低分子量透明質酸對小鼠巨噬細胞和T細胞的免疫調節作用

柯春林,李作美,曾曉雄

(1.蚌埠學院 生物與食品工程系,安徽蚌埠 233030;2.南京農業大學 食品科技學院,江蘇南京 210095)

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低分子量透明質酸對小鼠巨噬細胞和T細胞的免疫調節作用

柯春林1,2,李作美1,曾曉雄2

(1.蚌埠學院 生物與食品工程系,安徽蚌埠 233030;2.南京農業大學 食品科技學院,江蘇南京 210095)

低分子量透明質酸(LMWHA)由自由基氧化降解方法制備,通過體內動物實驗和體外細胞實驗研究了LMWHA對小鼠巨噬細胞和T細胞的免疫調節活性。在體內免疫抑制鼠實驗中,察看了LMWHA對2,4-二硝基氟苯(DNFB)誘導的遲發型超敏反應(DTH)的影響,測定了血清溶菌酶含量、脾臟以及胸腺指數。結果表明：LMWHA(20～120 mg/kg·d)能夠促進免疫抑制小鼠的DTH反應,改變血清溶菌酶含量、提高脾臟和胸腺指數,并呈作用劑量依賴關系。在體外細胞實驗中,LMWHA(25～200 μg/mL)加強了小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性以及一氧化氮合酶(iNOS)活性,提高了一氧化氮(NO)的生成量,促進了脾臟T淋巴細胞的增殖。由此可見LMWHA能夠調節小鼠的細胞免疫和非特異性免疫功能。

低分子量透明質酸,免疫調節活性,巨噬細胞,T淋巴細胞

透明質酸(HA)由重復的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)與葡萄糖醛酸(GlcA)二糖單位聚合而成,平均分子量為106u。HA對腫瘤形成、血管生成、炎癥反應和免疫功能等均具有調節作用[1-2],其中高分子量HA具有免疫抑制作用[3]。HA能被物理、化學和生物的方法降解為低分子量透明質酸(LMWHA)[4-5]。LMWHA具有完全不同于HA的功能,尤其是免疫調節活性[2,5]。自從Knoflach 等首次發現LMWHA在體內具有免疫調節活性以來[6],人們發現LMWHA對機體的非特異性和特異性免疫系統都有調節作用。例如LMWHA(1.35×105u)可作為先天性免疫調節劑激活樹突狀細胞,并促進其成熟[7]。LMWHA在促進樹突狀細胞成熟的同時產生細胞毒性T淋巴細胞反應和免疫保護反應,而且LMWHA促進了樹突狀細胞和T細胞在淋巴結的聚集,具有免疫刺激作用,為潛在的抗癌疫苗佐劑[8]。但是,對于LMWHA體內和體外免疫調節作用的報道并不多,而且LMWHA的免疫調節活性與其制備方法、分子量等都有關系。為了探討LMWHA免疫調節活性,本實驗通過建立在環磷酰胺(CY)所致免疫抑制小鼠模型基礎上,研究了氧化降解方法制備到的兩種LMWHA對小鼠巨噬細胞和T細胞的免疫調節活性。并通過不同的體外免疫實驗和體內動物實驗,對兩種分子量LMWHA的免疫調節活性進行了探索,為LMWHA免疫制劑的研發提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

8周齡體重均為18～22 g的雌性昆明小鼠由軍事醫學科學院實驗動物中心提供。

低分子量透明質酸(LMWHA-1,1.45×105;LMWHA-2,4.52×104u)本實驗室制備;環磷酰胺(CY)江蘇恒瑞醫藥;升血調元湯(SXTY-Tang)廣州潘高藥業;NO、iNOS以及溶菌酶測定試劑盒南京建成生物工程研究所;刀豆蛋白A(ConA)上海生化研究所;脂多糖(LPS)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)Sigma公司;RPMI 1640 培養基上海生工;胎牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司;其余試劑均為國產分析純。

Anke TDL-5型低速離心機上海安亭科學儀器廠;SORVALL Evolution R型高速低溫離心機美國Kdndro;Laborota 4000型真空旋轉蒸發儀德國Heidolph;Alpha 1-2型冷凍干燥機英國Labconco;BL-220 H分析天平日本Shimadzu;SW-CJ-IBU型超凈工作臺蘇凈集團安泰公司;HEPA class 100 型CO2培養箱美國Thermo;Bx-50型顯微鏡日本Olympus;Infinite M 200型酶標儀瑞士Tecan。

