牛血清白蛋白/黃酮醇納米核殼顆粒的制備及抗氧化活性研究

楊　陳,許舒雯,陳龍勝,劉　慧,王　凱

(1.上海師范大學環境與生命科學學院,上海 200235;2.安徽省科學技術研究院,安徽合肥 230000;3.安徽省應用技術研究院,安徽合肥 230088)

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牛血清白蛋白/黃酮醇納米核殼顆粒的制備及抗氧化活性研究

楊陳1,許舒雯2,陳龍勝2,劉慧3,王凱3

(1.上海師范大學環境與生命科學學院,上海 200235;2.安徽省科學技術研究院,安徽合肥 230000;3.安徽省應用技術研究院,安徽合肥 230088)

利用牛血清白蛋白和疏水性黃酮醇合成牛血清白蛋白/黃酮醇納米核殼顆粒,采用TEM確定納米核殼的粒徑,HPLC分析明確包覆率,2種抗氧化方法(DPPH自由基,ABTS自由基)對包覆前后的黃酮醇類化合物抗氧化活性進行評價。結果表明:牛血清白蛋白/黃酮醇納米核殼粒徑約為20 nm;牛血清白蛋白與黃酮醇化合物的結合關系影響它的包覆率;由于具有抗氧化活性的基團與BSA形成氫鍵,使得被包覆的黃酮醇抗氧化活性降低。合成牛血清白蛋白黃酮納米核殼顆粒可以作為提高黃酮穩定性保護黃酮抗氧化活性實現黃酮較高生物利用度的一種新途徑。

牛血清白蛋白,疏水性黃酮醇化合物,納米核殼顆粒,抗氧化活性

天然黃酮類化合物(Flavonoids)大量存在于各種藥用植物和食用植物中,如蜂產品、大豆產品、水果、茶葉、咖啡和蔬菜等[1-2]。黃酮類化合物最顯著的性質之一是具有強的抗氧化作用,常用來治療和預防感染、炎癥、燒傷和輻射引起的傷害[3]。而黃酮類化合物因其在水溶液中的低溶解度和低穩定性限制了它們作為藥物被廣泛使用[4-5]。血清白蛋白因在血液中具有高度的生物相容性和穩定性等特點,在藥物研究中一直被用作運輸抗癌藥物等的可降解性載體[6-7]。分子特性-結合力關系研究顯示黃酮小分子物理化學特性與蛋白質結合力的關系密切,黃酮小分子與血清白蛋白/血紅蛋白間的結合力隨疏水常數增加而增強,隨氫鍵供體/受體數目增加而降低,這表明疏水作用力在黃酮小分子與蛋白質的相互作用中起關鍵作用[8-9]。基于蛋白質-小分子非共價弱相互作用的藥物納米輸送體系通過蛋白質單元自組裝形成,該體系由于其獨特的生物相容性和生物可降解性,加上低毒而成為理想的藥物輸送載體[10]。

因此本實驗選擇有較強抗氧化活性的7種天然黃酮醇類化合物:山奈酚(KA)、蘆丁(RU)、異李素(ISM)、槲皮素(Q)、槲皮苷(Q3)、楊梅素(MY)及楊梅苷(MN)和典型的蛋白質載體牛血清白蛋白,通過二甲基亞砜(DMSO)設計合成牛血清白蛋白質包覆黃酮醇納米核殼顆粒結構(粒徑小于50 nm),采用TEM手段表征納米核殼結構,HPLC明確納米核殼黃酮包覆率,研究納米核殼黃酮醇輸送體系對黃酮醇抗氧化活性的影響。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

7種黃酮醇標準品(純度均大于98%)購于阿拉丁公司;牛血清白蛋白(BSA)購于上海源聚生物科技有限公司;二甲基亞砜(DMSO)國藥集團化學試劑有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購于東京化成工業株式會社;2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),購于合肥博美科技有限公司;所有藥品均為分析純。

79HW-1磁力攪拌器江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;722G可見分光光度器上海儀電分析儀器有限公司;TGL-16C臺式離心機上海安亭科學儀器廠;冷凍干燥機FD-1A-50北京博醫康實驗儀器有限公司;Thermo Scientific ultimate3000(配有可變波長紫外檢測器和Chromeleon 7.1 英文版色譜工作站)賽默飛公司。

