自動誘導表達體系表達片球菌素融合蛋白

檀茜倩,韓　燁,肖華志,周志江

(天津大學化工學院食品科學與工程系,食品生物技術實驗室,天津 300072)

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自動誘導表達體系表達片球菌素融合蛋白

檀茜倩,韓燁,肖華志,周志江*

(天津大學化工學院食品科學與工程系,食品生物技術實驗室,天津 300072)

分別采用IPTG誘導和自動誘導方法誘導E.coliBL21(DE3)基因工程菌表達片球菌素融合蛋白;采用稀釋方法對變性后的片球菌素融合蛋白包涵體進行復性,復性后融合蛋白經Ni-IDA柱分離純化后經腸激酶酶切得目的片球菌素蛋白;以單核細胞增多癥李氏桿菌為指示菌,采用牛津杯法測定所得到的片球菌素活性,并對其熱穩定性,耐酸堿性和耐蛋白酶活性進行了分析。實驗結果表明,經過誘導后,IPTG誘導菌液最終OD600值為3.5000,而自動誘導為7.6998,IPTG誘導融合蛋白包涵體采用尿素溶解后的蛋白濃度為0.1001 mg/mL,而自動誘導為0.2359 mg/mL;自動誘導體系所獲得的片球菌素融合蛋白產量優于IPTG誘導體系。所獲得的片球菌素對單核細胞增多癥李氏桿菌有抑制作用,熱穩定性好,耐酸性強而耐堿性弱,對胰蛋白酶,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶和蛋白酶K敏感,可以被降解。自動誘導體系可以應用于片球菌素融合蛋白的E.coliBL21(DE3)基因工程菌高效表達片球菌素。

自動誘導,IPTG,包涵體,分離純化,抑菌活性

乳酸片球菌素是由乳酸菌產生的一類具有抑菌活性的物質[1],對許多革蘭氏陽性菌有抑制作用[2],主要抑制單核細胞增多癥李氏桿菌[3],有很大的商業應用價值。目前多采用天然發酵方法獲得乳酸片球菌素[4],通過硫酸銨分級沉淀,吸附,離心,解吸附,凝膠過濾色譜,離子交換色譜和高效液相色譜的方法,逐級對片球菌素進行分離和提取,但是天然乳酸菌株片球菌素的產量小,而且在逐步純化的過程中片球菌素的活性和產量都會有所損失[5-6]。為了解決野生菌株產量低的問題,采用基因工程技術,將片球菌素蛋白基因克隆到大腸桿菌宿主內部構建基因工程菌以獲得片球菌素的高效表達[7]。目前對大腸桿菌體外表達的誘導多采用IPTG誘導方法,Studier等人采用ZYM-5052培養基實現了對大腸桿菌表達體系的自動誘導表[8],目前有部分關于采用自動誘導方法誘導大腸桿菌表達外源蛋白的報道,分別對治療蛋白,半胱氨酸蛋白酶和增殖誘導配體蛋白成功的進行了表達[9-11],這種誘導方法避免了使用IPTG 的毒性問題并且使目的蛋白產量有了很大提升,有較大的工業利用價值。目前國內外少有關于自動誘導應用于含有片球菌素基因的大腸桿菌表達系統表達片球菌素的文獻報道,值得進一步研究。由于大腸桿菌表達系統高效表達,被表達的融合蛋白常會形成不溶于水且不具有生物活性的包涵體蛋白,其復性是大腸桿菌表達系統在下游純化中的瓶頸因素[12-13],針對這一問題,本文對如何恢復自動誘導產生的乳酸片球菌素融合蛋白包涵體的活性方法進行了初探。

本論文主要分為三個部分:比較含有片球菌素基因的大腸桿菌表達系統的IPTG誘導和自動誘導;片球菌素融合蛋白包涵體的變性復性以及目的基因工程片球菌素的分離純化;基因工程片球菌素理化性質的初探。為研究片球菌素在大腸桿菌表達系統的表達和純化,以及如何獲得具有生物活性的乳酸片球菌素提供了參考。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

