培養基優化對兩種乳鏈菌肽效價測定方法的影響

李　瑩,高　晨,賀進田

(河北師范大學,生命科學學院,河北石家莊 050024)

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培養基優化對兩種乳鏈菌肽效價測定方法的影響

李瑩,高晨,賀進田*

(河北師范大學,生命科學學院,河北石家莊 050024)

為了提高瓊脂擴散法和分光光度法測定乳鏈菌肽效價的效率,對檢驗培養基進行了優化,考察使用優化后的培養基對這兩種測定乳鏈菌肽效價方法的影響。以測定結果的相對誤差與相對標準偏差為衡量指標,判斷使用優化后的培養基是否有利于以上兩種檢測方法測定乳鏈菌肽效價的準確度與精密度的提高。結果表明:培養基優化后,分光光度法測定乳鏈菌肽效價的準確度和精密度得到了提高;瓊脂擴散法使用優化培養基測定乳鏈菌肽效價的結果相對誤差較大,且在乳鏈菌肽濃度較低時無法形成抑菌圈,而使用基本培養基時,瓊脂擴散法測定乳鏈菌肽效價的靈敏度高且相對偏差小,測定結果的準確度較高,故利用瓊脂擴散法測定乳鏈菌肽效價時應選用基本培養基。

培養基優化,乳鏈菌肽,效價測定

乳鏈菌肽(nisin)是從乳酸乳球菌的代謝產物中提取得到的一種多肽物質,由34個氨基酸組成[1],能顯著抑制革蘭氏陽性菌的增長[2],可用于乳和乳制品、肉和肉制品的防腐保鮮[3],是一種公認的安全無毒的天然生物性食品防腐劑和抗菌劑,廣泛應用于食品工業,目前已有60多個國家批注允許使用[4]。

目前已報道的乳鏈菌肽效價檢測方法主要有瓊脂擴散法[5]、分光光度法[6]、ATP熒光法[7]、酶聯免疫吸附法[8]等。其中瓊脂擴散法和分光光度法簡便易行,最為常用[9-10]。利用瓊脂擴散法對乳鏈菌肽進行定量測定是由英國Aplin & Barrett公司的Tramer J & Fowler GG[11]首次發表于Sci Food Agric雜志,該方法成為國際公認的乳鏈菌肽效價檢測法[12],但利用該方法測定乳鏈菌肽效價時間較長,一般需要培養20 h以上才能觀察到清晰的抑菌圈,不能滿足工業生產的需要[13];利用分光光度法檢測乳鏈菌肽效價檢測時間較短,操作簡便,但測定結果的準確度仍有待提高[14]。這些方法都是以藤黃微球菌作為指示菌,目前普遍使用牛肉膏蛋白胨液體培養基對其進行培養[15](以下稱為基本培養基),使用該培養基制備指示菌菌懸液一般需要20 h以上,大大延長了效價時間,故首先對培養基進行優化,并將優化后的培養基作為效價檢測培養基,考察其對以上兩種測定乳鏈菌肽效價方法的影響,希望通過對培養基進行優化使目前常用的這兩種乳鏈菌肽效價測定方法得到改進,在縮短檢測時間的同時提高其效價檢測的準確度、精密度及靈敏度。其中,根據乳鏈菌肽效價檢測的測定值與真值的差距計算相對誤差,以表征測定結果的準確度;根據計算各測定值間的相對標準偏差標準測定結果的精密度;同時觀測了低乳鏈菌肽濃度下的效價測定結果,判斷使用優化培養基是否有利于乳鏈菌肽效價測定靈敏度的提高。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌種藤黃微球菌(Micrococcusluteus)購自中國工業微生物菌種保藏管理中心,CICC編號:10269。

1.1.2試劑和培養基乳鏈菌肽標準品購自Sigma公司;牛肉膏、蛋白胨、NaCl、葡萄糖、酵母浸粉、K2HPO4、Tween 20、瓊脂、HCl均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

