韓國產炒紫蘇子甲醇提取物的體外抗氧化及抗突變效果

宋家樂,顧廉潔，李雪梅,胡曉佳,周燕園,趙超超

(1.桂林醫學院公共衛生學院，廣西桂林 541004；2.廣西高校預防醫學重點實驗室,廣西桂林 541100;3.韓國國立釜山大學食品科學與營養學科,釜山 609-735)

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韓國產炒紫蘇子甲醇提取物的體外抗氧化及抗突變效果

宋家樂1,2,3,顧廉潔1，李雪梅3,胡曉佳3,周燕園1,趙超超1

(1.桂林醫學院公共衛生學院，廣西桂林 541004；2.廣西高校預防醫學重點實驗室,廣西桂林 541100;3.韓國國立釜山大學食品科學與營養學科,釜山 609-735)

目的:探討三種韓國產炒紫蘇子甲醇提取物(PSE)的體外抗氧化能力及抗突變能力。方法:以DPPH自由基、羥基自由基清除實驗結合亞鐵離子螯合實驗,總還原力及亞油酸自氧化抑制實驗評價三種PSE的體外抗氧化能力。鼠傷寒沙門氏菌突變回復Ames法評價體外抗突變能力。結果:三種PSE均具有較好的體外自由基清除能力和金屬離子螯合能力,但其對DPPH自由基和羥基自由基的清除能力均弱于標準抗氧化劑叔丁基羥基茴香醚(BHA)。同時,三種PSE的總還原力和亞油酸自氧化抑制能力均強于BHA。此外,三種PSE中均含有較為豐富的多酚,黃酮和抗壞血酸;且對致突變劑N-甲基-N′-硝基-亞硝基胍(MNNG)誘發沙門氏菌TA100突變的抑制能力呈濃度依賴關系。結論:三種韓國產炒紫蘇子具有的較強抗氧化能力和抗突變能力。三種韓國產紫蘇子所具有的抗氧化能力和抗突變能力可能與其所含豐富的抗氧化物質有關。

炒紫蘇子,提取物,抗氧化能力,抗突變活性

紫蘇子是唇形科(Labiate)一年生草本植物紫蘇(PerillafrutescensBritt var. japonica)的干燥成熟果實,因其富含亞麻酸、亞油酸等不飽和脂肪酸、氨基酸和蛋白質而日漸成為一種大眾矚目的保健食品原料[1-2]。紫蘇子的加工,除傳統的壓榨制取紫蘇子油外,高溫炒制也是一種較常見的加工方式。有研究表明,炒紫蘇子具有抗氧化[3-4]、抗過敏[5]、抗炎癥[6-7]、提高免疫力[8]、降血脂[9]、抗應激[10]、抗血小板凝結[11]和提高小鼠智力[12]等生物學功能。而在同為亞洲國家的韓國,炒紫蘇子也被當地人認為是一種藥食同源保健品。目前,國內對炒紫蘇子抗氧化的實驗研究僅限于動物實驗[3-4],對其體外抗氧化效果的研究相對較少。因此本實驗旨在研究三種韓國產炒紫蘇子提取物的體外抗氧化能力以及對鼠傷寒沙門氏TA100菌突變回復能力的影響效果。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

炒紫蘇籽“Tayou”(批號:KDA-ML-2014-001)、“Guangyi”(批號:KDA-ML-2014-023)和“Duwu”(批號:KDA-ML-2014-041),由韓國農村經濟合作發展廳國立食糧研究所提供。經低溫冷凍干燥后保管于韓國國立釜山大學食品營養學科分子營養學研究室待用。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、脫氧核糖、過氧化氫、Ferrozine試劑、抗壞血酸(Ascorbic acid)、沒食子酸(Gallic acid,GAE)、蘆丁(rutin)和BHA均購自美國Sigma公司。亞油酸、二甲亞砜(DMSO)、D-6-glucose-6-phosphate(NADP)、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)購自日本關東化工有限責任公司。其他試劑均為分析純購自韓國SAMCHUN純藥工業株式會社。

R-114旋轉蒸發儀瑞士Buchi公司;MIR-254生化培養箱日本三洋電機株式會社;VS-15CFN冷凍離心機韓國Vision科學株式會社;UV-2401PC分光光度計日本島津制作所株式會社;Bio-Rad 680酶標儀美國Bio-Rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1紫蘇子甲醇提取物(PSE)的制備取冷凍干燥后的炒紫蘇子10 g,研磨成細粉后按照料液比1∶20加入200 mL甲醇入錐形瓶中,28 ℃室溫條件下連續攪拌24 h。收集樣品甲醇提取液,50 ℃減壓旋轉蒸發制備得炒紫蘇子甲醇提取物(PSE)。PSE以DMSO為溶劑配制成濃度為20 mg/mL的儲備液,-20 ℃條件下保管待用[3]。“Tayou”、“Guangyi”和“Duwu”這三種炒紫蘇子的甲醇提取物分別以PSET、PSEG和PSED表示。

