傳統發酵酸駝乳優勢菌種糞腸球菌高密度培養技術的研究

沙吉坦穆·克依斯爾,古麗皮艷·托乎提,努麗艷·阿不都米力克,迪麗努爾·依力哈木,努爾古麗·熱合曼

(新疆師范大學生命科學學院,新疆烏魯木齊 830054)

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傳統發酵酸駝乳優勢菌種糞腸球菌高密度培養技術的研究

沙吉坦穆·克依斯爾,古麗皮艷·托乎提,努麗艷·阿不都米力克,迪麗努爾·依力哈木,努爾古麗·熱合曼*

(新疆師范大學生命科學學院,新疆烏魯木齊 830054)

以從傳統發酵酸駝乳中優勢菌種糞腸球菌作為濃縮型酸駝乳發酵劑的原料菌,制備糞腸球菌液芯微膠囊,以液芯微膠囊作為微反應器,將乳清粉作為基礎培養基,補充適當碳氮源、促生長因子、pH緩沖劑通過單因素實驗和響應曲面實驗優化高密度發酵培養的培養基配方。微囊化糞腸球菌的最佳培養基配方:乳清粉60 g/L,蔗糖18.22 g/L,蛋白胨35.94 g/L,胡蘿卜汁152.82 mL/L,CaCO39.21 g/L,MgSO40.28 g/L,MnSO40.18 g/L。按照此配方進行增殖培養時,糞腸球菌的菌體濃度可達到2.1×1014cfu/g。為濃縮型酸駝乳發酵劑提供依據。

液芯微膠囊,糞腸球菌,高密度培養,響應曲面法

酸駝乳,哈薩克語Shubat是利用新鮮駱駝奶經過使用自然發酵劑和傳統發酵技術發酵而成的一種乳酸菌飲料[1-2]。酸駝乳是一種營養豐富、醫療和藥物價值高、具有抗菌活力的飲品[3-4]。

新疆傳統的發酵飲料酸駝乳,由于沒有專用的發酵劑,生產過程基本上停留在自然發酵水平,不僅發酵周期長而且產品質量不穩定,安全和衛生難以得到保證[5-6]。濃縮發酵劑具有活力高、體積小、攜帶使用方便的特點,可直接用于發酵制品生產,省去擴大培養的復雜操作過程,從而簡化產品生產工藝,有利于保持產品質量的穩定,防止菌種的退化和污染[7-8]。乳酸菌濃縮發酵劑制備的關鍵是要實現對其進行高活性、高密度的培養[9]。

本研究首先采用細胞固定化技術對從酸駝乳中分離純化的糞腸球菌進行液芯微囊化處理;然后考察液芯微膠囊作為微反應器,通過單因素實驗,響應曲面實驗對微囊化乳酸菌進行培養基的優化,達到囊內菌株的濃縮培養的目的,以更進一步發展濃縮型酸駝乳發酵劑提供依據為目標。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

糞腸球菌-從傳統發酵酸駝乳中分離純化的優勢菌種。

MRS培養基(g/L)[10]:蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母膏5 g,葡萄糖20 g,K2HPO42 g,醋酸鈉5 g,檸檬酸二氨2 g,MgSO40.28 g,MnSO40.18 g,吐溫-80 1 mL,pH調節為7.0左右,121 ℃滅菌15 min,需要時加入20 g瓊脂。配制液體和固體MRS培養基,分別使用于活化菌種及其活菌計數。細胞增殖基礎培養基(g/L):乳清粉60 g,葡萄糖20 g,酵母粉20 g,MgSO40.28 g,MnSO40.18 g,CaCO35 g。

海藻酸鈉,殼聚糖,黃原膠食品級 日本新田公司;氯化鈣分析純;玉米漿北京索萊寶科技有限公司。

SW-CJ-1FD型超凈工作臺蘇凈集團;LRH-250電熱恒溫培養箱，JB-1B型磁力攪拌器上海一恒科技有限公司;LDZX-30KBS型高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠;2-16P型高速低溫離心機SIGMA公司。

