通用轉錄因子GTFⅡF2對食管癌細胞增殖、遷移的影響

陳丹丹，耿慧武，潘林鑫，劉曉穎，范禮斌

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通用轉錄因子GTFⅡF2對食管癌細胞增殖、遷移的影響

陳丹丹，耿慧武，潘林鑫，劉曉穎，范禮斌

目的 研究通用轉錄因子ⅡF多肽2（GTFⅡF2）的表達對食管癌細胞增殖及遷移的影響。方法 人工合成靶向GTFⅡF2基因的siRNA序列和陰性對照siRNA序列及質粒pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG，分別轉染至食管癌細胞中，采用克隆形成實驗和細胞劃痕實驗觀察其對食管癌細胞增殖和遷移的影響。結果 RNA干擾技術靶向沉默GTFⅡF2基因表達后，食管癌細胞增殖和遷移均明顯受到了抑制，而過表達GTFⅡF2對食管癌細胞的增殖和遷移無明顯影響。結論GTFⅡF2基因在食管癌細胞TE-1、ECA-109的增殖和遷移過程中發揮重要作用，為進一步了解GTFⅡF2基因抑制TE-1、ECA-109細胞增殖和遷移的機制提供了基礎。

GTFⅡF2；基因表達；RNA干擾；細胞增殖；細胞遷移

網絡出版時間：2016-6-6 13：52：32 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.028.html

通用轉錄因子ⅡF多肽2（general transcription factorⅡF subunit 2，GTFⅡF2）由Sopta et al［1］從HeLa細胞提取，在早幼粒細胞性白血病細胞HL60 cDNA文庫中篩選表達生成的相關蛋白。人的GTF ⅡF2基因位于染色體13q14上，全長750 bp，包含8個外顯子和7個內含子，編碼249個氨基酸殘基，相對分子質量約為28 ku。GTFⅡF參與基因轉錄的起始、啟動子清除、延伸過程，是由GTFⅡF2的N-末端和GTFⅡF1兩種亞基組成的四聚體分子。GTFⅡF2中間部分通過RPB5結合到RNA聚合酶Ⅱ，對轉錄延伸過程起到重要作用。GTFⅡF2的C-末端包含一個非特異性的DNA結合結構域，該蛋白有特有的依賴 ATP的DNA解旋酶活性［1］，很多重要的轉錄因子以GTFⅡF2為靶分子，通過與其相互作用影響轉錄起始復合物的形成，影響并調節轉錄過程，因此GTFⅡF2被認為是轉錄過程中重要的基本轉錄因子。研究［2-3］證實GTFⅡF2功能發生變化將導致嚴重的疾病。該研究主要借助RNA干擾技術對GTFⅡF2基因表達進行沉默以及過表達GTFⅡF2，研究其表達對食管癌細胞TE-1、ECA-109的增殖和遷移的影響。

1　材料與方法

1.1質粒、菌株和細胞 pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG質粒、TG1感受態細胞、食管癌細胞株 TE-1和ECA-109均由安徽醫科大學生物實驗室保存。

1.2主要試劑與儀器 結晶紫、臺盼藍購自上海生工生物有限公司；siRNA的序列由通用生物系統（安徽）有限公司合成；Gibco胎牛血清、LipofectamineTM2000 Reagent、Opti-MEM Reduced serum Medium購自美國Invitrogen公司；EcoRⅠ、EcoRⅤ限制性內切酶及Lambda DNA EcoRⅠ+HindⅢMarker均購自加拿大Fermentas公司；改良型RPMI-1640培養基、胎牛血清和分光光度計NanoDrop 2000購自賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司；Western及IP細胞裂解液和一抗、二抗稀釋液以及Bradford蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天公司；GTFⅡF2（H-148）抗體購自美國Santa Cruz公司；β-actin購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；ECL顯色試劑盒購自美國Pierce公司；Countstar自動細胞計數儀購自上海睿鈺生物科技有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1細胞轉染 已設計并且合成兩對GTFⅡF2 siRNA序列，即GTFⅡF2 siRNA1：正義鏈為5′-GUCACAGCAAUGGGCUAAAdTdT-3′，反義鏈為 5′-UUUAGCCCAUUGCUGUGACdTdT-3′；GTFⅡF2 siRNA2：正義鏈為5′-GUGUUGGAGGACAGACAUUdTdT-3′，反義鏈為5′-AAUGUCUGUCCUCCAACACdTdT-3′。

