替米沙坦對小鼠巨噬細胞M1/M2亞型極化的影響

邢亦明，胡澤平，王邦寧，周 青，汪 淵

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替米沙坦對小鼠巨噬細胞M1/M2亞型極化的影響

邢亦明1，胡澤平1，王邦寧1，周 青2，汪 淵2

目的 探討替米沙坦對小鼠巨噬細胞M1/M2亞型極化的影響。方法 分別用脂多糖（LPS）聯合干擾素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）誘導小鼠巨噬細胞M1/M2型極化，用免疫熒光法檢測極化結果。在M1型巨噬細胞中分別加入0.1、1、10 μmol/L替米沙坦，同時設立空白對照組及溶劑對照組，Western blot法檢測各組巨噬細胞亞型標志物誘導性一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶Ⅰ（ArgⅠ）的表達情況，ELISA法檢測各組培養液上清中IL-6、IL-10表達情況。結果 在LPS+IFN-γ誘導的小鼠巨噬細胞中M1型巨噬細胞標志物iNOS、IL-6的表達水平明顯升高，替米沙坦干預后，各干預組M1型巨噬細胞標志物iNOS、IL-6的表達水平下降（P＜0.05），隨著替米沙坦濃度的增加而降低，而代表M2型巨噬細胞標志物的ArgⅠ和IL-10表達水平上升（P＜0.05）。結論 替米沙坦可以抑制LPS+IFN-γ誘導的小鼠巨噬細胞M1型極化，促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉化。

替米沙坦；巨噬細胞M1/M2型極化；炎癥

網絡出版時間：2016-6-6 13：52：32 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.030.html

替米沙坦是一種新型血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，廣泛應用于臨床冠心病、高血壓等心血管疾病的治療，其不僅有拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統、改善心肌重構、改善血管內皮功能等心血管保護作用，更有抗炎、抗動脈粥樣硬化作用［1］。動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，巨噬細胞在其中扮演了重要角色［2］。近年來，通過調節巨噬細胞功能影響動脈粥樣硬化發生發展的研究受到廣泛關注。研究［3］顯示，巨噬細胞在不同的微環境下可以分化為M1和M2兩種亞型，稱為巨噬細胞極化。M1型巨噬細胞高表達誘導性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthases，iNOS）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等，有促炎、促動脈粥樣硬化作用；M2型巨噬細胞高表達精氨酸酶I（arginaseⅠ，ArgⅠ）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）等，有抗炎、抗動脈粥樣硬化作用。然而，替米沙坦是否能夠調節巨噬細胞M1/M2型極化，目前尚不清楚。該研究探討替米沙坦對小鼠巨噬細胞M1/M2型極化的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 小鼠巨噬細胞RAW264.7由中國科學技術大學生命科學院饋贈。

1.1.2主要試劑和儀器 替米沙坦購于上海勃林格殷格翰藥業有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購于杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖培養基購于美國Gibco公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）購于美國Sigma公司；IL-4和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）均購于美國Peprotech公司；兔ArgⅠ多抗和β-actin單抗購于美國Santa Cruz公司；兔iNOS多抗購于美國Abcam公司；其余相應二抗及免疫熒光試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司；BCA定量試劑盒、ECL顯色試劑盒均購于美國Pierce公司；IL-6、IL-10 ELISA試劑盒均購于北京四正柏科技有限公司；免疫熒光照片均使用Leica DM4000B拍攝。

1.2方法

1.2.1細胞培養和傳代 用含有10%胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 μg/ml青霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的高糖DMEM培養基培養細胞，細胞培養瓶置入5%CO2、37℃培養箱中，當細胞密度為90% ～95%并處于對數生長期時，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2免疫熒光法檢測巨噬細胞M1/M2亞型極化

將處于對數生長期的RAW264.7細胞接種于 6孔板，設立M1組和M2組，分別在M1組和M2組加入LPS 200 ng/ml+IFN-γ 20 ng/ml和IL-4 15 ng/ml共培養12 h，同時設立空白對照組（Mφ組），取出蓋玻片，用預冷的PBS溶液清洗3遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS溶液清洗3遍；后用0.3%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）透化細胞膜10 min，PBS沖洗3遍；用含1%BSA的PBS封閉30 min，棄封閉液，加入iNOS一抗和 ArgⅠ一抗（1∶200，用封閉液配制），4℃過夜，PBS洗3遍；再加入FITC標記的兔抗小鼠IgG二抗（1∶100，PBS配制），室溫孵育1 h，棄二抗，PBS沖洗3遍再加入0.5 μg/ml DAPI染核10 min，棄DAPI；PBS沖洗3遍，最后用熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察結果并拍照。