1.2實驗方法

1.2.1制備微囊化的糞腸球菌根據相關文獻[10],將甘油保藏的菌株以2%的接種量接種于MRS液體培養基中,在37 ℃培養,傳代兩次。為了升高在微囊化過程中菌株的存活率,確定最佳收獲期。菌種活化培養后,按一定量接種于液體培養基中,在37 ℃恒溫條件下培養24 h,每隔2 h,以未接菌的培養基作對照,測定在600 nm處的OD值,以培養時間為橫坐標,OD600值為縱坐標,作出糞腸球菌在MRS培養基中的生長曲線。

保藏菌株接種于MRS液體培養基中,在37 ℃下兩次更新培養到穩定期。把培養液倒入滅過菌的離心杯中,離心10 min,轉速為5000 r/min,放入少量生理鹽水,制備菌懸液。

液芯微膠囊的制備:將1.5%(w/v)CaCl2溶液與0.3%(w/v)黃原膠溶液的混合液倒入已制備好的糞腸球菌懸浮液中,混合均勻,把混合液到入滅過菌的10 mL注射針筒中,慢慢推動注射器,使CaCl2,黃原膠及菌懸浮的混合液通過針尖,漸漸滴入不停磁力攪拌的0.8%(w/v)海藻酸鈉溶液中攪拌發生凝膠反應,形成具有一定大小的液芯微膠囊顆粒,繼續攪拌10 min。

外表面硬化處理:過濾液芯微膠囊,用生理鹽水沖洗,然后把它放到2%(w/v)CaCl2溶液中,對它進行硬化處理1 h。

殼聚糖包覆處理:過濾液芯微膠囊,用生理鹽水沖洗,把它放在0.3%(w/v)殼聚糖溶液中,在搖床上輕輕搖動30 min,然后用生理鹽水沖洗,最后收集微膠囊。

1.2.2胡蘿卜汁的制備首先洗干凈500 g新鮮胡蘿卜,切碎,然后加入500 mL水煮沸20～30 min,離心收集上清[11]。

1.2.3囊內細胞計數在無菌條件下稱取1 g糞腸球菌微膠囊,把它置入99 mL滅過菌的檸檬酸鈉溶液中(1%(w/v),pH6.0)溶解,微膠囊全部溶解后,使用滅過菌的生理鹽水逐步地稀釋,吸取0.5 mL稀釋液倒入滅過菌的平板中,然后倒入冷卻至45～50 ℃的MRS固體培養基,混合均勻。在37 ℃恒溫培養48 h后,對它進行菌落計數。

1.2.4單因素實驗 按照相關文獻[12-13],將不同的碳源,氮源,促生長因子及不同濃度的pH緩沖劑 CaCO3分別添加到基礎培養基中,按1%的接種量接種1.2.1中制備的微囊化糞腸球菌,調節起始pH,在一定溫度下培養一定的時間,進行囊內細胞計數。

1.3響應曲面法優化增殖培養基

按照單因素實驗結果,確定微囊化糞腸球菌增殖的生長強化因子(蔗糖,蛋白胨,胡蘿卜汁以及 CaCO3),使用旋轉中心組合設計(Central Composite Rotatable Design,CCRD)法,以四種生長強化因子作為研究對象,以菌體濃度為響應值,設計旋轉中心組合實驗,各自變量及其實驗水平編碼見表1。

表1　旋轉中心組合設計實驗因素水平及其編碼Table 1　Level and code of variables chosen for CCRD experiments

依據旋轉中心組合實驗結果,建立二次多項回歸模型方程并對它進行方差分析,對模型的系數進行顯著性檢驗,分析各因素的線性效應和交互效應,最后在一定水平范圍內求取最佳值,最后優化得到適合糞腸球菌菌體增殖的最佳培養基配方。

