分化作用，48 h則開始抑制其成骨能力。

牙周膜干細胞；低氧；骨向分化

網絡出版時間：2016-6-6 13：52：32 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.020.html

牙周膜是一種有高度韌性的結締組織，有豐富的血管網，為周圍的細胞提供了豐富的氧氣［1］。對于牙周病患者，由于慢性炎癥其牙周的血管受損，使得牙周細胞處于低氧狀態［2］。在進行牙齒正畸牽引時，作用于牙齒的機械應力會通過牙周膜傳遞到牙槽骨上，機械應力會引起牙周膜壓力區循環障礙和低氧，導致牙周膜細胞處于低氧環境中［3］。低氧是腫瘤微環境、缺血性疾病、以及組織損傷的一個重要組成部分［4-6］。當機體處于貧血、外傷、組織壞死等情況下，組織或細胞通常會處于低氧狀態。低氧導致一系列轉錄誘導因子的表達，其中，低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor，Hif-1α）對血管的形成及細胞的生長起決定性作用［7］。近年來研究［8］顯示，Hif-1α除了可以誘導血管生成外，對骨形成也有一定的作用。牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是牙周組織中的成體干細胞，有高度增殖、自我更新能力和多分化潛能，在一定的條件下可以誘導其骨向及血管向的分化［9］。PDLSCs的生理病理活動是在低氧狀態下進行的，牙周膜是位于牙槽骨和牙骨質之間高度血管化的組織，長期處于咬合及咀嚼作用導致的機械負荷下；患有牙周炎以及進行正畸的患者，由于炎癥以及過度的機械力使得牙周組織嚴重受損，這都導致了PDLSCs處于一種低氧的微環境中［10］。該研究通過探討低氧對于PDLSCs的成骨能力的影響，以期對于牙周炎患者牙周組織進行有效的修復。

1　材料與方法

1.1材料 DMEM培養液、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國HyClone公司）；青霉素100 U/ml、鏈霉素100 mg/L、二甲基亞砜（美國Sigma公司）；低氧培養箱（德國MEMMERT公司）；高速冷凍離心機（美國Centrifuge公司）；超微量分光光度計（美國NanoDrop公司）；超凈工作臺（中國蘇州凈化公司）。

1.2PDLSCs的分離和培養 選擇11～18歲因正畸需要減數拔除的前磨牙，收集前獲得患者及其監護人的知情同意。取材后，在超凈工作臺內，將牙齒牙冠向下用PBS沖洗牙齒30 s，然后將牙冠部分浸入75%酒精內消毒約2 min，再用 PBS沖洗30 s，無菌條件下用銳利手術刀片刮取牙根中部1/3的牙周膜組織；在DMEM培養液浸潤下，剪成1 mm×1 mm ×1 mm的碎塊，均勻鋪于6孔板底部，用蓋玻片壓緊，加入2 ml含20%FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/L的鏈霉素的DMEM培養液。置于37℃、飽和濕度條件下培養，每3 d換液，約7～15 d當細胞從組織塊周圍游出并達70%～80%融合時，用0.25%胰酶消化傳代，首次傳代比例為1∶1。

1.3低氧培養PDLSCs 將狀態良好的P2～P3代PDLSCs以5×104個/ml的密度接種于6孔板中，在常氧培養箱（含20%O2、5%CO2和75%N2）中培養3 d，然后將細胞分為兩組，低氧組（2%）和常氧組（20%），低氧組和常氧組分別設置6、12、24、48 h 4個時間點，低氧組的細胞置于含2%O2、5%CO2和93%N2的低氧培養箱中培養。

1.4堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性將PDLSCs以5×104個/ml的密度接種于含20% FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/L的鏈霉素的DMEM培養基的6孔板中，培養6、12、24、48 h收集細胞通過ALP檢測試劑盒檢測細胞的ALP活性。實驗重復3次。

1.5RNA提取及熒光定量PCR 使用TRIzol Reagent提取不同時間點細胞的總RNA，通過Prime-ScriptTMRT試劑盒進行逆轉錄。使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司）進行 PCR的擴增，總反應體系20 μl。所涉及的引物序列見表1。

表1　熒光定量　PCR引物序列

1.6總蛋白提取及Western blot法檢測 在不同的時間點用RAPA蛋白裂解液裂解細胞，冰上放置30 min，4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液。使用BCA蛋白試劑盒（中國碧云天公司）檢測蛋白濃度。按4∶1的比例向樣本中加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮10 min。SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將蛋白質電轉至PVDF膜上，0.5 g/L脫脂牛奶（中國光明公司）封閉膜上的非特異性位點。孵育一抗，二抗，用化學發光法ECL Western blot試劑盒（英國Amersham Biosciences公司）檢測抗原抗體復合物。GAPDH作為內參對照。

