響應面法優化波紋巴非蛤肌肉蛋白酶解工藝條件

陳海燕,鄭惠娜,曹文紅,周春霞,章超樺,郝記明,張　靜

(廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室,國家貝類加工技術研發分中心(湛江),廣東湛江 524088)

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響應面法優化波紋巴非蛤肌肉蛋白酶解工藝條件

陳海燕,鄭惠娜*,曹文紅,周春霞,章超樺*,郝記明,張靜

(廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室,國家貝類加工技術研發分中心(湛江),廣東湛江 524088)

波紋巴非蛤廣泛分布于我國沿海地區,是一種高蛋白低脂肪的海洋蛋白資源。本研究以水解度、蛋白質回收率和感官評價為指標,選取動物水解蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶,采用單酶酶解和復合酶酶解波紋巴非蛤肌肉蛋白,綜合指標篩選出最佳酶種類及酶解方法。并且以時間,液料比,加酶量為單因素,采用響應面優化酶解條件,確定最佳酶解工藝。研究結果表明:動物蛋白酶和風味蛋白酶按1∶1比例同時添加,酶解3 h后,酶解產物的水解度和蛋白質回收率分別達到22.29%±1.02%和79.95%±0.51%,感官評價總分為15.6,與其他酶解方式相比較好。通過單因素以及響應面優化,得到最佳酶解條件:加酶量1700 U/g,酶解時間3.5 h,液料比為3.4∶1。在此條件下,水解度為30.04%±0.64%,蛋白質回收率為81.46%±0.70%,與預測值水解度30.54%±0.137%和蛋白質回收率82.62%±0.092%無顯著性差異(p>0.05)。感官評價綜合得分為15.8,風味較好,研究結果為波紋巴非蛤肌肉蛋白的精深加工利用提供參考。

波紋巴非蛤,酶解,水解度,蛋白質回收率,響應面

波紋巴非蛤Paphiaundulta俗稱“花甲螺”,是一種南海著名的海產貝類,主要分布于中國福建、廣東、廣西等地沿海以及日本、澳大利亞、菲律賓、紅海、波斯灣等國家和地區,是沿海居民經常食用的海產貝類[1]。波紋巴非蛤不僅肉質細嫩、味道鮮美,且蛋白質、糖原、脂肪、微量元素和維生素等含量豐富,具有較高的營養價值。同時還含有豐富的生物活性物質,在降血壓、抗疲勞、抑菌、抗氧化等[2-5]方面均具有顯著的活性,因此,以波紋巴非蛤肉為原料,對其進行精深加工,制備功能產品,具有巨大市場發展前景。

表2　各蛋白酶的反應條件Table 2　The reaction conditions for each protease

通過生物酶解法降解蛋白質是實現資源高值化利用的一個重要方面,國外許多學者已經將此方法廣泛用于食品工業中[6],如增強抗氧化、抗炎、抗癌活性等[7-9]。酶解方法有單酶的酶解和復合酶的酶解,其中復合酶的酶解又包括分步加酶和同時加酶兩種方式[10]。目前對于波紋巴非蛤的酶解,大多采用單酶的方法,苗艷麗,袁毅樺分別利用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對波紋巴非蛤進行酶解,得到了豐富的游離氨基酸和63.04%提取率的小分子肽[11-12];而復合酶的酶解,只有方富永采用分步酶解的方法提高了酶解液的水解度和營養價值[13]。因此,本研究采用單酶和復合酶酶解兩種方法酶解波紋巴非蛤肌肉,綜合指標篩選出最佳酶種類及酶解方法,采用響應面優化酶解工藝,以期為酶解波紋巴非蛤制備功能產品的研究提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

波紋巴非蛤湛江市霞山東風市場,開殼后取肉洗凈瀝干,200 g分裝,于-20 ℃保藏備用。

風味蛋白酶(18×104U/g)、動物水解蛋白酶(23×104U/g)、中性蛋白酶(20×104U/g)、木瓜蛋白酶(21×104U/g),食品級廣西龐博生物科技有限公司;其余化學試劑均為分析純。