轉染前1 d，胰酶消化對數生長期的細胞并計數，將細胞接種于600～800 μl無抗生素培養基的24孔培養板中，轉染siRNA和pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG每孔分別為4×104和2×105個細胞。鋪板次日，轉染siRNA細胞貼壁生長匯合至30%～40%，過表達細胞匯合度80%～90%，進行siRNA和過表達GTFⅡF2-FLAG轉染實驗。其中siRNA的終濃度擬設定為50 nmol/L，pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG轉染1 μg，每組2個復孔。按LipofectamineTM2000說明書轉染siRNA和pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG質粒。將轉染后的培養板放入CO2培養箱中孵育6 h，換新鮮不含抗生素的改良型RPMI-1640培養液。37℃、5%CO2培養孵育48 h，收集并且裂解細胞進行GTFⅡF2基因表達后的檢測。

1.3.2Western blot檢測 細胞轉染后約48 h，用含蛋白酶抑制劑PMSF的Western細胞裂解液將TE-1、ECA-109細胞冰上裂解約0.5 h，收集細胞；4℃、14 000 r/min離心20 min，使用 Bradford蛋白濃度測定試劑盒對上清液進行蛋白定量；取30 μg與等體積2×SDS上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，冰浴3 min后，進行12%SDS-PAGE電泳約2 h；轉移至PVDF膜，100 V恒壓電轉1 h，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，0.05%Tween-20的TBST洗滌PVDF膜3次；GTFⅡF2一抗（1∶500，用一抗稀釋液稀釋）4℃過夜孵育，TBST洗膜后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液稀釋）室溫孵育約2 h；TBST洗膜后用ECL試劑盒顯色，在暗室中用X光片曝光并顯影和定影，X光片晾干后掃描。

1.3.3克隆形成實驗 通過克隆形成實驗檢測GTFⅡF2 siRNA和過表達GTFⅡF2對食管癌細胞抗惡性細胞增生的影響。GTFⅡ F2 siRNA和pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG在轉染48 h后，胰酶消化對數生長期的細胞并計數，2 000個細胞接種于6孔板中，輕輕晃動，使細胞分散均勻。置37℃、5% CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養10～12 d，期間經常觀察，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。將培養皿置于冰上，棄去上清液，用預冷的PBS小心浸洗2次。加約500 μl的-20℃預冷甲醇，固定細胞10 min。棄固定液，加適量0.5%結晶紫（25%甲醇配制）染色液在室溫下孵育15～20 min，然后用蒸餾水洗去染液，空氣干燥，之后拍照分析。

1.3.4細胞遷移實驗 先用Marker筆在24孔板背后，均勻劃橫線，約每隔0.5～1.0 cm一條，橫穿過孔。每孔至少穿過3條線。在孔中加入約5×105個細胞，具體數量因細胞不同而異，以過夜能鋪滿為標準。第二天用100 μl槍頭，垂直于背面的橫線于匯合完全的單細胞層中劃線。用PBS洗細胞3次，以去除劃下的細胞，加入無血清培養基，每組2個復孔，常規放入 37℃、5%CO2培養箱，培養。按 0、24、48 h取樣拍照。

2　結果

2.1Western blot分析GTFⅡF2蛋白表達水平

siRNA1、siRNA2和pcDNA3.1-GTFⅡ F2-FLAG分別轉染于TE-1、ECA-109細胞48 h后提取總蛋白，Western blot法檢測GTFⅡF2蛋白表達情況。轉染陰性對照siRNA和GTFⅡF2 siRNA1細胞GTFⅡF2蛋白表達水平與未轉染的基本一致，而轉染GTFⅡF2 siRNA2細胞GTFⅡF2蛋白表達水平顯著低于未轉染、轉染陰性對照siRNA和GTFⅡF2 siRNA1細胞。GTFⅡF2 siRNA2基因表達抑制率達到90%，表明該GTFⅡF2靶向siRNA2能夠有效沉默食管癌細胞中GTFⅡF2基因的表達（P ＜0.01）。見圖1。而過表達GTFⅡF2無明顯影響。見圖2。

2.2GTFⅡF2表達對食管癌細胞增殖的影響用于克隆形成實驗剩余的細胞再經Western blot法分析GTFⅡF2蛋白表達情況，再次證實轉染陰性對照siRNA與未轉染的基本一致，而轉染GTFⅡF2 siRNA2細胞GTFⅡF2蛋白表達水平顯著低于未轉染、轉染陰性對照siRNA（P＜0.01）。見圖3。