2　結果與分析

2.1糞腸球菌的生長特性

由圖1生長曲線可知,糞腸球菌進入對數期后,在8 h的OD值最高,之后進入穩定期。穩定期初期收獲菌株能提高菌株在微囊化過程中的存活率,因此,選擇培養8 h收獲。

圖1　糞腸球菌的生長曲線Fig.1　Grown curve of Enterococcus faecalis

2.2碳源對微囊化糞腸球菌增殖培養的影響

本實驗研究了蔗糖,葡萄糖,乳糖,麥芽糖對微囊化糞腸球菌增殖的影響。實驗結果如圖2所示。由圖2可知,當蔗糖為碳源時,菌體濃度比使用其他碳源要高。因此,選蔗糖為微囊化糞腸球菌增殖培養基的最佳碳源。

圖2　不同碳源對糞腸球菌生長的影響Fig.2　Effect of carbon source on culture of Enterococcus faecalis

2.3蔗糖濃度對微囊化類腸球菌增殖培養的影響

培養中微生物的生長直接受到蔗糖濃度的影響:如果蔗糖的濃度過低,就不能滿足菌體得生長需求,如果蔗糖的濃度太高,反而因為使滲透壓過高導致微生物的生長被受到抑制,至極還會導致菌體的死亡[12]。因此,有必要對蔗糖濃度進行進一步的確認。實驗結果如圖3所示。由圖3可知,蔗糖濃度20 g/L的實驗組菌體濃度最高,因此培養基中蔗糖的濃度選20 g/L。

圖3　蔗糖濃度對糞腸球菌生長的影響Fig.3　Effect of Sucrose concentration on culture of Enterococcus faecalis

2.4氮源對微囊化糞腸球菌增殖的影響

本實驗對蛋白胨,牛肉膏,酵母粉及胰蛋白胨對增殖培養的影響進行了研究。實驗結果如圖4所示。從圖4可知,蛋白胨為氮源時,菌體濃度比采用其他氮源的實驗組要高得多,因此,選蛋白胨為微囊化糞腸球菌增殖培養的最佳氮源。

圖4　不同氮源對糞腸球菌生長的影響Fig.4　Effect of nitrogen source on culture of Enterococcus faecalis

2.5蛋白胨濃度對增殖培養的影響

確定培養基中最佳氮源物質以后,進一步研究蛋白胨濃度對菌體增殖的影響。實驗結果如圖5所示。由圖5可知,蛋白胨濃度35 g/L時菌體濃度最大,增殖培養基中蛋白胨的濃度確定35 g/L。

圖5　蛋白胨濃度對糞腸球菌的影響Fig.5　Effect of Peptone concentration of Enterococcus faecalis

2.6促生長因子微囊化糞腸球菌增殖的影響

添加胡蘿卜汁,番茄汁,玉米漿這些營養物質可以促進乳酸菌的生長繁殖[13-14]。向培養基中分別添加不同濃度(50,100,150 g/L)的玉米漿,胡蘿卜汁和番茄汁,在37 ℃條件下培養20 h后,分別測量菌體密度,確定最佳的促生長因子。實驗結果如圖6所示。

圖6　不同促生長因子對糞腸球菌生長的影響Fig.6　Effect of various factors on growth on culture of Enterococcus faecalis

由圖6可知,三種物質都不同程度地提高了菌體的濃度,在相同的條件下,培養20 h后添加胡蘿卜汁的實驗組菌體濃度最高,由此選擇胡蘿卜汁為最佳促生長因子。由圖6可知,不能確定胡蘿卜汁的最高濃度,因此,進一步研究了胡蘿卜汁濃度的確定實驗。實驗結果如圖7所示。由圖7可知,胡蘿卜汁濃度150 g/L 時菌體的密度最大。

圖7　胡蘿卜汁濃度對糞腸球菌生長的影響Fig.7　Effect of carrot juice concentration culture of Enterococcus faecalis

2.7CaCO3濃度對增殖培養的影響

培養過程中乳酸的逐漸聚集,使pH下降,因此乳酸菌的繁殖受到抑制。因此,液芯微膠囊增殖培養基中添加適量的CaCO3,可以增強微膠囊的機械強度,緩沖環境pH的作用。實驗結果如圖8所示。由圖8可知,當加入的CaCO3的濃度為10 g/L時,菌體的濃度最高,繼續增高CaCO3的濃度,菌體濃度反而下降,因此,增殖培養基中CaCO3的濃度選為10 g/L。