JA2003電子天平上海恒平科學儀器有限公司;UV-8000紫外分光光度計上海元析儀器有限公司;HZ-9212S恒溫振蕩器太倉市科教器材廠;HHS21-8-S水浴鍋上海新苗醫療器械制造有限公司;料理機九陽股份有限公司;90-4型數顯恒溫磁力攪拌器上海滬西分析儀器廠有限公司;數顯雷磁PHS-25 PH計上海儀電科學儀器股份有限公司;Sigma 3k15高速冷凍離心機貝朗國際生物工程公司。

1.2實驗方法

1.2.1蛋白質回收率的測定方法采用凱氏定氮法[14]

蛋白質回收率(%)=上清液中總蛋白質含量/底物蛋白質含量×100

1.2.2水解度的測定方法原料中總氮量和非蛋白氮量采用凱氏定氮法[14],水解液中的氨基態氮量和原料中游離的氨基態氮量采用中性甲醛電位滴定法[15]。計算公式如下:

式中:A為原料中總氮量;B為水解液中的氨基氮量;C為原料中游離的氨基氮量;D為原料中的非蛋白氮量。

1.2.3感官評價由10位感官評價人員(5位男性和5位女性)組成感官評價小組,在感官評價前對所有人員進行培訓,參考《食品感官評價》[16]和《食品感官評價原理與實踐》[17],以總分為25分,每一項滿分為5分對酶解液的顏色,腥味,澄清度,苦味,香氣進行評定打分,計算各個分數的平均值,感官評分標準見表1。

表1　感官評分標準Table 1　Standard of sensory evaluation

1.2.4酶解工藝條件優化

1.2.4.1單酶酶解實驗波紋巴非蛤解凍后絞碎,稱取10 g肉糜,置于燒杯中,液料比為3∶1,加入蒸餾水,均質,分別加入四種蛋白酶進行酶解(酶解條件如表2),酶解溫度為50 ℃,酶解3 h后,100 ℃下滅酶10 min,冷卻,離心(4500 r/min,15 min)取上清液,得到酶解液。測定水解度、蛋白質回收率以及感官評價。

1.2.4.2復合酶酶解分步加酶:在酶解溫度、初始pH不變的條件下,分別加動物蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶(500 U/g原料),進行酶解,酶解后滅酶,再加風味蛋白酶(500 U/g原料),進行復合酶解,酶解后滅酶,離心,取上清液,測定水解度,蛋白質回收率以及感官評價。同時加酶:在酶解溫度、時間、酶解初始pH不變的條件下,動物蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶分別和風味蛋白酶按1∶1的比例加入,加酶量均為500 U/g原料進行復合酶解,酶解后滅酶,離心,取上清液,測定水解度,蛋白質回收率以及感官評價。

1.2.4.3單因素實驗不同的酶解時間:在液料比為3∶1,按1∶1的比例添加動物蛋白酶與風味蛋白酶進行復合酶解,加酶量為1000 U/g 原料,溫度為50 ℃,自然pH條件下,分別酶解1、2、3、4、5 h。酶解后滅酶,離心,取上清液,測定水解度和蛋白質回收率。不同的液料比:在加酶量1000 U/g 原料,按1∶1的比例添加動物蛋白酶與風味蛋白酶進行復合酶解,時間3 h,溫度50 ℃,自然pH條件下,對液料比為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1五個水平進行酶解,酶解后滅酶,離心,取上清液,測定水解度和蛋白質回收率。不同的酶添加量:在酶解溫度50 ℃,液料比3∶1,自然pH條件下,按1∶1的比例添加動物蛋白酶與風味蛋白酶進行復合酶解,分別調整加酶量為500、1000、1500、2000、2500 U/g原料,進行酶解3 h,酶解后滅酶,離心,取上清液,測定水解度和蛋白質回收率。

