乙酸異戊酯高產菌株脂肪酶Lip2基因的克隆及表達研究

譚才鄧,朱美娟,廖延智,朱曉立

(廣東輕工職業技術學院,廣東廣州 510300)

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乙酸異戊酯高產菌株脂肪酶Lip2基因的克隆及表達研究

譚才鄧,朱美娟,廖延智,朱曉立*

(廣東輕工職業技術學院,廣東廣州 510300)

通過PCR擴增了乙酸異戊酯高產菌Loq-c的脂肪酶基因Lip2,其序列與Gene Bank中的Candida cylindracea Lip2 gene(序列號X64704.1)的序列相似度最高,為89%。構建原核表達載體pQE-lip2,轉化大腸桿菌E.coliBL21(DE3),獲得了重組菌BL21(pQE-lip2)。經過表達條件探索,用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,脂肪酶Lip2原核可溶表達最佳條件為:誘導溫度30 ℃,IPTG使用濃度為1.5 mmol/L,150 r/min轉速的條件下誘導表達5 h。

乙酸異戊酯,脂肪酶,克隆,表達

酯類化合物是發酵食品的重要香氣成分之一,酵母菌是在發酵食品中合成酯類物質的重要微生物。酵母菌合成酯類化合物的途徑主要有三個:酯化反應、醇解反應和脫氫反應[1]。酯化反應是合成酯類化合物的主要途徑,其催化反應的酶類為脂肪酶,因此脂肪酶被廣泛應用于食品加工及食品風味改良。此外脂肪酶在油脂工業、洗滌工業、化妝品工業及生物能源等方面應用廣泛[1-5]。近年來,在醫藥工業中,脂肪酶因能被用于手性制備光學純的藥物而倍加矚目[3]。

脂肪酶(EC 3.1.1.3)有多個同工酶,Longhi[6]等研究發現柱狀假絲酵母(Candidacylindracea)有5個脂肪酶同工酶;Fickers[7]等研究解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)時,發現菌株E150能編碼合成16個脂肪酶同工酶,而分泌到胞外的脂肪酶主要是Lip2,并且Lip2偏好催化合成短鏈酯類。

菌株Loq-c是本實驗室分離獲得的一株高產乙酸異戊酯的克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)。本實驗參考前人的結果設計多個脂肪酶引物,通過PCR反應試探菌株Loq-c是否有脂肪酶,是否通過脂肪酶合成乙酸異戊酯,并將其克隆及進行原核表達研究,為生物高效合成乙酸異戊酯提供有價值的參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1質粒與菌種質粒為pQE30;乙酸異戊酯生產菌Loq-c,克隆菌株E.coliDH5α,表達菌株E.coliBL21(DE3)。以上材料均由本實驗室提供。

1.1.2試劑藥品Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒購于上海生工生物工程公司;PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 DNA Ligase購于寶生物工程(大連)有限公司;其它試劑均為國產分析純藥品。

1.1.3儀器SHP-150生化培養箱上海精宏實驗設備有限公司;ZWY-240搖床上海智誠分析儀器制造有限公司;SC-3614高容量低速離心機安徽中科中佳科學儀器公司;1-14高速離心機Sigma;EasyCycler96PCR儀德國耶拿分析儀器股份公司;電泳儀Mini-PROTEAN、Mini-Sub cell GT,BIO-RAD;電穿孔儀MicroPulser,BIO-RAD;XO-150超聲細胞波破碎儀南京先歐儀器制造公司。

1.1.4引物

表1　脂肪酶PCR擴增引物

注:引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2實驗方法

1.2.1菌株Loq-c粗酶的制備將50 mL菌株Loq-c發酵液經3000 r/min離心5 min,菌體沉淀用5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)懸浮,于研缽中添加適量石英砂研磨破碎5 min,3000 r/min離心5 min,上清液即為粗酶液,置于4 ℃冰箱中保存,12 h內使用。

1.2.2菌株Loq-c粗酶中酯類合成酶的定性分析酵母菌合成酯類化合物關鍵酶主要有3類,分別為脂肪酶(R1COOH+R2OH →R1COOR2+H2O)、醇酰基轉移酶(R1OH+R2COSCoA →R2COOR1+CoASH)和醇脫氫酶(R1OCH(OH)R2+NAD(P)+→R2COOR1+NADH+H+),其中脂肪酶是主要的酯類合成酶[1,3]。根據其底物的不同,本實驗對菌株Loq-c粗酶中是否含有脂肪酶進行定性實驗,將10 mL菌株Loq-c粗酶液置于50 mL三角瓶中,加入0.1 mL乙酸,0.1 mL異戊醇,用封口膜封口,于搖床中30 ℃、120 r/min振蕩反應2 h(同時做對照實驗),由于產物乙酸異戊酯的氣味(香蕉味)特殊,其濃度在1 μL/L時可明顯辨別,因此通過氣味感官評定判斷是否產生乙酸異戊酯。

1.2.3酵母基因組NDA提取根據Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒操作說明書進行,總DNA于-20 ℃保存備用,用于PCR反應擴增脂肪酶基因片段。

1.2.4PCR擴增初步確定脂肪酶同工酶種類PCR反應體系:5×PrimeSTAR 緩沖液10 μL,dNTP混合液(每種2.5 mmol/L)5 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,DNA模板1 μL,PrimeSTAR HS DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL,補水至50 μL。

PCR反應程序:96 ℃預變性4 min;96 ℃變性20 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸2 min,32個循環;72 ℃延伸5 min,并用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況。