1.2.2DPPH自由基清除實驗96孔板中加入樣品和DPPH(150 μmol/L)溶液各100 μL,混勻后,室溫下避光反應30 min后,540 nm處測定吸光度OD值,按照公式:清除率(%)=[1-(OD樣品-OD樣品空白)/OD空白]×100計算。

1.2.3羥基自由基清除實驗取200 μL的樣品放入玻璃試管,并加入6 mmol/L的脫氧核糖,過氧化氫(3 mmol/L),PBS(pH7.4,20 mmol/L),氯化鐵溶液(400 μmol/L),EDTA溶液(400 μmol/L)和抗壞血酸溶液(400 μmol/L)各200 μL。37 ℃水浴培養1 h。隨后加入1% TBA和2.8% TCA溶液各1 mL,90 ℃水浴中培養30 min。加正丁醇提取色素并在3000 r/min條件下離心5 min,取上清于532 nm處測定吸光度OD值。按照公式:清除率(%)=(OD空白-OD樣品)/OD空白×100計算。

1.2.4總還原力測定以PBS(pH6.6,20 mmol/L)配制1 mL樣品液,加入濃度為10 mg/mL的鐵氰化鉀溶液1 mL,混勻后在50 ℃水浴中孵育20 min。再加入濃度為100 mg/mL的TCA溶液200 μL,在3000 r/min條件下離心10 min。取0.5 mL上清液加0.5 mL蒸餾水和1 mg/mL的氯化鐵溶液0.1 mL后混合,在700 nm處讀取OD值。吸光度越高說明樣品的總還原力越強。

1.2.5亞鐵離子螯合能力測定取不同濃度PSE提取物加入濃度為2 mmol/L氯化亞鐵溶液50 μL,室溫孵育后加入5 mmol/L的Ferrozine試劑200 μL,最后加入800 μL甲醇溶液。反應10 min后,在562 nm處讀取吸光值。亞鐵離子螯合能力=[1-(樣品溶液的吸光度值/空白溶液的吸光度值)]×100%。

1.2.6亞油酸過氧化抑制能力測定在2.5 mL混合亞油酸乳劑(0.2 mol/L,pH7.0)體系中加入0.5 mL不同種類的PSE(樣品濃度為200 μg/mL)和2.5 mL的PBS緩沖液(0.2 mol/L,pH7.0)。將反應混合物置于37 ℃黑暗條件下連續培養7 d。每天取樣并依次加入5 mL的75%乙醇,0.1 mL濃度為20 mol/L的硫氰酸銨溶液(以3.5%鹽酸配制),混勻后放置3 min。在500 nm處讀取吸光度值。

1.2.7抗氧化物質總酚酸、總黃酮和抗壞血酸的測定將0.1 mL的PSE樣品中加入10%的碳酸鈉溶液2 mL反應5 min,再加入0.1 mL的福林酚試劑并置避光處反應30 min。750 nm測定吸光度值。總酚含量以GAE為標準計算并表示為mg GAE/g。比色法測定PSE中的總黃酮含量,取0.5 mL的PSE與2 mL蒸餾水混合,加入0.15 mL濃度為10%氯化鋁溶液后在510 nm處測定吸光度值。總黃酮含量以蘆丁為標準計算并表示為mg Rutin/g。PSE(50 mg)加入10 mL濃度為1%的偏磷酸溶液提取。在過濾濾液1 mL中加入2 mL 的9,6-二氯靛酚溶液,反應10 min后讀取515 nm處吸光度值。總抗壞血酸含量以抗壞血酸(Ascorbic acid)為標準計算并表示為mg Ascorbic acid/g。

1.2.8抗突變能力測定選用引自美國加州大學Ames實驗室,并經菌株特性鑒定實驗且符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養缺陷型菌株TA100,采用平板滲入法,計算回變菌落數。每個樣品分設50～200 μg/皿四個劑量組,每組5個平行皿,同時設自發回變和對照組。滅菌試管中加入PBS和含菌培養基(2×109cells/mL)各0.1 mL,不同濃度的PSE樣品和致突變物MNNG各50 μL。充分混勻后,37 ℃下預培養30 min后加入2 mL頂層培養基。混勻平鋪于事先制備好的底層培養基上。48 h培養后計算菌落數。以抗突變抑制率表示實驗結果。