1.2.4.4響應面優化實驗在單因素實驗的基礎上,選擇時間、液料比、加酶量這3個因素,以水解度和蛋白質回收率為響應值,根據Design-Expert8.0.6軟件中Box-Behnken法設計響應面實驗方案,其相應的因素水平見表3。

表3　Box-Benhnken實驗因素水平與編碼Table 3　Levels and factors of Box-Benhnken

1.2.5數據分析采用SPSS 17.0進行顯著性(p<0.05)分析,Origin8.0,Design Expert8.0.6作圖。

2　結果與討論

2.1不同蛋白酶酶解效果的比較

由圖1可知,動物蛋白酶作用的水解度為24.70%±0.67%,是四種酶中最高的,其次是中性蛋白酶,木瓜蛋白酶次之,風味酶最低。中性蛋白酶的蛋白質回收率最高為84.03%±2.34%,其次是動物蛋白酶,木瓜蛋白酶次之,風味蛋白酶最低。由圖2可知,感官上,動物蛋白酶感官評價總分為9.9分,效果最好,其次是風味蛋白酶9.5分、木瓜蛋白酶次之,中性蛋白酶最差。由于不同的酶作用位點不同,酶解效果也會有所差異,進而呈現出不同的風味[18]。所以選取動物蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶分別和風味蛋白酶進行復合酶解,選出酶解效果最好的酶種類和酶解方式。

圖1　不同酶酶解產物水解度及蛋白質回收率比較Fig.1　Comparison of hydrolysis degree and protein recovery of different enzymatic hydrolysis products注:不同字母表示數值差異顯著, 圖3同,圖4、圖6、圖8～圖10同。

圖2　不同酶酶解產物感官評定結果Fig.2　The results of sensory evaluation of different rate enzymatic hydrolysis products

2.2分步加酶酶解方式的選擇

圖3　分步加酶酶解產物水解度比較Fig.3　The comparison of hydrolysis degree of adding the enzyme step by step注:A,B,C,D分別代表動物水解蛋白酶,中性蛋白酶,木瓜蛋白酶,風味蛋白酶;A→D酶解時間為3 h表示先加入A酶解2 h再加入D酶解1 h;4、5、6 h表示先加入A酶解3 h再加入D酶解1、2、3 h;B→D,C→D表示的意思與A→D一致。

由圖3可知,在動物水解蛋白酶,中性蛋白酶,木瓜蛋白酶酶解2 h,再加風味蛋白酶酶解1 h時水解度分別為17.65%±0.53%,17.34%±0.35%,19.55%±0.62%,較動物水解蛋白酶,中性蛋白酶,木瓜蛋白酶酶解3 h,再加風味酶酶解的水解度低,綜合分析加入風味酶酶解1、2、3 h的水解度無顯著性差異(p>0.05),考慮到酶解時間太長不利于工業化生產,所以選擇動物水解蛋白酶,中性蛋白酶,木瓜蛋白酶酶解3 h再加入風味蛋白酶酶解1 h為分步加酶的最合適方式。

2.3分步加酶的酶解效果比較

由圖4可知,在動物水解蛋白酶,中性蛋白酶,木瓜蛋白酶分別酶解3 h,再加風味酶酶解1 h后,中性蛋白酶的水解度和蛋白質回收率分別是21.59%±2.21%和80.21%±1.29%是三種酶解組合方式中最高的,但其他兩種組合與其也沒有顯著性差異(p>0.05)。由圖5可知感官效果最好的是動物蛋白酶和風味酶的組合,總分為14.1,顯著高于其他兩種組合。

圖4　分步加酶酶解產物水解度及蛋白質回收率比較Fig.4　The comparison of hydrolysis degree and protein adding the enzyme step by step

圖5　分步加酶酶解產物感官評定結果Fig.5　The results of sensory evaluation of recovery of adding the enzyme step by step注:A,B,C,D分別代表動物水解蛋白酶,中性蛋白酶, 木瓜蛋白酶,風味蛋白酶;A 3 h+D1 h,B 3 h+D1 h, C 3 h+D1 h是動物水解蛋白酶,中性蛋白酶, 木瓜蛋白酶酶解3 h后再加風味蛋白酶酶解1 h。