圖8　CaCO3濃度對糞腸球菌的影響Fig.8　Effect of CaCO3 concentration on culture of Enterococcus faecalis

2.8向應曲面法優化糞腸球菌增殖培養基

2.8.1建立多元二次模型方程和回歸分析為了多元二次模型方程各項系數的最優擬合,按照旋轉中心組合設計實驗因素水平及其編碼表通過Design Expert軟件進行了30組實驗,其結果見表2。通過對表2中實驗數據二次多項進行回歸擬合得到糞腸球菌菌體濃度對蛋白胨,胡蘿卜汁,蔗糖和CaCO3的二次多項式的回歸方程式:Y=14.34-0.042A+0.11B-0.029C-0.047D-0.049AB-0.031AC+0.043AD+0.043BC-0.036BD-0.019CD-0.12A2-0.15B2-0.033C2-0.10D2

方程式中,糞腸球菌菌體濃度的預測值為Y,蔗糖,蛋白胨,胡蘿卜汁以及CaCO3的編碼值分別為A,B,C,D。從上方程得出的糞腸球菌的菌體濃度及其預測值見表2。

表2　中心組合設計及其實驗結果Table 2　Expermental design and results of the CCRD

表3　二次多項模型的方差分析Table 3　ANOVA for the fitted quadratic polynomial model

對二次多項回歸模型方程進行方差分析,分析的結果見表3。對模型系數顯著性檢驗見表4。

表4　回歸方程系數顯著性檢驗Tablel 4　Test of significance for regression coefficients

從表4回歸方程系數的顯著性檢驗可以知道:各實驗因素對糞腸球菌菌體密度的線性效應全顯著;并其對糞腸球菌菌體濃度的曲面效應也全顯著;AB,AC,AD,BC和BD的交互用顯著,而CD的交互的作用不顯著。

2.8.2糞腸球菌濃度的響應面交互作用與優化響應面圖9是根據多元二次方程所得到的,通過該組圖可以直觀看出來各因素交互作用對響應值的影響。

圖9　兩因素交互影響的曲面圖Fig.9　Response surface of two factors on the cell population of Enterococcus faecalis

由圖9可知,蛋白胨,蔗糖,胡蘿卜汁及CaCO3添加量的取值范圍分別在15～25 g/L,33～37 g/L,130～170 mL/L,8～12 g/L并將菌體密度確定為目標最大值,采用軟件分析得到的最佳的組合為:蔗糖18.22 g/L,蛋白胨35.94 g/L,胡蘿卜汁152.82 mL/L,CaCO39.21 g/L。此時模型預測菌體濃度為14.38(log cfu/g)。在此條件下再次進行驗證實驗,得出的菌體濃度(log cfu/g)為14.32(也就是2.1×1014cfu/g),接近于軟件的預測值14.38(log cfu/g)。這證明了用響應曲面法得到的此模型能有效地對所選的影響因子進行優化。

3　結論

根據單因素實驗,確定了蔗糖為微囊化糞腸球菌的最佳的碳源,培養基中蔗糖的最適濃度確定為20 g/L;蛋白胨為最佳的氮源,培養基中蛋白胨的最適濃度確定為35 g/L;胡蘿卜汁為最佳的促生長因子,培養基中最適的添加量確定為150 mL/L;pH緩沖劑CaCO3的最佳濃度為10 g/L。

采用設計軟件(Design-Expert 8.0.6)以蛋白胨,蔗糖,胡蘿卜汁及CaCO3四個因子作為研究對象,以菌體的濃度為響應值進行旋轉中心組合(Central Composite)實驗。最后優化的培養基配方:乳清粉60 g/L,蔗糖18.22 g/L,蛋白胨35.94 g/L,胡蘿卜汁152.82 mL/L,CaCO39.21 g/L,MgSO40.28 g/L,MnSO40.18 g/L。再次按照此配方進行驗證實驗,得出的菌體濃度(log cfu/g)為14.32(也就是2.1×1014cfu/g),接近于軟件的預測值14.38(log cfu/g)。最后按照此配方進行增殖培養時糞腸球菌的菌體濃度可到達2.1×1014cfu/g。