1.2實驗方法

1.2.1納米核殼的制備參照文獻[10]1×10-3mol/L黃酮醇類化合物(DMSO配成的溶液)與1×10-4mol/L BSA以1∶9的比例混合,計時攪拌5 min,混合溶液濃度為黃酮醇/BSA納米顆粒1×10-4mol/L。冷凍干燥去除DMSO[11]。

1.2.2納米核殼表征將干燥成粉末的納米顆粒加蒸餾水水溶解。取銅網,加20 μL樣品于銅網上,自然干燥10 min后,加20 μL磷鎢酸溶液(0.2 mol/L pH7.04),低溫烘15 min后在透射電鏡(TEM)下觀察[12]。

1.2.3納米核殼包覆率的測定黃酮醇/BSA納米溶液中加入0.7 g(NH4)2SO4混合儀上混合10 min 靜置20 min 取上清液,離心15 min,12000 r/min,再取上清液備用,每組三個平行,同時用相應的1×10-4mol/L黃酮醇類化合物作為對照[12]。色譜柱:AcclaimTM120 C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫25 ℃,波長為280 nm,流動相為乙腈:磷酸水體系,進樣量20 μL在HPLC檢測黃酮醇類化合物的峰面積。按(1)式計算包覆率。

核殼納米顆粒包覆率(%)=[(A0-A1)/A0×100]

式(1)

式中:A0是1.0-4mol/L黃酮醇類化合物的出峰面積;A1是上清液的出峰面積。

1.2.4抗氧化活性的測定

1.2.4.1DPPH自由基清除能力測定將1×10-4mol/L黃酮/BSA納米溶液稀釋成不同梯度后各取200 μL,分別加 800 μL DPPH,以甲醇溶劑做為空白對照,每組三個平行,搖床震蕩30 min后,可見分光光度計517 nm處測吸光度值[13]。按(2)式計算自由基清除率。

DPPH自由基清除活性(%)=[(A0-A1-A2)/A0×100]

式(2)

式中:A0是甲醇的吸光度;A1是加樣品的吸光度;A2是加甲醇和樣品的吸光度。

另將相應的1×10-4mol/L黃酮稀釋成不同梯度測其對DPPH自由基的清除能力,做為對照組。

1.2.4.2ABTS自由基清除能力測定將等量的7 mmol/L ABTS加2.45 mmol/L過硫酸鉀混合反應后,黑暗處放置12～16 h以制備ABTS自由基。用50%甲醇將ABTS自由基稀釋成在波長為734 nm處吸光度值到0.700±0.020.將1×10-4mol/L黃酮/BSA納米溶液稀釋成不同梯度后各取100 μL分別加900 μL ABTS自由基溶液,以蒸餾水做空白對照,每組三個平行,放置10 min后,可見分光光度計734 nm處測吸光度值[14]。按(3)式計算自由基清除率。

ABTS自由基清除率(%)=[(A0-A1-A2)/A0×100]

式(3)

式中:A0是蒸餾水的吸光度;A1是加樣品的吸光度;A2是加甲醇和樣品的吸光度。

另將相應的1×10-4mol/L黃酮稀釋成不同梯度測其對ABTS自由基的清除能力,做為對照組。

2　結果與分析

2.1納米粒徑的測定

以牛血清白蛋白為模板,采用DMSO溶劑部分變性蛋白質,降低α-螺旋結構,選擇常見天然黃酮類化合物通過非共價弱相互作用(疏水作用)結合到疏水腔內的未折疊多肽鏈上,通過冷凍干燥去除溶劑,促使蛋白質形成包覆黃酮的核殼結構納米粒[15],通過圖畫模擬納米核殼顆粒形成示意圖(如圖1所示)。

圖1　蛋白質/黃酮納米顆粒形成示意圖[15]Fig.1　The sketch diagram of the formation of the flavonols/BSA nanoparticles[15]