1.2.3Western blot法檢測iNOS、ArgⅠ的表達復蘇RAW264.7細胞，按照上述方法進行培養及傳代，待細胞穩定傳代后，加入LPS 200 ng/ml+IFN-γ 20 ng/ml培養12 h，后加入替米沙坦0.1、1、10 μmol/L（替米沙坦用DMSO溶解），并設立空白對照組和溶劑對照組。共培養24 h后，PBS洗滌3次，每瓶加入200 μl RIPA蛋白提取液，冰上放置30 min，刮取細胞，移入1.5 ml預冷EP管中，反復凍融3次，14 000 r/min離心30 min，將上清液移入另一個1.5 ml EP管中。BCA法測定總蛋白濃度并將所有樣本調整至相同濃度，加入4×蛋白上樣緩沖液，混勻后煮沸變性，-80℃保存備用。配制12.5% SDS-PAGE，加入等量樣本后電泳，電泳結束將蛋白轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗（iNOS、ArgⅠ、β-actin）4℃孵育過夜，PBS洗滌，二抗室溫孵育2 h，洗滌后在暗室內加ECL，覆蓋上X線片、顯影、定影。底片掃描后用Quantity One分析灰度值。

1.2.4ELSIA法檢測細胞上清液IL-6、IL-10水平

收集各培養瓶細胞培養上清液，根據說明書步驟使用ELISA法檢測上清液IL-6、IL-10水平，酶標儀檢測吸光度值，標準曲線計算活性。

1.3統計學處理 使用SPSS 19.0軟件進行分析，計量資料以±s表示，兩組間均值比較采用t檢驗，多組間均值比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1體外誘導小鼠巨噬細胞M1/M2亞型極化結果 M1組iNOS的表達水平相對于Mφ組和M2組均明顯升高（P＜0.05）（圖1），而M2組ArgⅠ表達水平明顯高于Mφ組及M1組（P＜0.05）（圖2），結果提示體外巨噬細胞極化造模成功。

2.2替米沙坦對M1型巨噬細胞iNOS和ArgⅠ表達的影響 在M1型巨噬細胞中加入不同濃度（0.1、1、10 μmol/L）替米沙坦干預24 h后，與空白對照組比較，替米沙坦干預各組iNOS表達水平明顯下降，隨著替米沙坦濃度的增加，iNOS表達水平明顯降低（F=51.893，P＜0.05）。同時，與空白對照組相比，替米沙坦干預各組ArgⅠ表達水平明顯上升，隨著替米沙坦濃度的增加，ArgⅠ表達水平明顯上升（F=10.090，P＜0.05）。見圖3。

2.3替米沙坦對巨噬細胞培養上清液IL-6水平的影響 與Mφ比較，M1組上清液中IL-6水平明顯增加（P＜0.01）；M1組與M1+DMSO組比較，差異無統計學意義；與M1組比較，替米沙坦干預組IL-6水平明顯下降，隨著替米沙坦的濃度增加，IL-6水平進一步降低（F=49.871，P＜0.05）。見圖4。

圖1　M1組、Mφ組、M2組iNOS表達情況 免疫熒光×400

圖2　M1組、Mφ組、M2組iNOS表達情況 免疫熒光×400

圖3　Western blot法檢測iNOS、ArgⅠ蛋白表達

圖4　細胞培養上清液中IL-6水平

2.4替米沙坦對巨噬細胞培養上清液IL-10水平的影響 Mφ組、M1+DMSO組和M1組細胞培養上清液中IL-10水平差異無統計學意義；與M1組比較，替米沙坦干預組細胞培養上清液中IL-10水平均升高，隨著替米沙坦的濃度增加，IL-10水平進一步升高（F=6 652.236，P＜0.01）。見圖5。

3　討論

動脈粥樣硬化是一種全身性的疾病，是多種心腦血管疾病的病理基礎，亦是急性心腦血管事件的罪魁禍首，嚴重危害人類健康。隨著人民生活水平的提高，動脈粥樣硬化發病率呈逐年遞增趨勢且呈現年輕化。在動脈粥樣硬化的形成機制中，炎癥反應被證實參與了動脈粥樣硬化的發生、發展及轉歸［2］。多種免疫細胞參與了動脈粥樣硬化的炎癥反應，其中單核細胞募集是動脈粥樣硬化炎癥反應中的早期事件，進入內皮下的單核細胞轉化為巨噬細胞，巨噬細胞吞噬脂質形成泡沫細胞，成為粥樣斑塊形成的基礎［4］。然而，巨噬細胞有異質性的特點，即根據局部微環境的不同起到促炎或抗炎的作用，稱之為巨噬細胞極化。最經典的分型為通過經典途徑激活的M1型和通過選擇性途徑激活的M2型，M1型巨噬細胞高表達iNOS、IL-6、IL-1β、IL-23、腫瘤細胞因子-α等，有促炎及促動脈粥樣硬化形成的作用；M2型巨噬細胞高表達ArgⅠ、IL-10、轉化生長因子-β等，有抗炎和抗動脈粥樣硬化的作用［3］；兩者均存在于粥樣斑塊中，呈現動態平衡，可以相互轉化［5］。研究［6］顯示，巨噬細胞亞型與斑塊的穩定性相關，在不穩定性斑塊中，M1型巨噬細胞占主導地位；而在穩定斑塊中，更多表現為M2型巨噬細胞；在易損的斑塊肩部，M1型巨噬細胞個數遠多于M2型巨噬細胞，而在相對穩定的纖維帽中，M1型巨噬細胞與M2型巨噬細胞數目相似，相對于巨噬細胞的絕對個數而言，亞型所占的比例對斑塊的穩定性影響更大［7］。