E.coliBL21(DE3)基因工程菌由本實驗室構建;單核細胞增多癥李氏桿菌CVCC1595中國獸醫藥品監察所;E.coliBL21(DE3)基因工程菌的培養采用LB培養基(amp+),單核細胞增多癥李氏桿菌的培養采用LB培養基。基因工程菌生長培養基為MDG培養基(amp+),自動誘導培養基為ZYM-5052(amp+)培養基。

SDS-PAGE電泳、Tricine-SDS-PAGE電泳所用試劑Sigma;氨芐青霉素genview分裝;IPTG、尿素、氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽、咪唑北京普博欣公司;Ni-IDA柱北京韋氏博慧色譜科技;重組腸激酶(rEK-B)廣州中大南海生物技術有限公司;其他試劑天津大學科威公司均為分析純。

DYCZ-24D雙垂直電泳槽北京市六一儀器廠;GIS-2009紫外凝膠成像儀Tanon公司;JY88-IIN超聲波細胞破碎儀寧波新芝;UV-1102紫外可見分光光度計上海天美;D2004W電動攪拌器上海梅穎浦儀器制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1IPTG誘導目的蛋白表達條件優化挑取甘油凍存E.coliBL21(DE3)基因工程菌接5 mL含amp+的LB培養基中,37 ℃,170 r/min震蕩過夜培養。次日將菌液以1∶100比例接種于新鮮含amp+LB液體培養基中于37 ℃,170 r/min震蕩培養1～2 h,直至菌液OD600值為0.5～0.8。在37 ℃和30 ℃兩個溫度下,以IPTG終濃度分別為1、0.5、0.25、0.125 mmol/L進行誘導。間隔1 h測量菌體的OD600值及培養基pH的變化,收集誘導結束后的菌液,適當處理后進行SDS-PAGE電泳。

1.2.2菌體的破碎以及包涵體的洗滌和溶解參考Chow等方法[14]。收集菌體沉淀,重懸于PBS緩沖液(pH7.4)中,采用溶菌酶處理,溶菌酶終濃度為2 mg/mL,在20、40、0、80、100、120 min分別取樣500 μL稀釋10倍后使用紫外-可見分光光度計測量其OD280,OD260和OD600值以測定內容物的溶出情況。將經溶菌酶處理的菌體溶液在超聲破碎儀上,于 200 W,超聲開3 s,關3 s的條件下破碎20 min。在4 ℃,8000 r/min離心20 min。棄去上清液,保留沉淀。沉淀用PBS緩沖液(pH7.4)洗滌兩次,用2 mol/L的尿素溶液洗滌一次,用0.05% Triton100 溶液洗滌一次。每次洗滌后保留樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分析以評價洗滌的效果。采用0.1 mol/L Tris·HCl,8 mol/L尿素溶液溶解洗滌后的包涵體蛋白,將包涵體蛋白沉淀重新懸于溶解液中,在4 ℃下,采用磁力攪拌器進行攪拌12 h后,將溶解液離心,取上清液并測定其蛋白濃度。

1.2.3目的蛋白的自動誘導表達挑取甘油凍存E.coliBL21(DE3)基因工程菌于含有amp+的LB平板上劃線,過夜培養。次日挑取平板上茁壯單菌落接入5 mL含amp+的MDG培養基中,37 ℃,170 r/min,過夜培養。參考Studier等[8],次日將菌液按1∶500比例接入含適量amp+的ZYM-5052培養基中在37 ℃,將搖菌速度提高到190 r/min過夜培養,待菌體變渾濁轉移入20 ℃搖床在同樣轉速下繼續培養,每間隔1 h取樣測定菌液的OD600值,當OD600值在1～2 h不發生變化時收集菌液,將菌液離心,保留上清液,經適當處理后進行SDS-PAGE電泳;將菌體沉淀重懸于PBS緩沖液(pH7.4)中,按1.2.2方法超聲破碎處理,保留上清液和沉淀,經適當處理后進行SDS-PAGE電泳;獲得的包涵體沉淀按1.2.2方法處理。

1.2.4包涵體的復性采用直接稀釋復性,復性液組成為,100 mmol/L Tris·HCl,100 mmol/L NaCl,0.4 mmol/L/4 mmol/L GSSG/GSH,1 mmol/L EDTA。將溶解后的包涵體蛋白稀釋一定倍數,使終蛋白濃度分別0.0472、0.0944、0.1415、0.1887 mg/mL的包涵體溶解后的變性溶液5 mL分別逐滴加入25 mL的復性液中,并不斷攪拌,在4 ℃的條件下復性12 h。