圖2中通過透射電鏡(TEM)在放大倍數70.0 KZoom-1HC-80.0 K下觀察3種黃酮醇與牛血清白蛋白形成的納米顆粒:槲皮素/牛血清白蛋白納米顆粒(Q/BSA),楊梅素/牛血清白蛋白納米顆粒(MY/BSA),山奈酚/牛血清白蛋白納米顆粒(KA/BSA),可以看出合成的3種納米顆粒的粒徑都大約為20 nm,小于50 nm,且每種納米顆粒的粒徑都比較均一。圖3D是同樣放大倍數下牛血清白蛋白(BSA)的結構,相較于圖3A、圖3B、圖3C中包覆了黃酮醇的BSA,從外觀上來看并未發生明顯變化,據報道DMSO加入到蛋白質中后,DMSO的S=O基團會和蛋白質的C=O基團爭奪蛋白質肽鍵中的氫原子,使得蛋白質的α-螺旋結構被打開,部分肽鏈結構得以展開,蛋白質內部的疏水基團被暴露在外,從而使得蛋白質通過疏水作用和氫鍵作用聚合形成納米顆粒[15-17]。表明這種包覆作用僅僅是通過DMSO改變了BSA的部分三級結構。

圖2　Q/BSA、MY/BSA、KA/BSA納米核殼顆粒及牛血清白蛋白TEM圖Fig.2　TEM Figures of Q/BSA nanoparticles,MY/BSA nanoparticles,Ka/BSA nanoparticles and BSA注:A:Q/BSA,B:MY/BSA,C:Ka/BSA,D:BSA,濃度均為1×10-4 mol/L。

2.2包覆率的測定

已制備好的黃酮納米核殼溶液中,存在著游離的牛血清白蛋白,游離黃酮以及被包覆的黃酮牛血清白蛋白顆粒,通過鹽沉析的方法使得游離的蛋白質和蛋白質納米顆粒全部沉淀下來,取上清的游離黃酮,通過HPLC進樣檢測,7種黃酮醇類化合物的檢測主要是通過調節流動相的比例,每種黃酮醇都是通過先進一針濃度為1.0×10-3mol/L的標品確定其的出峰時間。如圖3所示,譜圖KA即表示濃度為1.0×10-3mol/L的山奈酚,為確定其出峰時間;譜圖KA/10表示濃度為1.0×10-4mol/L的山奈酚,即山奈酚被包覆時的濃度;譜圖KA/BSA表示包覆后游離的山奈酚(上清液),通過包覆率計算公式即求出山奈酚KA的被包覆率為89.77%。圖4～圖9分別是蘆丁,楊梅素,楊梅苷,槲皮素,槲皮苷和異鼠李素的三種色譜圖,通過包覆率計算公式求出的包覆率如表1所示。由表1可看出,楊梅素,山奈酚,槲皮素,異鼠李素的被包覆率都在75%以上,其中楊梅素最高為95.43%。黃酮類化合物的基本結構如圖10A所示,是由兩個芳香環(A 與B)通過C6-C3-C6 三碳鏈相互連接而成的一系列化合物,主要是指以2-苯基色原酮為母核的衍生物,根據C環取代基、3號碳原子氫化程度、苯基取代位置的不同以及C環的開環等異構變化分成不同類型,其中黃酮醇(如圖10B所示)就是一種重要的類型。從文中7中黃酮醇化合物的結構上來分析,A環上都具有7-OH。而由分子結構-結合力關系研究表明黃酮的結構差異明顯影響其與蛋白質的結合能力,7-羥基黃酮與BSA和HSA的結合常數比黃酮與BSA和HSA的結合常數分別大800和40倍,而黃酮/黃烷酮上的羥基糖苷化會后降低與BSA和HSA的結合力約1-3個數量級[18-19]。槲皮素,蘆丁和楊梅苷的C環上的3羥基都存在被糖苷化的現象,被包覆的效果相對而言較差。槲皮苷的被包覆率僅為41.73%,蘆丁和楊梅苷的被包覆率也只有60%多。說明牛血清白蛋白與黃酮的結合力關系影響著包覆率。