1.3數據分析

2　結果與分析

2.1三種PSE對DPPH自由基和羥基自由基·OH的清除能力

自由基是生物體組織內有氧呼吸過程中所產生的代謝副產物,過多自由基的堆積會導致組織發生氧化應急損傷,危及生物體健康;而合理使用抗氧化劑清除體內過多的自由基,有助于緩解氧化應激損傷[13]。如表1示,三種PSE提取物對DPPH自由基均具有良好的清除能力。其中PSED對DPPH自由基的半清除劑量IC50小于PSET和PSEG,但高于人工合成抗氧化劑BHA的IC50。同時,三種PSE也具有一定較好的對·OH自由基清除能力,結果與王欽富等結果較為一致[4]。PSET對·OH自由基的IC50小于PSEG和PSED,但高于BHA。總體而言,三種韓國產PSE對DPPH自由基和·OH自由基均具有一定的清除能力,但清除效果較人工合成抗氧化劑BHA稍弱。

表1　三種韓國產PSE對DPPH· 和·OH的半清除劑量IC50(μg/mL)Table 1　The IC50 of three kinds of roasted Korean perilla seed(PSE)to against DPPH and ·OH radicals(μg/mL)

注:同列不同字母表示各組數值與對照組相比差異顯著(p<0.05)。

2.2三種PSE對亞鐵離子螯合能力的影響

通過螯合亞鐵離子等具有高度活性的金屬離子則能抑制這些過量的金屬離子導致的脂質過氧化,并減少其造成的脂質過氧化物的過量產生,從而間接反映出抗氧化劑的體外抗氧化能力[14]。如圖1所示,三種韓國產PSE隨著濃度的增高,其對亞鐵離子的螯合能力也呈增強趨勢。在最高濃度200 μg/mL處理時,PSED的亞鐵離子螯合能力要稍強于PSET和PSEG。但三種韓國產PSE對亞鐵離子的螯合能力均弱于EDTA-2Na對亞鐵離子的螯合能力。

圖1　三種韓國產PSE對亞鐵離子螯合能力的影響Fig.1　Effect of three roasted Korean perilla seed (PSE)on ferrous ion chelating

2.3三種PSE對抑制亞油酸過氧化能力的影響

如圖2示,在利用濃度為200 μg/mL的PSE干預不飽和脂肪酸亞油酸自氧化過程時,與對照組相比三種PSE均能有效降低亞油酸混合物在500 nm處的吸光度值,較低的A500 nm吸光度值則意味著反應體系中不飽和脂肪酸發生自氧化后所生成的氧化產物量的減少,從而提示樣品抑制亞油酸自發過氧化的能力強。隨著實驗時間的延長,在實驗的第7 d,PSED處理后的反應混合物在500 nm處的吸光度值(A500=0.217)低于PSEG(A500=0.242),與PSET(A500=0.226)接近,但遠遠低于對照組(A500=0.670),這些結果提示三種PSE都具有較強的亞油酸自氧化抑制能力,但其作用效果要弱于人工合成抗氧化劑BHA。

圖2　韓國產PSE對亞油酸過氧化抑制能力的影響Fig.2　Effect of three roasted Korean perilla seed(PSE) on linoleic acid auto-oxidation inhibition activity

2.4三種PSE對總還原能力的影響

如圖3所示,隨著各PSE處理濃度的增加,其總還原能力也隨之增強,并呈現出劑量效應關系。在最高濃度200 μg/mL處理時,三種韓國產PSE提取物的吸光度值均高于人工抗氧化劑BHA。結果提示三種PSE都具有較強的將亞鐵離子(Fe2+)還原成鐵離子(Fe3+)的供電子能力(即還原能力強)。而研究也發現,具有抗氧化活性的物質的總還原能力與其自身的抗氧化能力存在一定聯系,即抗氧化劑的總還原能力越強則其抗氧化能力越高[15]。

圖3　三種韓國產PSE對總還原能力的影響Fig.3　Effect of three roasted Korean perilla seed (PSE)on reducing power

2.5三種PSE中主要抗氧化活性成分含量

研究顯示,植物提取物中多酚含量與其自身的抗氧化能力存在正關系,即含量越多則抗氧化能力越強[13]。而作為植物中次生代謝產物之一的多酚、黃酮類物質則具有清除自由基,抗脂質過氧化和提升體內抗氧化水平的功能作用;且保護心腦血管和抗癌、抗炎活性較強[14]。這些源自天然植物中的多酚黃酮類物質在具有強大抗氧化能力的同時,其毒性要遠遠小于人工合成抗氧化劑,被大量用作食品添加劑以維護人體健康[16]。如表2所示,三種韓國產PSE中均含有豐富的總酚酸、總黃酮和抗壞血酸等抗氧化活性成分。其中PSEG中總酚酸、總黃酮和抗壞血酸的含量較PSED和PSET中的含量要高。此結果與前述三種PSE的總還原力結果一致,提示提取物中的酚酸類、黃酮類以及抗壞血酸類物質對PSE的體外抗氧化能力提供主要貢獻。

