淫羊藿藥渣中多糖的提取及其體外抗氧化活性評價

付 亮,袁璟亞,丁春邦,張中華

(1.達州市農業科學研究所,四川達州 635000;2.四川農業大學生命科學學院,四川雅安 625014)

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淫羊藿藥渣中多糖的提取及其體外抗氧化活性評價

付 亮1,袁璟亞1,丁春邦2,*,張中華1

(1.達州市農業科學研究所,四川達州 635000;2.四川農業大學生命科學學院,四川雅安 625014)

淫羊藿,藥渣,多糖,提取,抗氧化活性

淫羊藿又名仙靈脾,是小檗科(Berberidacea)淫羊藿屬(Epimedium)多年生草本植物,為我國傳統補益中藥,具有堅筋骨、益精氣、補腰膝、強心力等作用[1]。近年來關于淫羊藿的藥理研究表明,淫羊藿對心腦血管系統、免疫系統、生殖系統、骨髓系統等有一定的保健作用[2],具有改善心血管系統功能、調節雄性發育、調節免疫、抑制腫瘤、抗骨質疏松、抗氧化等生理活性[3-5]。

目前,對淫羊藿屬植物的研究大多集中于藥理藥效,而對提取工藝的研究相對較少;此外,長期以來人們更注重對淫羊藿最主要有效成分總黃酮的提取研究而忽略了其另一主要有效成分多糖,提取完黃酮的淫羊藿藥渣往往直接丟棄,很大程度上造成了淫羊藿資源的浪費。近年來,由于生物化學和分子生物學等學科的飛速發展,人們對多糖及其復合物的活性作用有了越來越深入的認識,使得多糖的研究已成為目前生命科學中最活躍的研究領域之一[6],淫羊藿多糖作為一種安全有效的多糖,也受到了越來越多的重視。藥理學研究顯示,淫羊藿多糖具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、調節免疫、延緩衰老等多種活性[7-9],在許多藥理指標上,效果優于或作用特點不同于淫羊藿總黃酮[10],有著不容忽視的地位,在癌癥、心腦血管疾病等重大疾病的防治方面具有廣闊的開發前景。

程浩然[11-12]等研究發現淫羊藿原藥中提取的多糖和從藥渣中提取的多糖都具有一定的體外抗氧化活性,但二者差異如何,未見深入報道。本研究從提完淫羊藿總黃酮的藥渣中提取多糖,考察其得率和體外抗氧化活性,并與直接從原藥材中提取多糖的方法相比較,不僅可以初步評價該工藝及所提多糖的質量,也可以初步比較其他各種提取方法及其所提多糖的抗氧化活性;從淫羊藿藥渣中提取多糖并考察其體外抗氧化活性,不僅可以實現廢物利用,提高淫羊藿藥材的綜合利用率,為淫羊藿多糖的大規模工業化生產提供理論依據,同時對于新型植物藥、化妝品和食品配料或添加劑的研究與開發,特別是淫羊藿資源的合理利用和保護以及能源的節約也具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

粗毛淫羊藿2012年9月采集于四川雅安上里的,由四川農業大學生命科學與理學院丁春邦教授鑒定。

石油醚(沸點60～90 ℃)、乙醇、氯仿、正丁醇、抗壞血酸、FeSO4、鄰二氮菲均分析純,成都科龍化工試劑有限公司;H2O2四川西隴化工有限公司;2,2-二苯基-1-苦味基肼(DPPH)、氯化硝基四氮唑藍(NBT)、還原型輔酶Ⅰ(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、纖維素酶(≥400u/mg,Biochemika)Sigma公司;磷酸緩沖液(PBS)國藥集團化學試劑有限公司;MD44透析袋截留分子量8000-14000,北京Solarbio科技有限公司。