1.7統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析，兩組數據間的比較采用t檢驗。

2　結果

2.1原代PDLSCs 培養7～15 d時鏡下可見從組織塊周圍爬出的長梭形PDLSCs（圖1）。待原代細胞融合至孔底的80%時，按1∶1傳代。

圖1　原代PDLSCs ×40

2.2低氧對于PDLSCs ALP活性的影響 與常氧組比較，低氧組 PDLSCs的ALP活性逐漸增加，但低氧培養48 h的PDLSCs的ALP活性則顯著下降，與常氧組差異無統計學意義。其中低氧12 h（t= 4.79，P＜0.05）、24 h（t=4.70，P＜0.05）差異有統計學意義，6、48 h差異無統計學意義（圖2）。

圖2　低氧對于PDLSCs ALP活性的影響

2.3低氧對于PDLSCs成骨基因表達的影響 與常氧組比較，低氧組PDLSCs的成骨相關基因核心結合因子（runt-related transcription factor 2，Runx-2）均高表達，其中低氧12、24、48 h差異有統計學意義（t=5.738 85、14.008 61、4.982 24，P＜0.05），6 h差異無統計學意義。骨鈣素（osteocalcin，OCN）和ALP表達24 h差異有統計學意義（t=4.071 25、8.414 82，P＜0.05），6、12、48 h差異無統計學意義。低氧組Hif-1α表達高于常氧組，但48 h低氧組Hif-1α則無表達，其中低氧12 h差異有統計學意義（t= 6.220 65，P＜0.05），低氧6、24 h差異無統計學意義（圖3）。

2.4低氧對于PDLSCs成骨蛋白表達的影響 與常氧組比較，低氧組6、12、24、48 h Runx-2和Hif-1α的表達均明顯高于常氧組（圖4）。

圖3　低氧對于PDLSCs骨向基因　Runx-2、OCN、Hif-1α、ALP表達的影響

圖4　低氧對于　PDLSCs成骨蛋白表達的影響

3　討論

氧氣對于幾乎所有的生命都是不可缺少的，其能維持細胞的代謝和功能，當機體生命活動所需的氧不能得到充足的供給時，組織細胞就會處于一種乏氧代謝的過程中。由于向組織中供應的氧氣不足，會引起一些生理及病理性的變化，并且還會導致胚胎和成體干細胞的生理特性的改變。在牙周組織中，低氧是引起牙周炎的重要因素之一。正常牙周組織中的氧含量為2.9%～5.7%，但當牙周組織發生病變時，牙周組織的血流量減少，造成供氧不足，引起牙周組織炎癥，從而導致牙周細胞處于局部性的 低氧環境中［11-13］。

PDLSCs作為牙周來源的間充質干細胞，有高度增殖、自我更新、多向分化的潛能，并且能夠形成牙骨質及牙周組織，可作為牙周組織再生的重要種子細胞。Runx-2作為成骨細胞的特異性轉錄因子，調控并誘導成骨細胞分化和骨的形成。OCN由成骨細胞合成和分泌，由于OCN主要在礦化形成期出現，所以還被認為是成骨細胞向礦化期分化的標記之一。本實驗利用熒光定量PCR技術與Western blot檢測Runx-2、OCN、Hif-1α、ALP 4種成骨指標，結果顯示，無論從基因水平還是蛋白水平，48 h內低氧促進PDLSCs的骨向分化能力。通過在低氧環境下誘導干細胞的成骨分化，對牙周組織及骨組織的缺失來進行有效的修復。

到目前為止，低氧對于PDLSCs骨向分化影響的機制沒有被完全明確，以往骨髓間充質干細胞由于其易于取得并且有良好的成骨能力受到廣泛關注［14］。一些生理微環境，例如機械應力、低氧等在骨再生中發揮著重要作用，尤其是低氧被認為是調控成骨分化的關鍵。PDLSCs作為牙周組織來源的間充質干細胞，其STRO-1/CD146的表達和骨髓間充質干細胞類似，在體內可以形成牙骨質及牙周膜，使得PDLSCs成為一種獨特的干細胞［15］。最近的研究［16］表明，低氧環境可以上調轉錄因子Runx-2的表達，激活多種細胞外信號通路，如MEK/ERK和p38 MAPK通路，繼而啟動成骨相關特異性基因的轉錄及上調其表達促進礦化結節的形成以及ALP活性的升高，誘導其骨向分化。MAPK信號通路被認為是骨向分化以及成骨相關基因表達的關鍵，MAPK信號通路能夠磷酸化Runx-2，繼而啟動成骨特異基因的轉錄。ERK在細胞外基質誘導成骨中也發揮著重要作用。目前對于低氧的研究越來越多，但由于試驗中對于氧氣濃度的選擇，干細胞來源以及種類的不同，使得研究結果并不一致，對于低氧的研究仍然具有爭議，因此需要進一步的研究。

［1］Wu Y，Yang Y，Yang P，et al.The osteogenic differentiation of PDLSCs is mediated through MEK/ERK and p38 MAPK signalling under hypoxia［J］.Arch Oral Biol，2013，58（10）：1357-68.