基本培養基:蛋白胨0.5%,牛肉膏0.3%,NaCl 0.5%,固體培養基添加2%瓊脂,121 ℃高溫滅菌20 min。

1.1.3實驗儀器BioPhotometer plus核酸蛋白檢測儀Eppendorf 公司;SKY-211B型大容量恒量培養搖床上海蘇坤實業有限公司;BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器上海博迅實業有限公司;SW-CJ-2FD型超凈工作臺蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;Mettler Toledo AL104電子分析天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;標準游標卡尺601-02-150×0.02哈爾濱量具刃具基團有限責任公司。

1.2實驗方法

1.2.1正交實驗優化培養基配方由于藤黃微球菌在基本培養基中生長緩慢,故使用正交實驗方法進行了培養基的優化。在基本培養基基礎上,選取葡萄糖、K2HPO4和MgSO4作為實驗因素,按L9(34)正交表設計實驗,各成分的分析水平見表1。按1%的接種量向各培養基中分別接種藤黃微球菌,30 ℃,120 r/min搖床培養,每隔半小時取菌液測定其在600 nm處的吸光度值,以吸光度值結果確定培養基優化方案。

表1　培養基優化正交設計因素與水平Table 1　Optimization of medium composition based on orthogonal design

1.2.2藤黃微球菌生長曲線測定在無菌條件下,將已活化的藤黃微球菌菌液按1%的接種比例分別接種于基本培養基和優化培養基中,放入搖床培養(轉速120 r/min,溫度30 ℃),每隔半小時取樣測定其在波長600 nm條件下的OD值,以時間為橫坐標,OD值為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.3分光光度法測定乳鏈菌肽效價取OD600約為1.5的菌液按1%的接種量分別加入到基本培養基和優化后的培養基中,加入乳鏈菌肽母液,使每個試管中的乳鏈菌肽分別為0、10、20、30、40、50 U/mL,另取一支試管加入處理后的發酵液樣品,搖床培養,30 ℃,120 r/min,6 h后測量每個樣品中的OD值。分析數據,建立標準曲線。

1.2.4瓊脂擴散法測定乳鏈菌肽效價分別向30 mL的基本固體培養基和優化后的固體培養基中各加入300 μL OD600為0.5(濃度約為1.76×107CFU/mL)的菌液,培養基溫度約為45 ℃,震蕩混勻倒平板待凝固后用內徑為3.5 mm的打孔器打出若干大小一致的孔洞,依次加入不同濃度梯度的乳鏈菌肽標準品溶液,其中乳鏈菌肽標準品的濃度梯度分別為1、5、10、30、50、70、100、200、300 U/mL,置于4 ℃冰箱中預擴散若干小時,待加入樣品充分擴散后置于恒溫箱靜置培養,培養溫度為30 ℃,24 h后取出,用游標卡尺準確測量抑菌圈直徑,分析數據,建立標準曲線。

1.2.5相對誤差及相對標準偏差的計算分光光度法:向液體效價培養基中加入乳鏈菌肽母液,使乳鏈菌肽標準液的濃度分別為15 U/mL和45 U/mL,每個梯度重復做三個,計算相對誤差及相對標準偏差。

瓊脂擴散法:配制10 U/mL和100 U/mL的乳鏈菌肽標準液,打孔加樣,每個梯度均做三個,培養24 h后測量抑菌圈直徑,計算相對誤差及相對標準偏差。

1.3數據統計分析

測定結果采用Microsoft Excel統計處理。

2　結果與分析

2.1培養基優化對藤黃微球菌生長速度的影響

2.1.1正交設計優化培養基實驗結果正交實驗結果如表2所示,影響藤黃微球菌生長的主次順序為RA>RB>RC,即葡萄糖的添加量對藤黃微球菌的生長影響最為顯著,其次為K2HPO4,MgSO4的影響相對較小。培養基的最佳組合為A3B2C3,即葡萄糖0.5%、K2HPO40.2%,MgSO4·7H2O 0.03%。

表3　基本培養基中測定乳鏈菌肽效價的相對誤差及相對標準偏差Table 3　The relative error and relative standard deviation of determining nisin with basic medium