UV-3200PC掃描型紫外/可見分光光度計上海美譜達儀器有限公司;BT-124S電子天平Sartorius公司;DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱上海一恒科技有限公司;FW80中草藥粉碎機和DZ-2BC真空干燥箱天津泰斯特儀器有限公司;HPD-25無油真空泵及循環水式真空泵天津津騰實驗設備有限公司;RB-52AA真空旋轉蒸發儀上海亞榮生化有限公司;RM-220實驗室超純水機四川沃特爾科技發展有限公司;KQ-300GDV恒溫數控超聲波清洗器昆山舒美超聲儀器有限公司;ML-2080MG微波爐海爾集團;HW·SY11-K電熱恒溫水浴鍋北京市長風儀器儀表有限公司;H-1650離心沉淀機長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1淫羊藿多糖的提取及純化

1.2.1.1材料預處理將淫羊藿地上部分洗凈,鼓風干燥箱內50 ℃烘干,中藥粉碎機粉碎,過60目篩,經石油醚索氏提取至無色后烘干混勻,超聲波提取法提取總黃酮[13],藥渣烘干粉碎備用。

1.2.1.2淫羊藿藥渣中多糖的提取稱取經預處理過的材料100 g,置3000 mL具塞錐形瓶中,按料液比1∶10(g/mL)加入水,在90 ℃提取溫度下提取2次,每次30 min[13]。

1.2.1.3其他方法提取淫羊藿多糖分別稱取8份50 g經過預處理的材料至1000～3000 mL不等的具塞錐形瓶中,每種方法處理2份后合并。采取以下4種方法提取:水煮法[14],超聲波提取法[15],酶提取法[16],微波提取法[17]。

1.2.1.4淫羊藿多糖的純化[18]提取液分別合并,旋轉蒸發儀濃縮至50 mL,完全轉移至1000 mL容量瓶,加入純乙醇,酒度計測定使醇含量達90%,攪勻,放置12 h后過濾得沉淀;將沉淀完全溶于200 mL蒸餾水中,攪勻放置4 h,過濾后濾液再次濃縮至50 mL,重復一次醇沉過程,過濾得沉淀,即為淫羊藿粗多糖;將粗多糖分別溶于100 mL蒸餾水中,Sevage法(氯仿∶正丁醇=4∶1,V/V)除盡蛋白質,水層逆向流水透析24 h,后浸入蒸餾水中透析36 h,透析袋內液體濃縮至30 mL,完全轉移至50 mL燒杯中,冷凍干燥,分別得淺棕色淫羊藿多糖粉末并稱重。

1.2.2淫羊藿多糖體外抗氧化活性的測定

1.2.2.1淫羊藿多糖對DPPH·清除能力的測定參照Yokozawa和Larrauri等[19-20]的方法進行適當修改。以抗壞血酸為對照,將五種方法所提多糖和抗壞血酸用水溶解,均制成一系列不同濃度(0.04～0.7 mg/mL)的樣品溶液。每種樣品溶液各取2 mL與2 mL 2×10-4mol/L DPPH-乙醇溶液混合,靜置30 min,在517 nm處測定各吸光度。DPPH·清除能力通過以下公式計算:

DPPH自由基清除活性(%)=1-[(Asample-Ablank)/ADPPH]×100

式中,Asample為樣品與DPPH反應(2 mL樣品+2 mL DPPH)后的吸光度,Ablank為樣品空白(2 mL樣品+2 mL無水乙醇)的吸光度,ADPPH為未加樣品的DPPH(2 mL DPPH+2 mL無水乙醇)的吸光度。抗壞血酸對DPPH·清除活性的測定中抗壞血酸溶液在操作上等同于上述樣品組。