經結晶紫染色后，轉染陰性對照siRNA與未轉染平均細胞量的基本一致，而轉染GTFⅡF2 siR NA2平均細胞量顯著低于未轉染、轉染陰性對照siRNA。表明該GTFⅡF2靶向siRNA2能夠有效抑制食管癌細胞TE-1、ECA-109的增殖（P＜0.01）。見圖4。對GTFⅡF2的過表達進行同樣的研究，結果顯示對食管癌的增殖并無明顯影響。見圖5。

圖1　Western blot法分析knockdown GTFⅡF2蛋白表達水平

圖2　Western blot法分析過表達GTFⅡF2蛋白表達水平

圖3　Western blot法分析knockdownGTFⅡF2蛋白表達水平

圖4　GTFIIF2 siRNA2對食管癌細胞增殖的影響

圖5　GTFⅡF2過表達對食管癌細胞增殖的影響

2.3GTFⅡF2表達對食管癌細胞遷移的影響在細胞層上用槍頭劃痕，轉染GTFⅡF2 siRNA2的細胞遷移受到抑制，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖6、表1。而轉染陰性對照siRNA和未轉染的細胞保持了原有的遷移能力，48 h后通過遷移將劃痕部分掩蓋，對GTFⅡF2的過表達進行同樣的研究，結果顯示對食管癌的遷移并無明顯影響，見圖7、表2。

圖6　GTFⅡF2 siRNA2對ECA-109細胞遷移的影響 ×100

圖7　GTFⅡF2 siRNA2對　TE-1細胞遷移的影響×100

表1　GTFⅡF2 siRNA對食管癌細胞遷移的影響（±s）

表1　GTFⅡF2 siRNA對食管癌細胞遷移的影響（±s）

項目　未轉染　陰性對照siRNA GTFⅡF2 siRNA2　F值　P值ECA-109 24 h　59.30±13.15 51.44±11.29　19.92±5.14　15.949　0.001 48 h　56.46±12.73 50.83±10.71　17.32±4.47　18.107　0.001 TE-1 24 h　64.11±16.77 60.06±14.91　26.89±7.87　8.849　0.007 48 h　61.03±15.75 59.11±14.07　23.23±6.05　11.271　0.003

表2　過表達　GTFⅡF2對食管癌細胞遷移的影響（±s）

表2　過表達　GTFⅡF2對食管癌細胞遷移的影響（±s）

項目　未轉染　陰性對照pcDNA3.1 FLAGGTFⅡF2　F值　P值ECA-109 24 h　59.30±13.15 58.64±13.02 59.55±14.12　0.005　0.995 48 h　56.46±12.73 55.25±12.44 54.87±12.13　0.018　0.982 TE-1 24 h　64.11±16.77 63.42±17.74 62.98±16.48　0.004　0.995 48 h　61.03±15.75 60.23±14.93 61.47±15.82　0.006　0.993

3　討論

GTFⅡF2通過在mRNA合成的起始和延長過程中控制著RNA聚合酶Ⅱ的活性，影響轉錄的過程。從哺乳動物細胞內純化的GTFⅡF2被廣泛磷酸化［4］，磷酸化酪氨酸可激活多種信號轉導途徑［5］，影響疾病的發生與發展。已有研究［6］表明GTFⅡF2突變體對亨廷頓疾病的發生也存在一定的影響。因此探討GTFⅡF2在致病中的作用機制有非常重要的意義。

為了研究GTFⅡF2基因在食管癌 TE-1、ECA-109細胞中的生物學作用，本實驗采用RNA干擾和轉染技術分別使細胞中GTFⅡF2基因進行靶向沉默和過表達，對細胞增殖和遷移進行一系列的研究。本研究將設計合成的兩對siRNA序列以及構建成功的pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG分別轉染至食管細胞TE-1和ECA-109后，經 Western blot檢測GTFⅡF2蛋白的表達水平，結果表明GTFⅡF2 siRNA2序列明顯抑制GTFⅡF2的表達，并且干擾效果優于GTFⅡF2 siRNA1，所以后續一系列實驗選用GTFⅡF2 siRNA2進行。Western blot檢測結果顯示GTFⅡF2 siRNA2在食管癌細胞ECA-109中的knockdown效率達到90%，蛋白表達需要轉錄因子復合物的共同參與，包括TFⅡA、TFⅡB、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF和TFⅡH［7］。其中GTFⅡF2與RNA聚合酶Ⅱ聯系密切［8］，功能上與大腸桿菌的RNA聚合酶的sigma70亞基類似，都有識別轉錄的起始位置，并使RNA聚合酶結合在啟動子部位的功能。Knockdown GTFⅡF2無法使轉錄正常進行。GTFⅡF2 siRNA2在食管癌細胞ECA-109中的knockdown效率明顯高于TE-1，說明同一序列在不同細胞中所起的作用也有差異；GTFⅡF2抑制了非特異性轉錄的起始［9］，并且募集聚合酶形成，連同起始復合物到啟動子DNA上影響了啟動轉錄的起始過程。過表達FLAG-GTFⅡF2 Western blot結果條帶偏高，其中除了有GTFⅡF2內源性表達，FLAG標簽對GTFⅡF2的表達可能也有影響。