1.2.5復性后重組蛋白的純化復性后重組蛋白在緩沖液中做透析處理。采用Ni-IDA柱對重組蛋白進行純化。按Ni-IDA柱操作手冊,純水洗柱,并用緩沖液平衡10個柱體積,蛋白溶液樣品經0.45 μm的濾膜過濾后上樣,保持流速為1 mL/min,用緩沖液平衡10個柱體積,使用含50 mmol/L咪唑的平衡溶液進行第一次洗脫,保持流速為1 mL/min,使用含有500 mmol/L咪唑的平衡液進行第二次洗脫,保持流速為1 mL/min。此時收集目的蛋白。將目的蛋白透析后采用冷凍干燥法縮小樣品體積。將樣品重新溶于腸激酶緩沖液中(20 mmol/L Tris·HCl,100 mmol/L NaCl,pH7.6),測定樣品的蛋白濃度,加入適量的腸激酶酶切。按上述步驟再次進行純化,以10mL每管采集,采用考馬斯亮藍方法測定蛋白濃度。產物采用Tricine-SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6基因工程片球菌素的理化性質分析基因工程片球菌素的活性測定采用牛津杯法[15],指示菌為單核細胞增多癥李氏桿菌;將適量基因工程片球菌素在40、70、100、121 ℃處理30 min后測定其活性以判斷高溫對其活性的影響,室溫條件下保存的片球菌素作為對照;將適量基因工程片球菌素分別置于4 ℃和-20 ℃的條件下處理保存一個月后測定其活性以判斷低溫對其活性的影響;將適量基因工程片球菌素溶液采用4 mol/L的鹽酸和4 mol/L的氫氧化鈉調pH為1～14的范圍內的條件下處理2 h后測定其活性,評價基因工程片球菌素對酸堿的耐受性;適量基因工程片球菌素溶液分別用胰蛋白酶,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,蛋白酶K處理后測定其活性變化,測定基因工程片球菌素對上述酶的敏感性。

表1　在37 ℃不同時間不同IPTG濃度誘導的條件下培養基的pHTable 1　The pH of the media under different time and different concentration of IPTG in 37 ℃

表2　在30 ℃不同時間不同IPTG濃度誘導的條件下培養基的pHTable 1　The pH of the media under different time and different concentration of IPTG in 30 ℃

1.2.7數據處理實驗中每次實驗重復三次,采用origin軟件進行作圖和數據分析。

2　結果和分析

2.1IPTG誘導目的蛋白表達優化條件分析

在37 ℃和30 ℃兩個不同溫度下,以IPTG的終濃度分別為1,0.5,0.25 mmol/L,0.125 mmol/L進行誘導,菌液OD600值隨時間延長變大,具體變化過程見圖1,圖2。

圖1　37 ℃不同濃度IPTG誘導菌體OD600值隨時間的變化Fig.1　The change of OD600under different concentration of IPTG in 37 ℃

圖2　30 ℃不同濃度IPTG誘導菌體OD600值隨時間的變化Fig.2　The change of OD600under different concentration of IPTG in 30 ℃

在37 ℃下1 mmol/L和0.125 mmol/L的IPTG均可以在一個較短的時間內提高菌體的OD600值,優于0.5、0.25 mmol/L的IPTG誘導。但隨著誘導時間的增加,經1 mmol/L的IPTG誘導后的菌體OD600值達到2.5時不再增長,而使用0.125 mmol/L的IPTG誘導的菌體的OD600值卻可以達到2.8。從菌體的生長情況和IPTG的使用量兩個角度考慮,在37 ℃下使用0.125mmol/L的IPTG誘導菌體表達蛋白為優。