1.2實驗方法

1.2.2LMWHA的體內免疫調節活性

1.2.2.1動物實驗將54只雌性昆明種小鼠隨機均分9組并分籠飼喂。第1組為陰性對照組,小鼠連續7 d灌胃生理鹽水(0.3 mL/只)和第1、3、5 d皮下注射注射生理鹽水(0.3 mL/只);第2組為環磷酰胺(CY)模型組,小鼠連續7 d灌胃生理鹽水(0.3 mL/只)和第1、3、5 d皮下注射CY(75 mg/kg·d);第3組為陽性對照組,小鼠連續7 d灌胃升血調元湯(SXTY-Tang)(0.3 mL/只)和第1、3、5 d皮下注射CY(75 mg/kg·d);第4、5、6、7、8、9組為多糖+環磷酰胺組,小鼠分別按20、60、120 mg/kg·d連續7 d分別灌胃LMWHA-1(第4、5、6組)和LMWHA-2(第7、8、9組)多糖,同時第1、3、5 d皮下注射CY(75 mg/kg·d)。第7 d灌胃后便停食24 h,立即稱重并處死小鼠。

1.2.2.2胸腺指數和脾臟指數的測定各組小鼠處死后,取出脾臟和胸腺并稱重。脾臟(胸腺)指數=脾臟(胸腺)重量/小鼠體重(mg/g)。

1.2.2.3遲發型超敏反應的測定剪去小鼠腹部被毛(3 cm×3 cm),根據文獻報道的方法測定遲發型超敏反應[10]。連續灌胃后的第3 d,用50 μL DNFB液(1.0%,丙酮與植物油以1∶1配比)在其腹部涂布,以激活遲發型超敏反應。7 d后,用20 μL DNFB在每組小鼠左耳涂布,以再次激活遲發型超敏反應。24 h后處死小鼠并用無菌剪剪下左右兩只耳朵,然后用打孔器在每只耳朵上打孔(φ=6 mm)并稱重。腫脹度=左耳重量(mg)-右耳重量(mg)。

1.2.2.4血清溶菌酶的測定采用溶菌酶測定試劑盒,按照操作說明進行血清溶菌酶含量測定。

1.2.3LMWHA的體外免疫調節活性

1.2.3.1酸性磷酸酶測定(腹腔巨噬細胞)根據文獻的報道[11],稍做修改。取雌性昆明種小鼠,腹腔注射2.7%硫乙醇酸鹽培養基(1 mL/20 mg體重)。飼養3 d,采用脫位法處死小鼠,75%乙醇浸泡5 min。向腹腔內注射RPMI1640培養液約5 mL,輕揉腹腔1～2 min,用吸管吸收細胞懸浮液后300×g離心5 min,收集細胞并以RPMI 1640培養液稀釋至每毫升 2×106細胞數,每孔100 μL接種到96孔板中,在5% CO2培養箱中37 ℃培養2～3 h。用移液槍吸棄培養液,反復3次用RPMI 1640培養液洗去未貼壁細胞,即為純化的腹腔巨噬細胞。實驗分為5組,即陰性對照組,4個濃度梯度的LMWHA多糖組(25、50、100、200 μg/mL),加樣處理24 h,每孔加50 μL樣液和50 μL完全培養基(含10%的胎牛血清)。吸去上清,加1% TritonX-100(25 μL/孔)和對硝基苯磷酸鹽(1 mg/mL)(150 μL/孔),反應1 h。每孔加50 μL的3 mol/L NaOH終止反應。405 nm波長下檢測。酸性磷酸酶活性增長率(%)=(Abs樣品組-Abs陰性對照組)×100/Abs陰性對照組

1.2.3.2腹腔巨噬細胞吞噬中性紅實驗根據徐遠義等[12]的方法,稍做修改。依照上述實驗步驟制備小鼠腹腔巨噬細胞,臺盼藍拒染檢測其活性(>95%),后用完全RPMI 1640培養基(含10%的胎牛血清)調整小鼠腹腔巨噬細胞濃度為2×106/mL,實驗分為5組,即陰性對照組,4個濃度梯度的LMWHA多糖組(25、50、100、200 μg/mL),于37 ℃,5% CO2條件下共同培養48 h(每孔加50 μL樣液和50 μL完全培養基),棄上清,孔中細胞用PBS洗兩次,加0.075%中性紅(100 μL/孔),培養60 min后棄上清,未被吞噬的中性紅以PBS洗2～3次去除。加冰醋酸∶乙醇=1∶1(100 μL/孔)裂解細胞,12～24 h后測A540nm(A540nm表示中性紅吞噬能力)。