表4　優化培養基中測定乳鏈菌肽效價的相對誤差及相對標準偏差Table 4　The relative error and relative standard deviation of determining nisin with optimized medium

表2　培養基優化正交實驗結果Table 2　The result of orthogonal design

2.1.2藤黃微球菌的生長曲線藤黃微球菌在基本培養基與優化后的培養基中的生長情況如圖1所示,藤黃微球菌在基本培養基中生長緩慢,5.5 h后達到最大OD值僅為1.3左右。在這種情況下,使用藤黃微球菌作為指示菌測定乳鏈菌肽的效價,不僅耗時長,且初步實驗表明以其作為指示菌測定乳鏈菌肽效價準確度較差。使用優化后的培養基對藤黃微球菌進行培養約4 h OD值即能達到1.5左右,且大大增加了指示菌的生長量,本實驗進一步考察使用優化后的培養基作為檢測乳鏈菌肽效價培養基對其測定結果的影響。

圖1　培養基優化前后藤黃微球菌生長曲線對比Fig.1　The growth curve of Micrococcus luteus

圖2　基本培養基測定的乳鏈菌肽標準曲線Fig.2　Standard curve of nisin with basic medium

2.2分光光度法測定乳鏈菌肽效價實驗結果

使用基本培養基和優化培養基建立分光光度法測定乳鏈菌肽效價的標準曲線,結果如圖2、圖3所示。與基本培養基相比,培養基優化后建立的標準曲線的線性關系有了明顯提高,R2由0.933提高到0.978。分析這兩種培養基用于乳鏈菌肽效價檢測的相對誤差和相對標準偏差,結果見表3、表4。培養基優化后,測定乳鏈菌肽效價的相對誤差明顯低于基本培養基,當乳鏈菌肽濃度較高時,測定結果的相對誤差由14.04%降低到了5.67%,即測定結果的準確度更高;優化培養基測得的相對標準偏差明顯比基本培養基小,當乳鏈菌肽濃度較低時,測定結果的相對標準偏差由14.29%降低到了2.10%,即測定結果的精確度更高。實驗結果表明,利用分光光度法測定乳鏈菌肽效價,優化培養基有利于測定準確度和精確度的提高。

圖3　優化培養基測定的乳鏈菌肽標準曲線Fig.3　Standard curve of nisin with optimized medium

2.3瓊脂擴散法測定乳鏈菌肽效價實驗結果

分別使用基本培養基和優化培養基,利用瓊脂擴散法測定乳鏈菌肽效價,結果如圖4、圖5所示(1～9號孔乳鏈菌肽標準品加入順序為1、5、10、30、50、70、100、200、300 U/mL。乳鏈菌肽濃度相同時,優化培養基上抑菌圈明顯比基本培養基小,且1、2、3號孔均未出現抑菌圈,表明用優化后的培養基進行乳鏈菌肽效價測定的靈敏度較低;根據抑菌圈直徑建立標準曲線(優化培養基中前三個孔未出現抑菌圈,故舍去),結果如圖6、圖7所示,優化培養基標準曲線線性關系(R2為0.94)明顯低于基本培養基(R2為0.99)。分析這兩種培養基用于乳鏈菌肽效價檢測的相對誤差和相對標準偏差,結果見表5、表6。乳鏈菌肽濃度相同時,優化培養基測得的乳鏈菌肽效價的相對誤差比基本培養基的大,表明優化后培養基用于測定乳鏈菌肽效價的準確度較低;二者測定乳鏈菌肽效價的相對標準偏差總體較小,優化培養基略高于基本培養基,表明瓊脂擴散法測定乳鏈菌肽效價的精確度較高。實驗結果表明,利用瓊脂擴散法測定乳鏈菌肽效價時,優化培養基進行乳鏈菌肽的效價測定的靈敏度與準確度均低于基本培養基。

表5　基本培養基中乳鏈菌肽效價的相對誤差及相對標準偏差Table 5　The relative error and relative standard deviation of determining nisin with basic medium