在30 ℃下0.5 mmol/L的IPTG誘導可以使菌體OD600值在短時間內升高,但在經過一段時間的誘導后,其菌體的OD600值在3處趨于穩定,而使用0.25 mmol/L的IPTG誘導后,盡管在短時間內的菌體的OD600值增加的速度緩慢但經過同樣的6 h誘導后其可以使菌體的最終的OD600值達到3.500。使用1 mmol/L的IPTG誘導和使用0.125 mmol/L的IPTG經同樣的時間誘導后,菌體的最終的OD600值為2.5。從菌體的生長情況考慮,在30 ℃下使用0.25 mmol/L的IPTG誘導菌體表達蛋白為優。

在不同條件下菌液的pH隨時間的變化如表1和表2所示。菌液的初始的pH大約在6附近,隨著時間的增長,不同條件下菌液的pH都有所增加,原因可能是由于培養條件不穩定,菌體的生長消耗了培養基,導致培養基的成分發生微變,菌體被誘導后所表達的蛋白和其他分泌物,均可造成培養基pH的升高。

不同條件下的菌體沉淀的全菌體蛋白電泳圖譜如圖3所示,定量分析了包涵體蛋白的表達量,目的包涵體的蛋白條帶大約在20 ku附近。通過條帶判斷4,5,6,7條件下蛋白產量較大,7最大;而1,2,3,8條件下蛋白產量較小,8最少。

圖3　IPTG誘導細菌表達蛋白全菌體蛋白電泳圖Fig.3　SDS-PAGE of the expression proteins by E. coli BL21(Trx-Ped A)注:M 為標準蛋白分子量;1,2,3,4分別代表37 ℃ IPTG 終濃度為1、0.5、0.25、0.125 mmol/L;5,6,7,8分別代表 30 ℃ IPTG終濃度為1、0.5、0.25、0.125 mmol/L。

綜合考慮IPTG的終濃度,誘導溫度,菌液pH的變化和全菌體蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜四個因素確定30 ℃,IPTG的終濃度為0.25 mmol/L為IPTG誘導E.coliBL21(DE3)基因工程菌表達片球菌素融合蛋白的最優條件。

2.2菌體細胞的破碎、包涵體的洗滌和溶解結果分析

菌體細胞的破碎效果的好壞與細胞內容物釋放的多少有直接關系。大腸桿菌在600 nm處有最大的吸光度值,而在280 nm和260 nm下,蛋白質的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸以及核酸中的大量堿基在紫外條件下有最大量的吸收[16]。圖4為在室溫下溶菌酶處理后菌體細胞的酶解情況。

圖4　室溫下的酶解過程Fig.4　The process of enzymolysis in room temperature

實驗結果表明經溶菌酶處理后的細胞胞壁逐漸溶解,細胞內容物大量釋放。對此菌液進行超聲破碎處理后,菌液的OD600值下降到0.0188,表明此時菌液中的菌體細胞已經被大量降解,包涵體蛋白被很好釋放。使用溶菌酶加超聲破碎處理細胞,可以縮短細胞的破碎時間,改善細胞的破碎效果,缺點是引入了溶菌酶這種雜蛋白。對破碎后的包涵體的洗滌不僅可以除去菌體細胞中除目的包涵體蛋白以外的蛋白,同時還可以較大程度的除去溶菌酶蛋白,為后續的純化步驟提供方便。圖5為包涵體蛋白經多次洗滌后電泳圖譜。泳道1,2與全菌體蛋白的電泳相比,除去了較多菌體雜蛋白,但溶菌酶蛋白仍然存在。泳道3溶菌酶蛋白條帶基本消失,溶液中的其他的蛋白成分的條帶也基本消失。泳道4基本呈現單一包涵體條帶,說明包涵體蛋白經1% Triton的洗滌比較徹底,純度較高。包涵體蛋白在本實驗所采用的溶解液中完全溶解,經離心后只有較少的沉淀產生。

圖5　包涵體蛋白洗滌后電泳圖Fig.5　SDS-PAGE of inclusion body after washing注:M為標準蛋白分子量;泳道1,2為經PBS洗滌以后的 蛋白電泳;泳道3為經2 mol/L尿素洗滌后的包涵體蛋白; 泳道4為經1% Triton洗滌后的蛋白電泳圖; 溶菌酶條帶在12 ku附近。