1.2.3.3NO生成量測定硝酸還原酶法檢測細胞培養液NO3-及NO2-總量代表NO的生成量,參照試劑盒說明書進行。

1.2.3.4一氧化氮合酶(iNOS)活性測定采用比色法測定,參照試劑盒說明書進行。

1.2.3.5體外脾淋巴細胞增殖實驗采用Dai等[13]的方法,稍做修改。配制0.5% LMWHA并用0.22 μm濾膜除菌。①脾淋巴細胞懸液的制備：取雌性昆明種小鼠,運用脫位法處死小鼠,75%乙醇浸泡5 min,用無菌剪剖開小鼠腹腔后取出脾臟并制成脾細胞懸液,于15 mL離心管300×g離心5 min,棄上清。加入2 mL紅細胞裂解液,輕柔震蕩2 min,破壞紅細胞。然后加入10 mL RPMI 1640培養基300 g離心5 min,調整細胞濃度至1×107/mL的脾細胞懸液備用。② MTT比色法:將細胞密度為1×107/mL的脾細胞懸液接種到96孔板中,每孔50 μL。然后,分別加入各個濃度的樣品溶液50 μL后繼續培養72 h。每孔加入MTT(5 mg/mL)10 μL,繼續培養4 h 后加入10% SDS-0.01N HCl 溶液100 μL溶解藍紫色結晶并孵育過夜。用酶標儀測定各孔的OD570 nm。淋巴細胞增殖指數=藥物組吸光值/正常對照組吸光值。

1.2.3.6統計學處理采用SPSS 16.0軟件中的方差分析,根據Student-Newman-Keuls檢驗,p<0.05認為差異顯著。

2　結果與分析

2.1低分子量透明質酸分析

在Agilent 1100 Series高效液相色譜儀上,以Shodex standard P-82(0.59×104～78.8×104u,Showa denko KK,Tokyo,Japan)為多糖標準品,用HPLC法測LMWHA的分子量。根據標準多糖得到的分子量換算公式,經過計算知LMWHA-1和LMWHA-2的分子量分別為1.45×105u和4.52×104u。

2.2LMWHA體內免疫調節活性結果

圖1　LMWHA對免疫抑制鼠胸腺和脾臟指數的影響Fig.1　Effects of LMWHA on the thymus and spleen indices in different organs in immunosuppressed mice注：*p<0.05,與模型組比較;**p<0.01,與模型組比較;#p<0.05,與陰性對照組比較;##p<0.01,與陰性對照組比較，圖2，圖3同。

2.2.1LMWHA對免疫抑制小鼠胸腺指數和脾臟指數的影響結果見圖1,注射CY后脾臟指數和胸腺指數均呈現下降趨勢,與陰性對照組比較差異顯著(p<0.05),說明免疫抑制動物模型建成。灌胃LMWHA后免疫抑制小鼠脾臟和胸腺指數明顯提高,與CY組相比多糖組(60、120 mg/kg)脾臟和胸腺指數也顯著提高,差異極顯著(p<0.01)。但是脾臟指數升高較快,并且具有劑量依賴關系。

2.2.2LMWHA對遲發型超敏反應的影響從圖2可以看出,與陰性對照組(第1組)相比,CY處理組(第2組)小鼠耳廓腫脹度顯著減少(p<0.01),說明免疫抑制鼠動物模型良好。與CY處理組比較,LMWHA處理組(第4至9組)能顯著提高耳廓腫脹度,并呈作用劑量依賴關系。與陰性對照組比較,LMWHA處理組除了LMWHA-2低劑量組(第7組)差異顯著外(p<0.05),其余各組都是差異極顯著(p<0.01),而且LMWHA-1的作用稍強于LMWHA-2。

圖2　LMWHA對免疫抑制鼠遲發型超敏反應的影響Fig.2　Effect of LMWHA on the DTH response in immunosuppressed mice