表6　優化培養基中乳鏈菌肽效價的相對誤差及相對標準偏差Table 6　The relative error and relative standard deviation of determining nisin with optimized medium

圖4　基本培養基效價圖Fig.4　Determination of nisin with basic medium

圖5　優化培養基效價圖Fig.5　Etermination of nisin with optimized medium

圖6　基本培養基測定乳鏈菌肽效價標準曲線Fig.6　Standard curve of nisin with basic medium

圖7　優化培養基測定乳鏈菌肽效價標準曲線Fig.7　Standard curve of nisin with optimized medium

3　結論與討論

作為一種安全高效的天然食品抑菌劑,乳鏈菌肽在食品工業中的應用越來越廣泛[16]。在工業發酵生產乳鏈菌肽的過程中,快速、準確地測定乳鏈菌肽效價至關重要。但是,指示菌藤黃微球菌在效價測定基本培養基中生長速度非常緩慢,因而,首先根據L9(34)正交設計表對培養基進行優化,以促進指示菌的生長。發現在基本培養基中添加葡萄糖、K2HPO4和MgSO4·7H2O可顯著促進藤黃微球菌的生長。其中,葡萄糖作為主要的碳源對指示菌生長的促進作用最為顯著,K2HPO4為主要的磷源作用次之,MgSO4·7H2O對指示菌生長的影響相對較小。培養基優化后,藤黃微球菌的生長速度大幅度提高,本實驗進而研究了優化培養基對分光光度法和瓊脂擴散法測定乳鏈菌肽效價的影響。

分光光度法使用優化培養基測定乳鏈菌肽效價,與使用基本培養基相比,測定結果的相對誤差和相對標準偏差均明顯降低,表明培養基優化后檢測乳鏈菌肽效價準確度和精確度得到了提高。并且,指示菌生長速度加快可以大大縮短了檢測所用時間。瓊脂擴散法使用優化培養基測定乳鏈菌肽效價的結果并不理想,測定結果的相對誤差較大,且在乳鏈菌肽濃度較低時無法形成抑菌圈,其原因可能是指示菌生長速度過快,不利于抑菌圈的形成,而使用基本培養基時,瓊脂擴散法測定乳鏈菌肽效價的靈敏度高且相對偏差小,測定結果的準確度較高,故優化培養基并不適用于瓊脂擴散法測定乳鏈菌肽效價。

因此,在乳鏈菌肽發酵生產過程中,可使用優化培養基利用分光光度法快速、準確地測定乳鏈菌肽效價單位,以便完成后續生產工作,乳鏈菌肽生產完成后可采用瓊脂擴散法使用基本培養基測定效價單位,其測定結果準確度較高,不足之處是測定時間較長。

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Effect of culture medium optimization on two methods of nisin detection

LI Ying,GAO Chen,HE Jin-tian*

(College of Life Science,Hebei Normal University,Shijiazhuang 050024,China)

To improve efficiency of the agar diffusion method and spectrophotometry for nisin detection,the culture medium was optimized. The influence of the optimized medium on two methods of nisin detection was further investigated. The relative error and relative standard deviation was used to evaluate whether the precision and sensitivity of nisin quantification were enhanced after medium optimization. The results showed that culture medium optimization improved the precision and accuracy of nisin quantification by using spectrophotometry. On the contrary,in determining nisin concentration by agar diffusion method,the basic medium obtained the higher sensitivity and smaller relative error compared with the optimized culture medium. In addition,it was difficult to form a clear bacteriostatic circle at the low concentration of nisin with the optimized culture medium. Therefore,basic culture medium was a suitable choice when the agar diffusion method was used to determine nisin concentration.

culture medium optimization;nisin;Titer

2016-01-27

李瑩(1992-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：蛋白質及天然產物的研發，E-mail：LY5148739299@163.com。

賀進田(1968-)，男，博士，副教授，主要從事多肽和蛋白質藥物新型制劑的研發工作，E-mail：he_jintian@sina.com。

TS202

A

1002-0306(2016)15-0320-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.054