表3　三種韓國產PSE對在N-甲基-N′-硝基-亞硝基胍誘導下TA100 菌株的抗突變效果Table 3　Inhibitory activity of three roasted Korean perilla seed(PSE)against N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine induced mutations of Salmonella Typhimurium strain TA100

注:同列不同字母表示差異顯著(p<0.05),與對照組字母標注不同表示與對照組差異顯著(p<0.05),括號內的數據表示抑制率。

表2　三種韓國產PSE中總酚酸、總黃酮和抗壞血酸含量Table 2　Contents of polyphenols,flavonoids and ascorbic acid in three roasted Korean perilla seed(PSE)

2.6三種PSE抗突變效果影響

研究中,在直接致突變物MNNG(0.4 μg/皿)處理時,予以不同濃度的三種韓國產PSE提取物處理后發現,TA100菌自身的突變得到抑制,且突變抑制率隨著處理濃度的增加而呈現一定的濃度劑量關系。在最高濃度200 μg/皿處理時,PSET對TA100菌的突變抑制率(40%)要高于PSED(33%)和PSEG(34%)。

3　結論

本研究發現,三種韓國產炒制紫蘇子提取物PSE都具有較好體外抗氧化能力和抗突變能力。其中,三種PSE對DPPH自由基和羥基自由基的清除半抑制劑量IC50較BHA高。但其總還原能力和亞油酸自氧化抑制能力均高于人工抗氧化劑BHA。同時,三種PSE中天然抗氧化物質的含量也較為豐富。而通過抗突變實驗,三種PSE對直接致突變劑MNNG所誘發的鼠沙門氏菌TA100也具有較強的抗突變能力,且效果呈劑量效應關系。綜合上述對三種韓國產炒紫蘇子甲醇提取物研究得出的結果提示,炒制紫蘇子是一種具有較好抗氧化能力并具有較強抗突變能力的天然保健食品。三種韓國產炒紫蘇子所具有的抗氧化能力和抗突變能力可能與其所含豐富的抗氧化物質有關。今后應對炒制紫蘇子中具有抗氧化、抗突變活性的有效成分進行進一步分離分析,使其能用于新型保健食品的開發。同時也對中韓兩國在炒制紫蘇子的工藝流程方面的差異展開深入研究。

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Antioxidant activityinvitroand anti-mutation effect of methanol extract from roasted Korean perilla seed

SONG Jia-le1,2,3,GU Lian-jie1,LI Xue-mei3,HU Xiao-jia3,ZHOU Yan-yuan1,ZHAO Chao-chao1

(1.School of Public Health,Guilin Medical University,Guilin 541004,China；2.Guangxi Colleges and University Key Laboratory of Preventive Medicine,Guilin 541004,China;3. Department of Food Science and Nutrition,Pusan National University,Busan 609-735,South Korea)

Objective:To investigate the antioxidant activityinvitroand anti-mutation effect of methanol extract from three kinds of roasted Korean perilla seed(PSE). Methods:Antioxidant activities were determined by free radical(DPPH and hydroxyl radical)scavenging assay,metal-chelating assay,reducing power and linoleic acid emulsion assay. Anti-mutation activity of PSEs was determined by Ames assay. Results:Three kinds of PSEs showed a good free radical scavenging activity and metal-chelating ability. The DPPH and hydroxyl activities of PSEs were weaker than that in butyl hydroxy anisd(BHA). Meanwhile,the reducing power and linoleic acid auto-oxidation inhibition activity of PSEs were stronger than that in BHA. In addition,these PSEs also contained higher levels of antioxidant compounds(polyphenols,flavonoids and ascorbic acid),and also dose-dependently reduced the mutagenic MNNG induced mutation inSalmonellatyphimuriumstrain TA100. Conclusion:Three kinds of roasted Korean perilla seed exhibited the great antioxidant and anti-mutation activity,which were associated with their high levels of antioxidant compounds.

roasted perilla seed;extracts;antioxidant activity;anti-mutation activity

2015-12-16

宋家樂(1983-)，男，博士，副教授，研究方向：植物天然化學及分子營養學，E-mail:songjiale@glmc.edu.cn。

廣西壯族自治區教育廳高校科學技術研究項目(LX2014257)；桂林醫學院人才科研啟動基金(04010150001)。

TS202.3

A

1002-0306(2016)15-0076-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.006