2. 4同時加酶的酶解效果比較

由圖6可知,在動物水解蛋白酶,中性蛋白酶,木瓜蛋白酶分別與風味蛋白酶按1∶1的比例同時加入時,動物水解蛋白酶和風味蛋白酶這一組合的水解度為22.29%±1.02%,是較高的,蛋白質回收率為79.95%±0.51%,略低于中性蛋白酶和風味蛋白酶這一組合,但無顯著性差異,木瓜蛋白酶和風味蛋白酶這一組合結果是三組中最低的。由圖7可知感官評價最好的是動物蛋白酶和風味蛋白酶這一組合,總分為15.6,次之是木瓜蛋白酶和風味蛋白酶這一組合,總分為11,最差的是中性蛋白酶這一組合。

圖6　同時加酶酶解產物水解度及蛋白質回收率比較Fig.6　The comparison of hydrolysis degree and protein recovery of adding the enzyme simultaneously注:A,B,C,D分別代表動物水解蛋白酶,中性蛋白酶, 木瓜蛋白酶,風味蛋白酶,AD,BD,CD是同時加酶。

圖7　同時加酶酶解產物感官評定結果Fig.7　The results of sensory evaluation of adding the enzyme simultaneously

綜合以上酶種類和不同酶解方式對水解度,蛋白質回收率,感官效果上的比較分析,單酶酶解和復合酶酶解對水解度和蛋白質回收率的影響相差甚小,但感官上復合酶酶解的效果較好,同時加酶和分步加酶相比較,同時加酶的感官效果較好,結合實際生產的需要,選擇動物蛋白酶和風味蛋白酶同時加入這一酶解方式進行下一步酶解條件的優化實驗。

2.5單因素實驗

2.5.1不同的酶解時間從圖8可以看出,隨著酶解時間的增加,水解度在不斷增大,特別是從1 h到3 h這段時間增加迅速,到4 h時增加緩慢,原因可能是隨著反應的進行,底物越來越少,酶活力下降,水解度趨于平緩。這與許晏用復合酶提取牡蠣抗氧化肽,水解時間對蛋白酶水解度的影響變化一致[19]。但蛋白質回收率在2 h到3 h這一時間段增加迅速,酶解達到3 h后就不再增大,趨于平緩,略有下降。但從3 h到5 h沒有顯著性差異(p>0.05),所以選擇2～4 h為響應面優化范圍。

圖8　酶解時間對DH,蛋白質回收率的影響Fig.8　The effect of hydrolysis time on DH and protein recovery

2.5.2不同的液料比從圖9可以看出隨著液料比的增加,水解度在逐漸增大,從2∶1到3∶1增加迅速,3∶1到4∶1增加緩慢,從4∶1開始已經趨于平緩狀態,基本上不再增加。蛋白質回收率的變化趨勢與水解度基本一致,只是液料比4∶1后略有下降。這是因為底物濃度較大時,酶與底物接觸不充分,限制了反應的進行,當底物濃度逐漸減小時,溶質流動性變大,反應迅速,當底物濃度減小到一定程度后,水解度和蛋白質回收率增加緩慢或略有下降[20]。但與4∶1時沒有顯著性差異(p>0.05),所以選擇液料比為2∶1～4∶1為響應面優化范圍,以確定最佳液料比。

圖9　液料比對DH,蛋白質回收率的影響Fig.9　The effect of liquid-solid ratio on DH and protein recovery

2.5.3不同的酶添加量從圖10可以得出,隨著加酶量的增加,水解度在逐漸增大,從500 U/g到1500 U/g,水解度增加迅速,從1500 U/g開始增加緩慢,而且與2000 U/g、2500 U/g沒有顯著性差異(p>0.05)。蛋白質回收率的變化趨勢與水解度一致,當底物量一定,隨著酶濃度的增加,蛋白酶與蛋白質分子肽鏈的接觸機會增加,在同一時間內水解的肽鏈數不斷增加,水解度不斷升高,之后增加趨勢趨于平緩,原因在于隨著酶用量的增加,底物已被酶分子所飽和,酶用量增加對水解度影響減弱。這與高郡煥等[21]用中性蛋白酶和風味蛋白酶酶解四角蛤蜊的水解度變化趨勢一致。所以選擇1000～2000 U/g為響應面優化區間,以確定最合適的加酶量。