超氧陰離子自由基基清除活性(%)=1-[(Asample-Ablank)/Acontrol]×100

1.2.2.3淫羊藿多糖對·OH清除能力的測定,參考文獻[23]以抗壞血酸為對照,將五種方法所提多糖和抗壞血酸用水溶解,制成一系列不同濃度(0.2～1.4 mg/mL)的樣品溶液。樣品溶液反應體系總體積為6 mL,包括1 mL 7.5×10-4mol/L鄰二氮菲-乙醇溶液、2 mL PBS緩沖液(pH7.4)、1 mL 7.5×10-4mol/L FeSO4溶液、1 mL樣品和1 mL 0.01% H2O2;空白溶液中,使用1 mL水取代樣品,對照組中,2 mL H2O取代樣品和H2O2。樣品組、空白組和對照組均在37 ℃下恒溫60 min,在536 nm下測定吸光度,分別表示為Asample、Ablank和Acontrol。·OH清除能力由以下公式計算:

1.2.3從淫羊藿藥渣中提取多糖工藝的評價各種提取方法均可得到一定得率的多糖,這些多糖可以配制成使自由基清除率達50%的溶液總體積,本研究命名為自由基清除總效力,自由基清除總效力通過以下公式計算:

A=Y/C

式中,A為自由基清除總效力(mL/mg),Y為該方法所提多糖的得率(%),C為該方法所提多糖清除此自由基的IC50(mg/mL)。

2　結果與分析

2.1不同方法提取多糖的得率

表1　文獻記載及本實驗不同

水煮提取法、超聲波提取法、酶提取法、微波提取法用原藥材提取多糖和從淫羊藿藥渣中提取多糖的得率如表1所示,分別為1.94%、5.98%、7.20%、3.45%和3.68%,相比文獻記載有差異,但因文獻記載中所用實驗材料種類、多糖精制提純方法均不同,所以不宜比較各方法優劣。本實驗統一材料和精制提純方法進行實驗重現,相比直接用原材料提取,藥渣本應因損失部分多糖而得率偏低,但本實驗3.68%的多糖得率并非最低,這一方面可能是因為前人的方法應用在粗毛淫羊藿這種材料上并未發揮最大提取效率,另一方面是因為本工藝在前一步提取總黃酮時采用超聲波提取法,其空化作用使材料細胞壁破碎,加大了后續多糖提取的效率,而多糖本身雖然也有損失,但該損失與空化作用相比顯得不明顯;而相比提取效率更高的超聲法和酶法,這種損失就比較明顯,分別損失了38.46%和48.88%。雖然理論上可以在總黃酮的精制過程中回收部分多糖,但如此會大大增加工藝的復雜性和成本;因本工藝的多糖提取原料為藥渣,之前已經過超聲提取法提取過總黃酮,已經過空化作用破壁,有利于多糖在水中的溶出,故之后多糖提取沒有必要再采取高耗能的方法,只需操作簡單且能耗低的水煮法即可,故從淫羊藿藥渣中水煮提取多糖的工藝雖有多糖損失,但所得多糖的價值本身足以彌補這種損失。

2.2淫羊藿多糖的抗氧化活性

2.2.1淫羊藿多糖對DPPH·清除作用由圖1可以看出,在低濃度范圍內,多糖對DPPH·的清除率與質量濃度呈現較好的量效關系,但隨著多糖濃度的增加,清除率趨于平緩,最后穩定;多糖濃度大于0.6 mg/mL后,超聲波提取法、酶提取法、微波提取法、水煮法用原藥材提取所得多糖和從淫羊藿藥渣中提取所得多糖的清除率分別為89.41%、88.88%、87.29%、85.41%、和82.96%,雖然藥渣所提多糖略低但差距都不明顯;但就清除率達到50%時的多糖濃度而言,超聲波提取法、酶提取法、微波提取法、水煮法用原藥材提取所得多糖和從淫羊藿藥渣中提取所得多糖的IC50分別為0.161、0.153、0.097、0.093和0.262 mg/mL,可知抗氧化活性強弱有所差別,大小分別為水煮所提多糖>微波所提多糖>酶法所提多糖>超聲所提多糖>藥渣所提多糖,其中水煮所提多糖和微波所提多糖差距僅為0.004 mg/mL,酶法所提多糖和超聲所提多糖差距也只有0.008 mg/mL,初步推測水煮法所提多糖和微波法所提多糖的DPPH·清除能力相似,酶法所提多糖和超聲法所提多糖的也相似,但這2組之間存在差距;至于藥渣所提多糖,其清除率則明顯偏低,需要適當增加濃度才能達到相應的清除率,這或許是因為與原材料相比,藥渣已經損失了部分具有較強DPPH·清除能力的多糖種類而造成的。總地來說,藥渣所提多糖仍然表現出了較強的DPPH·清除活性。

