吸煙對類風濕關節炎外周血芳香烴受體的影響

程 琳，錢 龍，李向培，厲小梅，汪國生

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吸煙對類風濕關節炎外周血芳香烴受體的影響

程 琳1，錢 龍2，李向培1，厲小梅1，汪國生1

目的 檢測吸煙類風濕關節炎（RA）患者和健康者外周血單個核細胞（PBMCs）中芳香烴受體（AHR）、芳香烴受體抑制因子（AHRR）、細胞色素P4501A1（CYP1A1）的表達水平，探討吸煙影響RA發生、發展的可能原因。方法 采用熒光定量PCR檢測58例RA患者和30例健康者PBMCs 中AHR、AHRR、CYP1A1 mRNA的相對表達量，分析吸煙對3者表達的影響。結果 RA吸煙組AHR、AHRR、CYP1A1 mRNA的表達明顯高于非吸煙組（P＜0.05），而健康者吸煙組與非吸煙組AHR、AHRR、CYP1A1 mRNA的表達差異無統計學意義；RA吸煙者AHR mRNA的表達明顯高于健康吸煙者（P＜0.05），而RA非吸煙者與健康非吸煙者之間差異無統計學意義。結論 RA中可能存在某種途徑使AHR易被煙草化合物活化，進而致AHR、AHRR、CYP1A1 mRNA高表達，使香煙成為RA的危險因素。

關節炎，類風濕；吸煙；芳香烴受體抑制因子；細胞色素P450

網絡出版時間：2016-6-6 13：52：32 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.038.html

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以對稱性多發性關節炎為主要表現的自身免疫性疾病，其發病率約1%［1］。研究［2］表明RA患者持續吸煙會導致更高的疾病活動性和更嚴重的致殘性，而煙草中許多化合物是芳香烴受體（Aryl hydrocarbon receptor，AHR）高親和力配體，可能參與AHR活化的信號途徑。AHR在配體如二噁英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）存在下，可影響細胞的發育分化，AHR功能的缺陷或者亢進都可導致免疫功能紊亂［3-4］。細胞色素 P4501A1（cytochromeP4501A1，CYPlAl）是酶細胞色素P450家族成員，是目前研究最多的應答基因，AHRR是 AHR抑制因子，是一種負反饋轉錄因子。AHR被香煙中化學物如TCDD激活后，二者表達明顯升高［2，5-6］。該實驗通過檢測單個核細胞（PBMCs）中AHR、AHRR及CYP1A1 mRNA的表達，分析吸煙對3者的影響，探討吸煙影響RA發生發展的可能原因，為臨床治療RA提供線索。

1　材料與方法

1.1病例資料 RA吸煙組：男14例，女15例，年齡29～72（50.9±1.0）歲，病程0.5～30年；RA非吸煙組：男15例，女14例，年齡29～69（47.5± 7.7）歲，病程0.25～38年，均為2014年4月～2014 年12月于安徽醫科大學附屬省立醫院門診和住院部就診的未使用過來氟米特的患者，且當前僅使用甲氨蝶呤，兩組間差異無統計學意義。RA診斷符合美國風濕病學會（ACR）1987年分類診斷標準。健康者吸煙組：男8例，女 7例，年齡 29～70（48.8 ±0.9）歲；健康者非吸煙組：男8例，女7例，年齡28～71（47.2±1.3）歲，健康者來源于我院同期體檢中心。RA組與健康組中吸煙者均持續長期吸煙［2］，且為主動吸煙。為排除體內炎癥因子過高可能對實驗結果造成影響，患者無關節腫痛，血沉（erythrocyte sedimentation rata，ESR）、C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）均為正常水平且DAS28＜3.2。