圖3　KA,KA/10,KA/BSA的色譜圖Fig.3　Chromatogram diagram of KA,KA/10,KA/BSA

圖4　RU,RU/10,RU/BSA色譜圖Fig.4　Chromatogram diagram of RU,RU/10,RU/BSA

圖5　MY,MY/10,MY/BSA的色譜圖Fig.5　Chromatogram diagram of MY,MY/10,MY/BSA

圖6　MN,MN/10,MN/BSA的色譜圖Fig.6　Chromatogram diagram of MN,MN/10,MN/BSA

圖7　Q,Q/10,Q/BSA的色譜圖Fig.7　Chromatogram diagram of Q,Q/10,Q/BSA

圖8　Q3,Q3/10,Q3/BSA的色譜圖Fig.8　Chromatogram diagram of Q3,Q3/10,Q3/BSA

圖9　ISM,ISM/10,ISM/BSA的色譜圖Fig.9　Chromatogram diagram of ISM,ISM/10,ISM/BSA

黃酮黃酮醇/10峰面積(mAU·min)黃酮醇/BSA峰面積(mAU·min)包覆率(%)KA(山奈酚)18.09821.851289.77Q(槲皮素)34.08624.695886.22Q3(槲皮苷)11.20116.526541.73ISM(異鼠李素)13.93633.327676.12RU(蘆丁)11.08754.148562.58MY(楊梅素)19.42910.888295.43MN(楊梅苷)42.011415.504763.09

圖10　黃酮類化合物及黃酮醇的基本結構Fig.10　Molecular structure of the flavonoid backbone and flavonol

2.3抗氧化活性

2.3.1DPPH自由基清除以清除率達到50%的樣品濃度IC50值能更直接的評價被包覆前后黃酮醇類化合物對DPPH自由基的清除能力變化。從表2可看出,被包覆后的Q3/BSA,MY/BSA,MN/BSA,ISM/BSA納米顆粒的IC50值都僅比包覆前的Q3,MY,MN,ISM高了不到10%;被包覆后的Q/BSA的IC50值為0.393×10-4mol/L,比包覆前高了29.5%;被包覆后的RU/BSA的IC50值比包覆前的RU高了47.9%;被包覆后的KA/BSA的IC50值比包覆前的KA高了54.6%。表明被包覆后的7種黃酮醇對DPPH自由基的清除能力都有所下降,其中山奈酚被包覆后的清除能力下降最為明顯,蘆丁其次,其余5種僅稍有下降。研究表明,槲皮素A環上的5-OH與BSA形成氫鍵后,使得槲皮素被包覆后的抗氧化能力輕微降低[20]。由此說明黃酮醇化合物具有抗氧化活性的基團參與到這種包覆作用中,從而使得包覆后的活性減弱。蘆丁和山奈酚則可能是除A環上的5-OH外,B環上的-OH也參與形成了氫鍵,從而使得它們被包覆后抗氧化活性降低較大。

2.3.2ABTS自由基清除由表3可看出,被包覆后KA/BSA的IC50值比包覆前的高了38.3%,被包覆后RU/BSA的IC50值也比包覆前的RU高了近34.7%,說明被包覆后兩者對ABTS自由基的清除能力下降的比較大。被包覆后的Q/BSA的IC50值比包覆前高了26.7%;被包覆后的Q3/BSA的IC50值比包覆前高了20.3%;被包覆后的MY/BSA的IC50值比包覆前高了46.1%;被包覆后的MN/BSA的IC50值比包覆前高了22.2%;被包覆后的ISM/BSA的IC50值比包覆前高了8.55%。表明被包覆后的7種黃酮醇對ABTS自由基的清除能力都有所下降,其中楊梅素被包覆后的清除能力下降最為明顯,山奈酚,蘆丁其次,其余4種也有不同程度的下降。由此說明除山奈酚和蘆丁外,楊梅素B環上的-OH也可能參與形成了氫鍵。