圖10　加酶量對DH,蛋白質回收率的影響Fig.10　The effect of quantity of enzyme on DH and protein recovery

2.6響應面優化實驗

2.6.1響應面實驗設計與結果根據單因素實驗結果,以酶解時間、液料比和加酶量為主要因素進行響應面優化實驗。響應面實驗設計及結果見表4所示。

表4　響應面實驗設計及實驗結果Table 4　Design and results of response surface experimental methodology

2.6.2模型的建立及其顯著性檢驗回歸模型方差分析及回歸方程系數顯著性檢驗見表5。利用Design Expert8.0.6軟件對表4數據進行響應面模型分析,得到DH及蛋白質回收率與各因素變量的二次多項回歸模型方程:

Y1=27.52+2.57X1+1.37X2+3.93X3+0.31X1X2-0.35X1X3-1.06X2X3-0.63X12-0.88 X22-1.92X32

Y2=81.04+3.57X1+3.24X2+2.94X3-1.83X1X2-3.42X1X3-0.53X2X3-2.72X12-2.06X22-1.74X32

表5　水解度回歸模型方差分析Table 5　ANOVA for quadratic model for DH

表6　蛋白質回收率回歸模型方差分析Table 6　ANOVA for quadratic model for protein recovery

2.6.5響應面曲面分析及優化通過回歸模型方差分析結果,對其中交互作用顯著的二次項利用Design Expert8.0.6 軟件繪制三維空間曲面圖,見圖11～圖13。

圖11　加酶量和液料比的交互作用對水解度的影響Fig.11　The effect of quantity of enzyme and liquid-solid ratio on DH

圖12　時間和液料比的交互作用對蛋白質回收率的影響Fig.12　The effect of time and liquid-solid ratio on protein recovery

圖13　時間和加酶量的交互作用對蛋白質回收率的影響Fig.13　The effect of time and quantity of enzyme on protein recovery

圖11為加酶量和液料比的交互作用對水解度的影響,呈開口向下的凸面,且響應曲面中心處于考察的范圍內,水解度有極大值。圖12是時間和液料比的交互作用對蛋白質回收率的影響,隨著時間和液料比的增加,蛋白質回收率在逐漸增大,達到極值點后,開始下降。圖13是時間和加酶量的交互作用對蛋白質回收率的影響,與圖12的變化趨勢一致,這說明要尋找的最佳時間點,液料比值和酶的添加量都在設定的范圍內。

根據Design-Expert 8.0.6軟件,對兩個回歸方程進行綜合模擬分析,得到模擬酶解波紋巴非蛤制備蛤精的最佳條件為酶解時間3.56 h,液料比3.48∶1,加酶量1793.40 U/g。此條件下,水解度最大預測值為30.54%±0.137%,蛋白回收率為82.62%±0.092%。

2.6.6驗證性實驗考慮到實際生產的便利,將酶解條件改為:加酶量1700 U/g,酶解時間為3.5 h,液料比為3.4∶1,在此條件下進行重復實驗,得到水解度為29.83%±0.64%,蛋白質回收率81.46%±0.70%,與模型預測值無顯著性差異(p>0.05),證明該模型能較好的預測復合酶同時酶解波紋巴非蛤的情況。對比金帶細鲹魚利用單酶酶解后水解度達到18.15%[22],草魚蛋白質經堿性蛋白酶酶解后水解度達到23.46%[23],牡蠣酶解后蛋白質回收率為67.55%[24],波紋巴非蛤經復合酶酶解后具有較高的水解度和較好的蛋白質回收率,并且感官評價綜合得分為15.8,效果較好,因此選用加酶量1700 U/g,酶解時間為3.5 h,液料比為3.4∶1為最終的酶解條件。