2.2.3LMWHA對血清溶菌酶的影響LMWHA能升高正常小鼠和免疫抑制小鼠血清溶菌酶含量,尤其在免疫抑制狀態下,作用更明顯(圖 3)。本實驗發現,與陰性對照組(第1組)以及 CY處理組(第2組)相比,服用LMWHA后小鼠血清溶菌酶活力的上升顯著,并呈作用劑量依賴關系。LMWHA低、中劑量組(第4、7、8組)差異顯著外(p<0.05),中、高劑量組(第5、6、9組)差異極顯著(p<0.01),尤以LMWHA-1高劑量組最為明顯(第6組)。由于溶菌酶由單核細胞分泌,由此可見LMWHA能提高血液中單核吞噬細胞的活性。而且LMWHA-1對血清溶菌酶的作用強于LMWHA-2。

圖3　LMWHA對免疫抑制鼠血清溶菌酶的影響Fig.3　Effect of LMWHA on the serum lysozyme in immunosuppressed mice

2.3體外免疫調節活性結果

2.3.1LMWHA對小鼠腹腔巨噬細胞酸性磷酸酶的影響由于巨噬細胞內酸性磷酸酶活力可被免疫抑制劑下調,又能被免疫激活劑上調,因此巨噬細胞內的酸性磷酸酶上調被認為是巨噬細胞激活的標志[14]。結果見圖4A,LMWHA能明顯的激活巨噬細胞,當濃度為100 μg/mL 時顯示最強的作用效果,此時LMWHA-2和LMWHA-1的酸性磷酸酶活性增長率分別為47.99%和52.02%,明顯高于陰性對照組的增長率(16.53%)。低于或高于該濃度,激活作用變弱,其劑量效應曲線呈鐘罩形。本研究結果顯示,LMWHA使小鼠腹腔巨噬細胞中的酸性磷酸酶活力明顯升高,但LMWHA-1對巨噬細胞的激活作用稍弱于LMWHA-2,可能與其分子量有關。

圖4　LMWHA對小鼠腹腔巨噬細胞酸性磷酸酶(A) 和吞噬功能(B)的影響Fig.4　Effects of LMWHA on acid phosphatase activity(A) and phagocytic function in peritoneal macrophages(B)注：*p<0.05,與陰性對照組比較;**p<0.01,與陰性對照組比較。

2.3.2LMWHA對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響(中性紅吞噬實驗)本實驗結果表明(圖4B),小鼠腹腔巨噬細胞與LMWHA共同培養48 h后,與陰性對照組比較,其吞噬中性紅的能力顯著比陰性對照組高,其中25、50、100 μg/mL多糖組吞噬中性紅的能力極顯著增強(p<0.01),其中100 μg/mL時,LMWHA-2和LMWHA-1吞噬中性紅的A540nm值分別為1.29和1.17。明顯高于陰性對照組的A540nm值(0.56)。本結果表明LMWHA可加強巨噬細胞的吞噬功能并呈劑量效應關系。而且,LMWHA-2的作用效果強于LMWHA-1。

2.3.3LMWHA對小鼠腹腔巨噬細胞NO 生成量和iNOS活性的影響細胞內iNOS催化精氨酸經氧化脫氨生成NO,而作為信息分子的NO能作用機體免疫細胞的信號通路進而影響免疫調節效果[15]。結果見圖5,與PBS空白對照組相比,各LMWHA組和陽性對照組(20 μg/mL LPS)NO生成量和iNOS均有增加(p<0.01),不同濃度組相比較差異很明顯。本研究表明LMWHA能提高小鼠腹腔巨噬細胞NO生成量和iNOS活性。

2.3.4LMWHA對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響結果見圖6,在25～200 μg/mL濃度范圍內,LMWHA可明顯促進小鼠脾淋巴細胞增殖。當濃度為100 μg/mL時,LMWHA-1和LMWHA-2對淋巴細胞的吸光值分別為1.37和1.24,顯示最強的作用效果,但略低于陽性對照組(ConA組)的吸光值(1.45)。本研究結果表明LMWHA對小鼠脾淋巴細胞增殖具有刺激作用,與許多免疫調節劑的量效關系曲線相似,其劑量效應曲線呈鐘罩形。說明LMWHA具有一定的淋巴細胞的增殖作用,其中LMWHA-1的作用最強。

圖6　LMWHA對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響Fig.6　Effects of LMWHA on splenocyte proliferation注：*p<0.05,與正常對照組比較;**p<0.01,與正常對照組比較。