1.2熒光定量PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術檢測 采集符合兩組標準的靜脈血5 ml于抗凝管中，用Ficoll-Hypaque密度梯度分離法加淋巴細胞分離液分離PBMCs。分離出的PBMCs加1 ml TRIzol吹打混勻提取總RNA，反轉錄獲得cDNA。以cDNA為模板，SYBR Green RT-PCR檢測外周血中AHR、AHRR、CYP1A1 mRNA的表達。其中按試劑盒內說明書建立PCR反應體系，總體積為20 μl。反應條件：95℃30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，循環40次。引物設計及合成：在NCBI數據庫中查找人AHR、AHRR、CYP1A1基因整個序列，以β-actin作為內參基因。以Primer Ex.press 2.0軟件設計擴增模板的引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。數據通過使β-actin參照基因作標準化處理得到ΔCt（ΔCt=待測基因Ct-β-actin Ct），病例樣本基因相對于對照樣本基因的量常用2-ΔΔCt計算獲得。（ΔΔCt=ΔCt病例-ΔCt對照）。

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表1　引物序列

1.4RA活動性評分 采用DAS28［7］評分RA疾病活動，以28個關節計分，包括雙肩、雙肘、雙腕、雙手掌指關節、雙手近端指間關節、雙膝關節。

1.3其他臨床指標檢測 魏氏法測ESR，免疫散射比濁法測CRP，ELISA檢測抗CCP抗體，試劑購自歐蒙（德國）醫學實驗診斷有限公司，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

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1.5統計學處理 采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，計量資料正態分布以±s表示，非正態分布以中位數（下四分位數，上四分位數）表示；兩組間符合正態分布和方差齊性采用t檢驗，不符合正態采用秩和檢驗；變量間符合正態分布用Pearson相關分析，變量間非正態分布用Spearman相關分析。

2　結果

“劉先生嗎？”車里一個人問。劉雁衡低頭一看，是司機老黃，便點點頭。老黃朝后座那人說了句什么。車門隨即打開，一個高大的軍人走下來。

RA是一種慢性自身性免疫疾病，主要以破壞性多發性關節炎為主要表現，同時還可有許多關節外表現，其確切的病因和發病機制仍不清楚，一般認為主要是多種環境因素和遺傳因素共同作用的結果。在環境因素中煙草中多種化合物如鹵代芳香烴類、TCDD、多環芳香烴類苯并二奈、BAP、3-MC是AHR的強激動劑，通過結合AHR進而激活其經典信號通路或旁路途徑，調節 T細胞、B細胞、DC細胞、巨噬細胞等細胞的分化及炎性細胞因子的分泌，導致免疫疾病的產生包括RA［8］。O′Donnell et al［9］在斑馬魚活體內實驗，表明LEF原型可抑制斑馬魚魚鰭再生的作用；同時用LEF處理WT Hep1c1c7細胞，其應答基因CYPlAl表達明顯上調，表明LEF是AHR配體且對AHR及其應答基因有影響。因此，本實驗為排除LEF對 AHR影響，選用的吸煙和非吸煙RA患者均未使用過LEF。

圖1　AHR mRNA相對表達量的比較

圖2　AHRR相對表達量的比較

2.5AHRR mRNA與CYP1A1 mRNA表達的相關性 RA患者AHRR mRNA與CYP1A1 mRNA的表達呈正相關（P=0.013，rs=0.363）。

圖3　CYP1A1相對表達量的比較

Xk的估計值為以及當前狀態對應的誤差相關矩陣為Rk|k。卡爾曼濾波分為2個階段：預測和測量更新。首先，KF根據上一時刻系統狀態的估計值對當前狀態做出預測：

2.4AHR mRNA表達量在組間的比較 RA患者外周血AHR mRNA的表達［1.55（0.82，2.46）］明顯高于健康者［0.73（0.18，1.91）］，差異有統計學意義（P=0.005，Z=-2.780）；RA吸煙者 AHR mRNA的表達［2.23（1.19，3.33）］高于健康吸煙者［0.24（0.080，3.13）］，差異有統計學意義（P= 0.014，Z=-2.450）；而RA非吸煙者［1.03（0.54，2.00）］與健康非吸煙者［1.12（0.67，1.91）］差異無統計學意義（P=0.939，Z=-0.076）。見圖4。