3　結論

以水解度,蛋白質回收率以及感官評價為指標對動物水解蛋白酶,中性蛋白酶,木瓜蛋白酶和風味蛋白酶進行單酶酶解的比較,再以動物水解蛋白酶,中性蛋白酶,木瓜蛋白酶分別與風味蛋白酶進行分步加酶和同時加酶兩種復合酶解方式進行酶解比較,綜合得出動物蛋白酶和風味蛋白酶按1∶1的比例同時加入這一組合是最合適用于酶解波紋巴非蛤制備蛤肉酶解液的酶解方式。

通過單因素以及響應面優化實驗,得到最佳酶解條件:加酶量1700 U/g,酶解時間3.5 h,液料比為3.4∶1,在此條件下,水解度為30.04%±0.64%,蛋白質回收率81.46%±0.70%,與預測值水解度為30.54%±0.137%,蛋白質回收率為 82.62%±0.092%無顯著性差異(p>0.05)。感官評價綜合得分為15.8,風味較好,可為波紋巴非蛤肌肉蛋白的精深加工利用提供參考。

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Optimization of enzymatic hydrolysis ofPaphiaundultamuscle protein by response surface methodology

CHEN Hai-yan,ZHENG Hui-na*,CAO Wen-hong,ZHOU Chun-xia,ZHANG Chao-hua*,HAO Ji-ming,ZHANG Jing

(College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Guangdong Province Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing(Zhanjiang),Zhanjiang 524088,China)

Paphia(Paphiaundulta)is widely distributed in the coastal areas of China. It is rich in protein and low fat. Enzymatic preparation conditions ofPaphiaundultamuscle protein was studied in the paper. According to the degree of hydrolysis,protein recov-ery rate and sensory evaluation as the index,the hydrolyzed animal protease,neutral protease,flavor protease and papain as hydrolyzed protease,and the best enzyme type and the enzymatic hydrolysis method was obtained by comprehensive index. And with the time,liquid ratio,quantity of enzyme as a single factor,the optimum conditions of enzymatic hydrolysis were determined by using response surface optimization. The results showed that after 3 hours of simultaneous addition by the ratio of 1∶1 of animal protease and flavor protease enzymatic hydrolysis,the degree of hydrolysis and protein recovery rate of enzymatic hydrolysis product were 22.29%±1.02% and 79.95%±0.51% respectively,the total score of sensory evaluation was 15.6,which was better compared with other enzymatic hydrolysis methods. Through the single factor and response surface optimization experiment,the optimized conditions were the quantity of enzyme of 1700 U/g,enzymolysis time of 3.5 h,liquid-solid ratio of 3.4∶1. Under this condition,the degree of hydrolysis was 30.04%±0.64%,protein recovery rate of was 81.46%±0.70%,there was no significant difference(p>0.05)compared with the predicted value of the degree of hydrolysis and protein recovery rate which were 30.54%±0.137% and 82.62%±0.092%,respectively. The comprehensive score of sensory evaluation was 15.8 with a better flavor and the results provided a reference for the deep processing ofPaphiaundulatemuscle protein.

Paphiaundulta;Enzymatic hydrolysis;degree of hydrolysis;protein recovery rate;response surface

2016-02-25

陳海燕(1989-),女,在讀碩士研究生,研究方向:水產品貯藏與加工,E-mail:chenhhy0209@163.com。

章超樺(1956-),男,博士，教授,研究方向:水產品加工及高值化利用,E-mail:zhangch2@139.com。

鄭惠娜(1979-),女,博士，副教授,研究方向:海洋生物資源高值化利用,E-mail:margaretpaper@126.com。

國家現代農業產業技術體系(CARS-48-07B);廣東省高校重大科研項目培育計劃(GDOU2013050245);廣東省高等學校優秀青年教師培養計劃(Yq2014005)。

TS254.4

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1002-0306(2016)15-0218-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.034