2.3自動誘導目的蛋白的表達分析

經實驗測得E.coliBL21(DE3)基因工程菌在ZYM-5052培養基中生長,菌體的OD600值隨時間的增加而增加,在22 h達到最大值為7.6998。E.coliBL21(DE3)基因工程菌在ZYM-5052培養基中生長,消耗掉培養基中的速效碳源葡萄糖后,開始利用遲效碳源乳糖,乳糖則可以作為啟動子誘導E.coliBL21(DE3)基因工程菌表達融合蛋白。圖6為E.coliBL21(DE3)基因工程菌在ZYM-5052培養基中被自動誘導表達蛋白所得的全菌體蛋白電泳圖,可以看在電泳圖譜除了雜蛋白條帶以外,在20 ku附近處出現非常明顯的目的條帶,與預期的融合蛋白的分子量相符。判斷為乳酸片球菌素融合蛋白。

圖6　ZYM-5052培養基自動誘導蛋白 表達全菌體蛋白電泳圖Fig.6　SDS-PAGE of the expression proteins by E. coli BL21(DE3)(Trx-Ped A)growing in ZYM-5052 media注:M為標準蛋白分子量,另一泳道為全菌體蛋白條帶。

圖7所示泳道1,泳道2,泳道3在20 ku附近均發現融合蛋白的目的條帶。泳道1融合蛋白的含量明顯大于泳道2和泳道3,因為在菌體細胞的內部外部均發現有可溶性目的融合蛋白存在,說明自動誘導在一定程度上提高了融合蛋白的可溶性,但是濃度較低,大部分的目的融合蛋白還是在胞內以不具生物活性的包涵體的形式存在。

圖7　E.coli TransB(DE3)基因工程菌表達蛋白的電泳圖Fig7 SDS-PAGE of the expression of E.coli TransB(DE3)(Trx-Ped A)注:M為標準蛋白分子量。泳道1為細胞破碎離心后的沉淀的蛋白電泳;泳道2為細胞破碎后離心所得到的上清液的蛋白電泳;泳道3為培養后經一次離心獲得的上清液的電泳。

2.4包涵體復性和片球菌素的純化結果分析

將相同條件下發酵的菌體,經過破碎洗滌后得到的片球菌素融合蛋白包涵體溶于溶解液,自動誘導的產生的融合蛋白的溶解液濃度為0.2359 mg/mL,經IPTG誘導條件誘導產生融合蛋白的溶解液濃度為0.1001 mg/mL。自動誘導產量為IPTG誘導的兩倍多。對經過稀釋復性并經過腸激酶處理的目的片球菌素進行Ni柱純化,蛋白洗脫量與時間的關系如圖8所示。用500 mmol/L咪唑洗脫15 min左右,目的片球菌素被洗脫下來,35 min時洗脫量達到最大,隨后逐漸降低,整個洗脫時間為1 h。經過Ni柱純化,基因工程片球菌素的純度有所提高,最大濃度為0.014 mg/mL。采用Tricine-SDS-PAGE電泳分析經腸激酶處理的蛋白樣品,目的片球菌素條帶大約在4.4 ku左右,顏色較淡,含量較少。說明目的片球菌素在包涵體溶解、復性、Ni柱純化以及腸激酶的處理等多步過程中產生了結構的破壞和降解。

圖8　基因工程片球菌素在Ni-IDA柱的洗脫曲線Fig.8　The elution curve of gene engineerin pediocin via Ni-IDA column

抑菌實驗表明,復性并經腸激酶處理的基因工程片球菌素對單核細胞增多癥李氏桿菌有抑制作用,產生直徑為14.23 mm的抑菌圈。復性后未經酶切的融合蛋白無抑菌活性。根據復性率計算公式:復性率%=溶液中復性后有活性的蛋白濃度/溶液的總蛋白濃度,采用稀釋復性方法的復性率為33%～35%。包涵體的復性是讓變性包涵體蛋白重新折疊成為正確形式的過程,這個過程包含有復雜動力學反應,本文采用稀釋復性方法對片球菌素融合蛋白包涵體進行復性,經過酶切后獲得了具有抑菌活性的基因工程片球菌素,但稀釋復性的復性液體積過大,復性時間長,目的蛋白在此過程中會產生一定損失,復性率較低,這些問題有待于后續研究,比如采用分子伴侶輔助復性[17]等。