Western blot檢測結果已經證實GTFⅡF2 siRNA2序列明顯抑制了GTFⅡF2的表達，鑒于GTFⅡF2對轉錄過程發揮很重要的作用，設想knockdown GTFⅡF2之后對食管癌細胞的增殖也有影響，所以本實驗采用克隆形成實驗研究其對細胞增殖的影響。結果表明GTFⅡF2靶向siRNA2能夠有效抑制食管癌細胞TE-1、ECA-109的增殖，對ECA-109的抑制率約達70%，而對TE-1抑制率達到50%，其對ECA-109的效果較明顯于TE-1。但對GTFⅡF2的過表達進行同樣的研究，結果顯示對食管癌的增殖并無明顯影響，轉染空載體與質粒的克隆形成數量比未轉染的少，可能是由于質粒轉染本身對細胞有影響，但是轉染空載體和重組質粒的克隆形成數量相差不大。結果表明雖然GTFⅡF2作為通用轉錄因子，是轉錄過程所必需，但并非其能單一影響和調控增殖過程。RNA聚合酶Ⅱ由約10～12個亞基組成［10-11］，GTFⅡF2可能結合RNA聚合酶Ⅱ的亞基RPB5來調控轉錄過程，影響了細胞克隆的增殖。

為了解RNA干擾GTFⅡF2及過表達GTFⅡF2之后對食管癌遷移是否有影響，進行了劃痕實驗。轉染GTFⅡF2 siRNA2后，與陰性對照siRNA組相比，細胞遷移受到明顯的抑制；而未轉染、陰性對照轉染的細胞保持了原有的遷移能力，在一段時間后通過遷移將劃痕部分掩蓋，GTFⅡF2 siRNA2對ECA-109、TE-1的遷移活性較對照組分別降低了70%和55%，差異有統計學意義；而未轉染、轉染空載體和重組質粒pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG并未對細胞遷移產生明顯影響。Knockdown GTFⅡF2實驗結果提示，在食管癌細胞ECA-109和 TE-1中，細胞增殖以及遷移活性與GTFⅡF2在食管癌細胞中是否表達及表達量高低有關。

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［5］錢 成，王蓓華，徐雪琴，等.肌營養不良蛋白及其衍生物的表達與定位的研究［J］.安徽醫科大學學報，2015，50（9）：1207 -10.

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［11］Sentenac A.Eukaryotic RNA polymerases［J］.CRC Crit Rev Biochem，1985，18（1）：31-90.

The effect of general transcription factor GTFⅡF2 expression on the proliferation and migration of esophageal cancer cells

Chen Dandan，Geng Huiwu，Pan Linxin，et al
（Dept of Biology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To investigate the effect of general transcription factor GTFⅡF2 expression on the proliferation and migration of esophageal cancer cells.Methods Synthesized siRNA targeted to GTFⅡF2 gene or negative control siRNA and plasmid pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG were transfected to esophageal cancer cells respectively by using LipofectamineTM2000.Colony formation assay and wound-healing assay were performed to study the effect of knockdown and overexpression of GTFⅡF2 expression on the proliferation and migration of esophageal cancer cells respectively.Results Knockdown of GTFⅡF2 inhibited the proliferation and migration in TE-1，ECA-109 cells，but overexpression of GTFⅡF2 had no significant effect on cell proliferation and migration.Conclusion GTFⅡF2 gene plays an important role in the proliferation and migration of TE-1，ECA-109 cells.It is useful for further understanding of the mechanism that GTFⅡF2 inhibits the proliferation and migration of TE-1，ECA-109 cells.

GTFⅡF2；gene expression；RNA interference；cell proliferation；cell migration

R 735.1

A

1000-1492（2016）07-0984-06

2016-03-23接收

國家自然科學基金青年基金（編號：81201368）

安徽醫科大學生命科學學院生物教研室，合肥 230032

陳丹丹，女，碩士研究生；劉曉穎，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：liuxiaoying@ahmu.edu.cn范禮斌，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：lfan@ahmu.edu.cn