圖5　細胞培養上清液中IL-10水平

本研究就經典的巨噬細胞極化分型為理論基礎，采用小鼠巨噬細胞株RAW264.7進行細胞培養，分別給予LPS+IFN-γ、IL-4進行極化造模，在誘導極化的同時加入不同濃度替米沙坦進行干預，研究結果可見替米沙坦對M1型巨噬細胞表面標志物iNOS、IL-6的表達有抑制作用，隨著替米沙坦濃度的增加，iNOS、IL-6的表達水平進一步下降，差異有統計學意義。同時檢測ArgⅠ、IL-10，與M1組比較，替米沙坦干預組ArgⅠ、IL-10的表達水平明顯增加，隨著替米沙坦濃度的增加，Arg I、IL-10的表達水平進一步增加，差異有統計學意義。提示，替米沙坦有抑制巨噬細胞向M1型分化的作用，隨著濃度的增加，其抑制作用進一步增強，有誘導M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉化的趨勢。

巨噬細胞極化受多種信號通路及轉錄因子調控［8］。其中，過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）是一種在巨噬細胞中高表達的核受體，參與脂質代謝和阻止動脈粥樣硬化的進程。PPAR-γ在IL-4誘導的巨噬細胞中通過STAT-6途徑高表達，可通過抑制NF-κB途徑和AP-1途徑表達抗炎物質，是一種影響M2型巨噬細胞極化的重要轉錄因子［9］。M2型巨噬細胞表面標記物的表達與PPAR-γ呈正相關，PPAR-γ的活化可以促使單核細胞向M2巨噬細胞的分化［10］。替米沙坦有選擇性激活PPAR-γ作用。本課題組前期研究［11］表明替米沙坦通過促進PPAR-γ的表達保護血管內皮，抑制動脈粥樣硬化進展。推測替米沙坦可能通過促進PPAR-γ表達，促進M1型巨噬細胞向M2型轉化。

綜上所述，替米沙坦對小鼠巨噬細胞RAW264. 7的M1型極化有著抑制作用，促進M1型巨噬細胞向M2型轉化，為替米沙坦的抗動脈粥樣硬化作用提供了可能的新機制。

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Effect of Telmisartan on mice macrophage M1/M2 polarization

Xing Yiming，Hu Zeping，Wang Bangning，et al
（Dept of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the effect of Telmisartan on the M1/M2 polarization of mice macrophage. Methods Mice macrophage was induced to M1/M2 polarization by LPS+IFN-γ and IL-4 respectively，and tested by immunofluorescence.Meanwhile cells were treated with 0.1，1，10 μmol/L Telmisartan，blank control group and vehicle control group were established at the same time.The biomarkers iNOS and ArgⅠwere tested by Western blot，and the cytokines IL-6 and IL-10 were tested by ELISA assay.Results The biomarker iNOS and IL-6，secreted by M1 macrophage，were apparently increased in the macrophages induced by LPS+IFN-γ.However，after being treated with Telmisartan，the expressions of iNOS and IL-6 were obviously decreased（P＜0.05），as the concentration higher the expression lower.While，the expression of Arg I and IL-10，which represented the M2 macrophage，increased（P＜0.05）.Conclusion Telmisartan can inhibit the M1 polarization of mice macrophage RAW264.7 induced by LPS and IFN-γ and transform M1 macrophage polarization to M2 macrophage polarization.

Telmisartan；macrophage M1/M2 polarization；inflammation

R 392

A

1000-1492（2016）07-0989-05

2016-04-21接收

高等學校博士學科點專項科研基金（編號：20123420120005）；安徽高校省級自然科學研究重點項目（編號：KJ2012A147）

1安徽醫科大學第一附屬醫院心血管內科，合肥 2300222安徽醫科大學分子生物學實驗室，合肥 230032

邢亦明，女，碩士研究生；王邦寧，女，主任醫師，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：wangbangning@medmail.com.cn；胡澤平，男，副教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：1431318679@qq.com