3　討論

在體內動物實驗中,灌胃LMWHA后免疫抑制小鼠脾臟和胸腺指數明顯提高,尤以脾臟指數升高較快。由于環磷酰胺對免疫系統和造血功能能產生嚴重損害,由此可見LMWHA對抗了CY對免疫抑制小鼠脾臟造成的損害作用。在遲發型超敏反應中,與陰性對照組相比LMWHA處理組差異顯著(p<0.05)。據報道T細胞介導的遲發型超敏反應在各種炎癥性疾病的發病機制中起重要作用[16],本結果表明LMWHA能一定程度的增強免疫抑制鼠的細胞免疫功能。而且,LMWHA能提高血清溶菌酶的活性,其活力可作為機體非特異性免疫反應的重要指標。吞噬細胞激活后將產生許多活性物質,進而調節機體免疫細胞的活性,介導體液免疫和細胞免疫。本實驗結果顯示,LMWHA能提高小鼠非特異性免疫應答。

在體外細胞實驗中,LMWHA通過影響酸性磷酸酶活性來可激活巨噬細胞,而且其吞噬中性紅的能力顯著比陰性對照組高。單核-吞噬細胞,包括骨髓中的前單核細胞、外周血中的單核細胞、以及組織內的巨噬細胞,介導機體的特異性和非特異性免疫反應,從而調節機體免疫應答反應。有研究表明,絕大多數多糖類物質可增強單核-吞噬細胞功能,發揮其免疫調節作用[17]。本結果表明LMWHA一定程度上影響機體的非特異性免疫應答。LMWHA也增強了小鼠巨噬細胞分泌NO的能力,促進脾淋巴細胞轉化,據報道,多糖能通過刺激小鼠腹腔巨噬細胞來提高誘導型NO合酶(iNOS)活性和NO的生成量,從而發揮免疫調節活性[18]。本研究結果也顯示類似的結果即LMWHA能提高小鼠腹腔巨噬細胞NO生成量和iNOS活性。由此可見LMWHA能一定程度上影響小鼠的特異性和非特異性免疫功能。而且,LMWHA-2對機體非特異性免疫調節能力高于LMWHA-1的,但LMWHA-1對機體特異性免疫調節能力高于LMWHA-2的。有報道說在體內LMWHA有很強的免疫調制功能[19],本實驗的結果也說明LMWHA具有一定的免疫調節作用。

4　結論

本研究采用氧化降解方法制備到的兩種低分子量透明質酸(LMWHA-1,LMWHA-2),通過體內動物實驗和體外細胞實驗研究了LMWHA對小鼠巨噬細胞和T細胞的免疫調節活性。結果表明LMWHA能夠促進免疫抑制小鼠的DTH反應,改變血清溶菌酶含量、提高脾臟和胸腺指數;LMWHA能增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性以及iNOS活性,提高了NO的生成,促進脾臟T淋巴細胞的增殖。結果提示,LMWHA能夠增強免疫抑制小鼠巨噬細胞和T細胞的免疫功能。

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Immunomodulatory activity of low molecular weight hyaluronan on macrophages and T lymphocytes from mice

KE Chun-lin1,2,LI Zuo-mei1,ZENG Xiao-xiong2

(1.Department of Food and Bioengineering,Bengbu College,Bengbu 233030,China;2.College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Low molecular weight hyaluronan(LMWHA)were prepared from hyaluronan by using free radical degradation,and the immunostimulatory activities of LMWHA on macrophages and T lymphocytes were evaluated by usinginvitrocell models andinvivoanimal experiments.The effect of LMWHA on the delayed type hypersensitivity response(DTH)induced by DNFB,serum hemolysin activity,thymus and spleen indexes from immunosuppressed mice were detected. The LMWHA(20～120 mg/kg·d)could induce DTH and increase the level of serum lysozyme and the indices of thymus and spleen in a dose-dependent manner. Furthermore,LMWHA(25～200 μg/mL)could promote the proliferation of splenocytes,strengthen the phagocytic activity and induce the increase of nitric oxide(NO)production and the activity of nitric oxide synthase(iNOS)in mouse peritoneal macrophages. The results showed that LMWHA could regulate the immune function of mice.

low molecular weight hyaluronan;immunomodulatory activity;macrophages;T lymphocytes

2016-01-08

柯春林(1976- ), 男，博士, 副教授, 主要從事糖生物學和糖生物工程方面的研究,E-mail:kexiao139@aliyun.com。

安徽省自然科學基金項目(1408085MH209);高校優秀青年人才支持計劃重點項目(gxyqZD2016360);蚌埠學院學術技術帶頭人后備人選培養計劃項目(院字[2014]182號)。

TS201

A

1002-0306(2016)15-0349-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.060