2.3CYP1A1 mRNA相對表達水平 RA吸煙組CYP1A1 mRNA表達水平［1.12（0.61，2.87）］高于RA非吸煙組［0.75（0.28，1.48）］，差異有統計學意義（P=0.027，Z=-2.207）；健康者吸煙組CYP1A1 mRNA水平［0.10（0.01，0.42）］與健康者非吸煙組［0.21（0.09，0.28）］比較，差異無統計學意義（P=0.379，Z=-0.923）。見圖3。

2.6關于臨床數據研究 吸煙RA患者AHR mRNA、AHRR mRNA與CYP1A1 mRNA的表達與其臨床相關參數均無相關性，見表2。

2.1AHR mRNA相對表達水平 RA吸煙組AHR mRNA水平［2.16（1.15，3.22）］顯著高于 RA非吸煙組［1.02（0.56，1.91）］，差異有統計學意義（P= 0.003，Z=-3.747）；健康者吸煙組AHR mRNA表達水平［1.922（0.245，4.460）］與健康者非吸煙組［1.118（0.671，1.912）］差異無統計學意義（P= 0.254，Z=-1.141）。見圖1。

圖4　AHR mRNA相對表達量

表2　RA吸煙者外周血AHR mRNA、AHRR mRNA和CYP1A1 mRNA相對表達和其臨床指標相關性

3　討論

2.2AHRR mRNA相對表達水平 RA吸煙組AHRR mRNA表達水平［1.684（0.808，3.595）］明顯高于RA非吸煙組［0.87（0.46，1.93）］，差異有統計學意義（P=0.032，Z=-2.139）；健康者吸煙組AHRR mRNA水平［0.24（0.15，4.46）］與健康者非吸煙組［1.12（0.67，1.91）］比較，差異無統計學意義（P=0.899，Z=-0.154）。見圖2。

AHR的活化主要為經典途徑，即在沒有配體條件下，AHR與伴侶蛋白在胞質中保持無活性。在配體如香煙中化學物TCDD等存在時，AHR與伴侶蛋白解離，與TCDD形成復合物，易位到細胞核，形成復合物結合到細胞核啟動子區外源反應元件特殊DNA序列，調節下游基因如 CYP1A1、AHRR的表達［10］。AHR也可在配體存在下，通過誘導調節性T細胞的表達，激活轉錄因子NF-κB，或者通過抑制產生IL-17的Th17細胞進而調控免疫系統疾病如RA［11-12］。AHR可能在配體作用下活化，激活下游基因，進而產生炎癥反應和免疫疾病發生，也可在配體下抑制炎癥產生，表明AHR有兩面性。本實驗主要探討煙草中化合物作用于AHR產生免疫疾病如RA的過程的有關研究。

流行病學證明吸煙是RA的重要危險因素，同時證明RA患者持續吸煙會導致更嚴重的疾病過程。Tamaki et al［13］用3-MC處理來自RA患者的成纖維細胞樣滑膜細胞系MH7A，檢測到AHR應答基因CYPlAl mRNA明顯升高，同時在RA中起重要作用的促炎細胞因子IL-1β mRNA也明顯高表達，且該過程可被AHR拮抗劑萘黃酮所阻斷，TCDD、BAP處理MH7A系也得到與3-MC同樣結果，表明煙草中多種化合物可激活AHR，進而上調促炎細胞因子的表達，導致RA的發展。Brauze et al［14］用TCDD處理大鼠，處理組中鼠肝臟中AHR、AHRR及CYP1A1的mRNA的表達水平明顯高于對照組。Kazantseva et al［2］提取吸煙和非吸煙RA患者滑膜，結果得出吸煙RA患者滑膜中AHRR和CYP1A1明顯高于非吸煙者，表明香煙中許多化合物可能作用于AHR，使其活化，進而致AHRR和CYP1A1高表達。基于以上研究，推斷香煙中的多種化合物可能通過活化AHR，使應答基因CYP1A1和AHRR高表達，啟動一系列信號通路，使各種促進因子的表達上調，進而促進RA的發生發展，成為其危險因素。