圖1　不同方法所提多糖對DPPH·的清除作用Fig.1　Scavenging effects of polysaccharides from different extraction methods on DPPH·

圖2　不同方法所提多糖對·的清除作用Fig.2　Scavenging effects of polysaccharides from different extraction methods on ·

圖3　不同方法所提多糖對·OH的清除作用Fig.3　Scavenging effects of polysaccharides from different extraction methods on·OH

2.3從淫羊藿藥渣中提取多糖工藝的評價

3　討論

在多糖的精制過程中,本研究同時采用單因素實驗考察了醇沉時乙醇體積分數、醇沉次數對多糖得率的影響,結果最佳工藝為使用純乙醇令其體積分數達到90%,醇沉2次。

淫羊藿多糖雖經純化,卻不排除存在其他蛋白質等雜質對實驗結果的影響,但因所有操作都統一有序,故這種影響也是相同的,實驗結果仍然較為可靠,今后有必要對多糖進行進一步精制純化。

在考察淫羊藿多糖對3種自由基的清除活性時,為了在圖中有限范圍內更多顯示多糖對自由基的清除趨勢,突出各提取方法所提多糖的差別,本實驗對抗壞血酸的濃度選擇偏大,造成抗壞血酸的清除率曲線規律不明顯,也表明淫羊藿多糖對這3種自由基的清除活性與抗壞血酸相比有所差距,但對其他多種自由基的清除活性有待于進一步研究;此外,本實驗所得多糖的自由基清除率曲線雖規律明顯,但IC50準確性有待于進一步提高,所得多糖之間的自由基清除率大小順序有待于進一步檢驗,今后的研究中有必要增加多糖溶液密度梯度,運用統計學方法處理數據,根據“濃度-清除率”對應關系精確擬合曲線方程,重新科學準確地比較各方法所提多糖的自由基清除活性。

如實驗結果所示,如果分別從得率和3種自由基的清除活性去評價淫羊藿藥渣中提取多糖的工藝,往往得出不同甚至相反的結論,為了使結論科學準確,需要將2者有機結合,為此,本研究擬定了自由基清除總效力這樣一個概念,對該工藝做到了合理科學地評價。

4　結論

從提完總黃酮的淫羊藿藥渣中提取多糖的工藝操作簡單,不需要復雜的專業設備且能耗低,與直接用原材料提取相比,所提多糖損失較少;雖然部分清除自由基的能力有所下降,但體外抗氧化活性仍然較強,具有較高的醫療和保健價值,所以從得率和體外抗氧化活性來看,該工藝具有較高的可行性,較大限度地提高了淫羊藿的綜合利用率,為淫羊藿藥渣的合理開發利用和工業化生產提供了參考,但要真正科學全面的評價該工藝,需要精制提純和藥理藥效等方面的進一步深入研究。

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Polysaccharides Extraction from Residue ofEpimediumand Its Antioxidant Activity Evaluation

FU Liang1,YUAN Jing-ya1,DING Chun-bang2,*,ZHANG Zhong-hua1

(1.Dazhou Institute of Agricultural sciences,Dazhou,635000,China;2.College of Life Sciences,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

Epimedium;residue;polysaccharides;extraction;antioxidant activity

2014-12-24

付亮(1984-),男,碩士,主要從事藥用植物資源研究工作,E-mail:fuliangrain@126.com。

張中華(1972-),男,本科,研究員,主要從事作物育種與栽培工作,E-mail:zzhdxh@163.com。

四川省科技廳應用基礎項目(2008JY0094-2)。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000