［2］Pradeep A R，Prapulla D V，Sharma A，et al.Gingival crevicular fluid andserum vascular endothelial growth factor：their relationship in periodontal health，disease and after treatment［J］.Cytokine，2011，54（2）：200-4.

［3］Ku S J，Chang Y I，Chae C H，et al.Static tensional forces increase osteogenic gene expression in three-dimensional periodontal ligament cell culture［J］.BMB Rep，2009，42（7）：427-32.

［4］Paris S，Denis H，Delaive E，et al.Up-regulation of 94-kDa glucose-regulated protein by hypoxia-inducible factor-1 in human endothelial cells in response to hypoxia［J］.FEBS Lett，2005，579 （1）：105-14.

［5］Sluimer J C，Gasc J M，van Wanroij J L，et al.Hypoxia，hypoxiainducible transcription factor，and macrophages in human atherosclerotic plaques are correlated with intraplaque angiogenesis［J］. J Am Coll Cardiol，2008，51（13）：1258-65.

［6］Salim A，Nacamuli R P，Morgan E F，et al.Transient changes in oxygen tension inhibit osteogenic differentiation and Runx-2 expression in osteoblasts［J］.J Biol Chem，2004，279（38）：40007 -16.

［7］Patella F，Rainaldi G.MicroRNAs mediate metabolic stresses and angiogenesis［J］.Cell Mol Life Sci，2012，69（7）：1049-65.

［8］Li L，Han M X，Li S，et al.Hypoxia regulates the proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells under cyclic tensile stress via mitogen-activated protein kinase pathways［J］.J Periodontol，2014，85（3）：498-508.

［9］Seo B M，Miura M，Grenthos S，et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament［J］.Lancet，2004，364（9429）：149-55.

［10］Wu Y，Cao H，Yang Y，et al.Effects of vascular endothelial cells on osteogenic differentiation of noncontact co-cultured periodontal ligament stem cells under hypoxia.［J］.J Periodontal Res，2013，48（1）：52-65.

［11］Lou Y L，Guo F，Liu F，et al.miR-210 activates notch signaling pathway in angiogenesis induced by cerebral ischemia［J］.Mol Cell Biochem，2012，370（1-2）：45-51.

［12］Chae H S，Park H J，Hwang H R，et al.The effect of antioxidants on the production of pro-inflammatory cytokines and orthodontic tooth movement［J］.Mol Cells，2011，32（2）：189-96.

［13］Hanioka T，Tanaka M，Takaya K，et al.Association of oxygen tension in human periodontal pockets with gingival inflammation［J］. J Periodontol，2000，71（4）：550-4.

［14］Mohyeldin A，Garzon-Muvdi T，Quinones-Hinojosa A.Oxygen in stem cell biology：a critical component of the stem cell niche［J］. Cell Stem Cell，2010，7（2）：150-61.

［15］Huang G T，Gronthos S，Shi S.Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs.those from other sources：their biology and role in regenerative medicine［J］.J Dent Res，2009，88（9）：792 -806.

［16］Lee S H，Lee Y J，Song C H，et al.Role of FAK phosphorylation in hypoxia-induced hMSCS migration：involvement of VEGF as well as MAPKS and eNOS pathways［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2010，298（4）：C847-56.

Effects of hypoxia on the osteogenic differentiation of PDLSCs

Liu Yanzhao，Sun Shilin，Gu Kuang，et al
（Stomatology College of Anhui Medical University，Affiliated Stomatological Hospital of Anhui Medical University，Key Laboratory of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To investigate the effects of the hypoxia on the osteogenic differentiation of the human periodontal ligament stem cells（PDLSCs）.Methods The PDLSCs were cultured under hypoxia and normal condition. Cells in the hypoxia group were incubated in 2%O2for 6，12，24，48 h，and then ALP activity analysis was used to analyze the relative ALP activity.The expressions of OCN，Hif-1α，ALP，Runx-2 mRNA were detected by QPCR，while Western blot was used to analyze the expressions of Runx-2，Hif-1α protein.Results The osteogenic differentiation of PDLSCs under hypoxia condition was higher than the osteogenic differentiation of PDLSCs cultured under nomoxia condition，however，the osteogenic differentiation of PDLSCs cultured under hypoxia condition for 48 h was inhibited.Conclusion Hypoxia can enhance the osteogenic differentiation of PDLSCs within 48 h，however，inhibit the osteogenic differentiation of PDLSCs after 48 h.

human periodontal ligament stem cells；hypoxia；osteogenic

R 329.24；R 781.2

A

1000-1492（2016）07-0965-05

2016-03-04接收

國家自然科學基金（編號：81271162）；安徽省科技攻關計劃項目（編號：1401045013）

安徽醫科大學口腔醫學院、安徽醫科大學附屬口腔醫院、安徽省口腔疾病研究中心實驗室，合肥 230032

劉衍釗，男，碩士研究生；王元銀，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：wyy1970548@sohu.com；鄒多宏，男，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：zouduohongyy@163.com