目前探討吸煙為RA危險因素的可能原因的研究也越來越多，但尚缺乏外周血中相關研究。本實驗首次通過檢測RA吸煙患者與RA非吸煙患者外周血AHR及其應答基因AHRR和CYP1A1 mRNA的表達，通過分析比較結果，推測吸煙影響RA發生、發展的可能原因。本研究表明RA吸煙患者外周血AHR、AHRR、CYP1A1的mRNA表達顯著高于非吸煙患者，與研究［8，13-14］一致，提示吸煙可能通過上調AHR使其活化，其應答基因如AHRR和CYP1A1 mRNA高表達，進一步激活炎性信號通路，參與RA的發病機制，使得吸煙成為 RA的危險因素。本實驗表明RA患者外周血AHR mRNA的表達顯著高于健康者，與研究［15］一致，同時得出RA吸煙者AHR mRNA的表達明顯高于健康吸煙者，而RA非吸煙者與健康非吸煙者之間差異無統計學意義，進一步說明香煙可能使RA外周血中AHR高表達。CYP1A1與AHRR呈明顯正相關性，與Kazantseva et al［2］在RA滑膜組織研究一致。RA吸煙者外周血AHR、CYP1A1、AHRR的mRNA表達與患者RF、抗CCP、疾病病程及吸煙量無相關性，可能因為影響臨床資料因素如感染、肥胖、基因遺傳多態性及樣本量大小等較多。

（3）保安全，增強水運保障能力。堅決守住安全這條底線紅線。加快實施渡改橋工程，全面取消一、二類江河渡口和車渡，逐步取消其他渡口。提高安全標準，積極推進庫區渡口渡船標準化建設。強化安全風險防控和隱患治理，加快安全監測巡航救助一體化建設，提升應急救援能力。全面履行監管職責，構建以“行業監管責任、政府屬地責任、企業主體責任”為支撐的安全責任鏈。

綜上所述，RA中可能存在某種途徑使外周血PBMCs中AHR易被活化，導致AHR及其下游基因CYP1A1和AHRR mRNA高表達，進而激活炎性信號途徑，參與RA的發病機制，成為RA的危險因素，而AHR可能為臨床治療RA提供更多途徑。

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Effect of smoking on peripheral blood aryl hydrocarbon receptor of rheumatoid arthritis

Cheng Lin1，Qian Long2，Li Xiangpei1，et al
（1Dept of Rheumatology and Immunology，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；2Dept of Rheumatology and Immunology，Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To explore the possible reasons of the influence about smoking on rheumatoid arthritis（RA）through detecting the mRNA levels of aryl hydrocarbon receptor（AHR），its response gene cytochrome P4501Al （CYPlA1）and the repressor AHRR in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）of both patients and healthy controls.Methods Real-time PCR was used to assess the expression of peripheral blood AHR，AHRR，CYP1A1 from 58 patients with RA and 30 healthy subjects，then effects of smoking on the expression of AHR，AHRR and CYP1A1 were analyzed.Results The expressions of AHR，AHRR and CYP1A1 at mRNA level were significantly higher in patients who were smoking than those who were non-smokers（P＜0.05）.However，there were no statistically significant differences between smoking healthy subjects and nonsmoking controls.Furthermore，we concluded that the expression of AHR was obviously increased in smoking RA patients than that in smoking healthy controls（P ＜0.05），and no significant differences were found between nonsmoking patients and nonsmoking healthy subjects. Conclusion Smoking is involved in the pathogenesis of RA and then becomes a risk factor which may influence the expression of AHR，AHRR，CYP1A1 in PBMCs from patients with RA.

arthritis，rheumatoid；smoking；aryl hydrocarbon receptor repressor；cytochrome P4501A1

R 593.22

A

1000-1492（2016）07-1006-05

2016-03-23接收

中華醫學會臨床醫學科研專項資金-風濕病學發展與研究資金項目（編號：12040800380）

1安徽醫科大學附屬省立醫院風濕免疫科，合肥 2300012安徽醫科大學第二附屬醫院風濕免疫科，合肥 230601

程 琳，女，碩士研究生；錢 龍，男，教授，碩士生 導師，責任作者，E-mail：clahu2013@126.com