表2　被包覆前后的黃酮醇類化合物對DPPH自由基的清除能力

注:表中包覆后樣品的清除率已扣除BSA的影響。

表3　被包覆前后的黃酮醇類化合物對ABTS自由基的清除能力

注:表中包覆后樣品的清除率已扣除BSA的影響。

3　結論與討論

本實驗中,利用DMSO使得BSA的部分三級結構的改變來運載疏水性的黃酮醇類化合物,通過BSA結構中的色氨酸基團與黃酮醇類化合物形成的非共價鍵的疏水作用力提供主要的結合力,這種弱相互作用使得BSA包覆黃酮醇分子形成表面親水內部疏水的雙層納米核殼結構,有利于疏水性的黃酮醇在體內的運輸,制得的蛋白質納米核殼顆粒的粒徑均在20 nm左右。據報道,Rahimnejad M et al.通過反溶劑法合成牛血清白蛋白納米顆粒,采用調節溫度、轉速、pH等不同變量控制納米粒徑,但形成的納米粒徑均超過100 nm[21]。MaHam et al.提出小于50 nm的納米載體可在淋巴系統的細胞間和細胞內自由分布,而更大的納米載體容易被捕獲排出體外而失效[18]。本次實驗中制得的20 nm的蛋白質黃酮納米核殼顆粒使得黃酮作為藥物在淋巴系統的細胞間和細胞內運輸過程更為通暢,且更不容易被捕獲排出體外而失效。

通過對包覆率的測定發現,BSA對黃酮醇類化合物的包覆作用跟黃酮醇化合物的結構有很大的關系,其中黃酮醇A環上的7-羥基,有助于BSA對黃酮醇化合物的包覆,使得包覆率提高。但是黃酮的糖苷化則會使的包覆作用減弱,因為糖苷是大基團形成的位阻較大,不利于兩者的相互作用。黃酮類化合物作為藥物小分子經小腸吸收和代謝后在血液循環中與蛋白質結合,其與蛋白質的結合程度會影響黃酮類化合物及其代謝物的清除率和轉運進入細胞和組織的速率[18]。因此研究不同黃酮類化合物與BSA的包覆率關系有助于提高黃酮的利用度。

綜合2種抗氧化實驗結果來看,黃酮醇被包覆后氧化能力都是下降的。黃酮的抗氧化能力通常要求A環5和7位,C環3位和B環存在羥基。在本實驗中,槲皮素,槲皮苷,異鼠李素和楊梅苷包覆后的抗氧化活性都稍有降低,說明它們的A環上的5-OH與BSA參與形成了氫鍵,影響了包覆后的抗氧化活性。而楊梅素,蘆丁和山奈酚則可能是除A環上的5-OH外,B環上的-OH也參與形成了氫鍵,從而使得它們被包覆后抗氧化活性降低較大。據文獻[20]報道在模擬腸道流體(SIF)測定槲皮素包覆前后穩定性實驗中,被包覆后Q/BSA納米核殼顆粒顯著提高了Q在SIF中的穩定性;這種包覆作用同時也保護了Q的抗氧化活性。因此合成牛血清白蛋白黃酮納米核殼顆粒可以作為提高黃酮穩定性保護黃酮抗氧化活性實現黃酮較高生物利用度的一種新途徑。

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Study on the preparation of BSA-Flavonols Nanoparticles and its antioxidant activity

YANG Chen1,XU Shu-wen2,CHEN Long-sheng2,LIU Hui3,WANG Kai3

(1.College of Environment and Life Science,Shanghai Normal University Shanghai 200235;2.Anhui institute of science and technology Anhui Hefei 230000;3.Anhui institute of application and technology Anhui Hefei 230088)

In this work,bovine serum albumin molecules and hydrophobic flavonols was used to formed bovine serum albumin/flavonols nano core-shell particles,the size of nanoparticle was determined by TEM,the adsorption capacity was analyzed by HPLC and the antioxidant activity of flavonol before and after being embedded was evaluated by DPPH and ABTS radical scavenging assays in the study. The result demonstrated that the size of nanoparticle was 20 nm.The conjugation of bovine serum albumin and flavonols affected the encapsulation of BSA. Moreover,the antioxidant activity group of flavonols formed an intermolecular hydrogen bond with BSA,making the activities of flavonols were hindered by the embedding of bovine serum albumin nanoparticle. The preparation of BSA/flavonoids nano core-shell particles would be a new way to promote the stability of flavonoids,preserve the antioxidant activity and achieve a higher bioavailability of flavonoids.

Bovine serum albumin;hydrophobic flavonols;nano core-shell particle;antioxidant activity

2015-01-28

李陳(1990-)，碩士，E-mail:1805519828@163.com

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000