4　討論

濃縮型發酵劑要求有較高的菌體濃度,一般要達到1010～1011cfu/g。但傳統的懸浮細胞培養,細胞密度很難超過1010cfu/mL,需要進行昂貴的分離,濃縮方法才能達到所需的細胞密度。近年來有些人使用固定化細胞技術制備高效濃縮型發酵劑,這種方法克服了傳統懸浮培養的限制和缺點,降低了培養過程中細胞的損傷和損失,可以得到較大的細胞密度,很大程度上提高了培養效率[15-16]。

高密度培養是制備濃縮型發酵劑的技術難點之一。經過培養基的優化可以得到濃度高的菌體。培養基的組分對乳酸菌的生長有很大地影響,在實行濃縮培養時,除了要供應微生物生長所必需的碳源,氮源,生長因子等外,還需要進一步地優化培養基,目的為得到最高的生物量[17]。乳酸菌對培養基營養需求高,在實驗室往往使用MRS培養基,這種培養基的價格比較高,不適合大規模培養。

目前國外已有不少采用便宜的乳清底質培養基生產乳酸菌濃縮型發酵劑的成功先例[18-20]。國內,李艾黎[21],劉振民[22]等研制了緩沖能力強,增殖效果很好的新型pH內控型乳清培養基。該培養基勝于牛乳培養基和MRS培養基,其乳酸菌的生長速度較大。本研究的糞腸球菌在培養基優化前將MRS培養基作為增殖培養基進行了對照實驗,增殖培養后得到的菌體濃度為1.25×1010fu/g。

在高密度培養過程中微生物的培養基具有非常重要的地位。本實驗利用響應曲面法優化了適用于微囊化糞腸球菌高密度培養的培養基配方:乳清粉60 g/L,蔗糖18.22 g/L,蛋白胨35.94 g/L,胡蘿卜汁152.82 mL/L,CaCO39.21 g/L,MgSO40.28 g/L,MnSO40.18 g/L。按照配方進行增殖培養時糞腸球菌的菌體濃度可到達2.1×1014cfu/g,達到了囊內菌株的高效濃縮培養的目的。此研究結果數據以更進一步發展濃縮型酸駝乳發酵劑提供依據及可靠的數據。

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Research of the high-density cultivation technology ofEnterococcusfaecalisdominated in traditional fermented camel milk

Sajidam·KAYSER,Gulpiya·TOHTI,Nurye·ABDUMILIK,Dilnur·ELHAM,Nurgul·RAHMAN*

(School of Life Sciences,Xinjiang Normal University,Urumqi 830054,China)

In order to get high-density cultural,the dominant bacteriaEnterococcusfaecalisisolated from traditional fermented camel milk was studied as initial bacteria under different cultural conditions to make liquid-core microcapsules. Used whey powder as basal medium,the appropriate carbon and nitrogen sources,somatomedin,pH buffers was carried out on the basis of single-factor experiments,and the optimal fermentation medium formula was determined by Response surface methodology. The best cultural medium for microencapsulatatedEnterococcusfaecaliswas designed as follow:whey powder 60 g/L,sucrose 18.22 g/L,peptone 35.94 g/L,carrot juice 152.82 mL/L,CaCO39.21 g/L,MgSO40.28 g/L,MnSO40.18 g/L. Under above-mentioned recipe,the viable cell concentration reached to 2.1×1014cfu/g.

liquid-core microcapsules;Enterococcusfaecalis;high-density cultivation;Response surface methodology

2016-01-12

沙吉坦穆·克依斯爾(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：應用微生物，E-mail：sajida1026@163.com。

努爾古麗·熱合曼(1972-)，女，博士，副教授,研究方向：傳統發酵食品、益生菌資源，E-mail：nurgulum@163.com。

國家自然科學基金地區基金項目(31160333)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)15-0159-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.023