2.5片球菌素的理化性質分析

基因工程片球菌素對單核細胞增多癥李氏桿菌的生長有抑制作用。產生的抑菌圈的平均直徑18.64 mm。經過不同溫度處理的基因工程片球菌素的活性保留情況見表3。與室溫保存的片球菌素相比,隨溫度的上升基因工程片球菌素的活性盡管存在一定程度的損失,但是總體保持穩定,100 ℃和121 ℃處理后仍具活性,分別產生12.22 mm和11.88 mm的抑菌圈。

表3　熱處理基因工程片球菌素活性的影響Table 3　The effect of heating on the activity of gene engineering pediocin

實驗證明4 ℃低溫貯藏和-20 ℃冷凍保藏對基因工程乳酸片球菌素的影響不大,但其自身會隨時間延長而產生降解和變性,導致活性喪失。

pH對基因工程片球菌素的影響如圖9所示。當pH較低時,基因工程片球菌素的抑菌活性隨pH的升高保持平穩,沒有明顯變化。當pH超過7時,基因工程片球菌素的抑菌活性有所下降。此結果說明基因工程片球菌素的耐酸性較強而耐堿性較差。

圖9　基因工程片球菌對酸堿的耐受性Fig.9　The tolerance of gene engineering pedioin under different pH

基因工程片球菌素經胰蛋白酶(在pH8),胃蛋白酶(pH1.5～pH2.5),木瓜蛋白酶(pH6.0～pH7.0)和蛋白酶K處理處理后對單核細胞增多癥李氏桿菌不產生抑菌作用,說明基因工程片球菌素可以被上述酶降解,此性質也與天然乳酸片球菌素的性質相同[18],兩者在消化道內均可以被分解,對人體不產生毒副作用。

3　結論

本實驗確定了自動誘導方法誘導E.coliBL21(DE3)基因工程菌表達基因工程片球菌素,這種方法適合大規模發酵生產基因工程片球菌素,其產量優于IPTG誘導方法。對片球菌素融合蛋白經過稀釋復性,腸激酶酶切,Ni柱純化,成功得到了具有抑制單核細胞增多癥李氏桿菌抑菌活性的基因工程片球菌素,其熱穩定性好,經121 ℃高壓處理后仍顯示出部分抑菌活性,在pH1～pH7范圍內活性穩定,pH7～pH14范圍內活性逐漸下降,可以被胰蛋白酶,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶和蛋白酶K降解。

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Expression of Pediocin fusion protein in auto-induced system

TAN Xi-qian,HAN Ye,XIAO Hua-zhi,ZHOU Zhi-jiang*

(Department of Food Science and Engineering,School of Chemical Engineering and Technology,Tianjin University,Tianjin 300072,China)

IPTG induction and auto-induction methods were used to express Pediocin fusion protein in gene engineeringE.coliBL21(DE3). Direct dilution method was used to refold the inclusion body of Pediocin fusion protein,Ni-IDA agarose resin column was used to separate Pediocin fusion protein,and rEK-B was used to cut the fusion protein in order to obtain target Pediocin,oxford cup method was used to test the antimicrobial activity of target Pediocin usingListeriamonocytogenesas an indicator. The results indicated that after cultivation,the ultimate OD600and the protein concentration of IPTG induction and auto-induction were 3.5000,0.1001 mg/mL and 7.6998,0.2359 mg/mL respectively. The yield of fusion protein was higher in the auto-induction system. The target Pediocin displayed antiseptic activity towardListeriamonocytogenes,and had high acid resistance ability as well as low alkali resistance ability,and can be digested by trypsin,pepsin,papain and proteinase K. Auto-induction could be applied in gene engineeringE.coliBL21(DE3)to achieve pediocin.

auto-induction;IPTG;inclusion body;purification;antimicrobial activity

2015-12-14

檀茜倩(1985-),女,博士研究生,研究方向:食品生物技術,E-mail:xiqiantan@tju.edu.cn。

周志江(1960-),男,博士,教授,研究方向:食品生物技術,E-mail:zzj@tju.edu.cn。

天津科技支撐計劃重點項目(13ZCDNC01900)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)15-0170-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.025