1.2.5脂肪酶Lip2基因的克隆與表達載體的構建PCR反應體系與反應程序同1.2.4,引物重新設計:上游引物(cgcggatccatgaagctctgtttgcttgctcttggtgct,酶切位點為Bam HI),下游引物(cccaagctttactacacaaa gaacagtggcgggttggaa,酶切位點為Hind Ⅲ)。PCR產物經純化后,用內切酶Bam HI與Hind Ⅲ進行雙酶切,同時對質粒pQE30進行雙酶切。酶切產物經純化后,用T4連接酶進行連接。連接產物電擊轉化大腸桿菌DH5α。

1.2.6脂肪酶Lip2基因序列比對分析與原核表達分析挑取陽性轉化菌株,搖菌提取重組質粒送至上海生工生物工程公司進行測序,所得序列在NCBI網站上進行比對分析。重組質粒轉化表達宿主菌BL21(DE3)后,從誘導時間、誘導溫度、誘導物IPTG濃度等條件對脂肪酶Lip2進行原核表達分析。

1.2.7誘導時間對脂肪酶Lip2可溶表達的影響分析在誘導溫度30 ℃,IPTG濃度1 mmol/L,轉速150 r/min的條件下,誘導表達時間設定在0～24 h,同時以含空載體pQE30的表達菌株進行對照實驗。離心取等量的菌體分別進行超聲波破碎,經13000 r/min離心10 min后取上清液,進行SDS-PAGE分析表達情況。

1.2.8誘導溫度對脂肪酶Lip2可溶表達的影響分析在最佳誘導時間,IPTG濃度1 mmol/L,轉速150 r/min的條件下,誘導表達溫度分別設定在24～40 ℃之間。同1.2.7,用SDS-PAGE方法進行表達情況分析。

1.2.9誘導物IPTG濃度對脂肪酶Lip2可溶表達的影響分析在最佳誘導時間,在最佳誘導溫度,轉速150 r/min的條件下,誘導物IPTG使用濃度設定在0.2～4.0 mmol/L之間。同1.2.7,用SDS-PAGE方法進行表達情況分析。

2　結果與分析

2.1菌株Loq-c粗酶中酯類合成酶的定性分析

通過定性實驗及感官評定:含有粗酶液與底物的反應瓶中明顯聞到乙酸異戊酯的味道,而只有粗酶液或只有底物的對照瓶中沒有聞到乙酸異戊酯的味道,因此可判斷菌株Loq-c中催化合成乙酸異戊酯的酶類中有脂肪酶。

2.2菌株Loq-c脂肪酶同工酶種類的初步分析

根據Longhi[6]等的研究結果,分別設計5個脂肪酶同工酶引物,以Loq-c基因組DNA為模板進行PCR反應擴增脂肪酶基因片段,PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1。

圖1　菌株Loq-c脂肪酶PCR擴增產物電泳圖Fig.1　Agarose gel electrophoresis analysis of Lipase PCR products of strain Loq-c注:M-marker DS2000;泳道1～5:引物分別為Lip1、Lip2、Lip3、Lip4、Lip5的PCR產物。

從圖1可知,Lip2引物對擴增出條帶,在1.0～2.0 kbp有明顯條帶,與目標片段1.6 kbp吻合,而其它引物對則沒有擴增出相應的條帶,可認為菌株Loq-c催化合成乙酸異戊酯的酶類有脂肪酶Lip2。

2.3脂肪酶Lip2基因的克隆與表達載體的構建

根據表達載體pQE30的多克隆位點重新設計引物進行PCR反應擴增Lip2基因片段,PCR產物與質粒pQE30分別進行雙酶切后進行連接,連接產物電擊轉化克隆菌株DH5α,重組質粒命名為pQE-lip2。重組質粒經測序,所得序列在NCBI網站進行比對分析,結果顯示,其序列與Gene Bank中的CandidacylindraceaLip2 gene(序列號X64704.1)的序列相似度最高,為89%,表明菌株Loq-c脂肪酶Lip2基因克隆成功。將重組質粒pQE-lip2轉化到表達菌株BL21(DE3)中,對其表達進行分析研究。

2.4Loq-c脂肪酶Lip2原核可溶表達分析

為了探討脂肪酶Lip2在大腸桿菌中能否以可溶的形式進行表達,從誘導時間、誘導溫度、誘導物IPTG濃度這幾方面進行單因素探索,結果如下:

2.4.1誘導時間對脂肪酶Lip2可溶表達的影響誘導時間對重組蛋白可溶表達的影響結果見圖2。

圖2　誘導時間對脂肪酶Lip2可溶表達的影響Fig.2　Effect of induced time on soluble expression of Lipase 2注:1:pQE30;2:0 h;3:1 h;4:2 h;5:3 h;6:5 h;7:10 h;8:15 h;9:24 h。

由圖2可知,含空載體pQE30的表達菌株經過24 h的誘導,并沒表達出目的蛋白(泳道1)。重組質粒pQE-lip2在0～24 h的表達情況如下:0 h時沒表達出目的蛋白(泳道2),從1 h開始,上清液中在44～66 ku之間有明顯條帶,與目標片段58 ku吻合(箭頭處),進一步表明Liq2基因克隆成功,并且脂肪酶Lip2在大腸桿菌中能以可溶形式進行表達。從圖中可看出,脂肪酶Lip2在第5 h(泳道6)時表達量達到最高值,往后延長表達時間并沒有再提高目的蛋白表達量,因此可認為脂肪酶Lip2可溶表達最佳誘導時間為5 h。

2.4.2誘導溫度對脂肪酶Lip2可溶表達的影響誘導溫度對重組蛋白可溶表達的影響結果見圖3。

圖3　誘導溫度對脂肪酶Lip2可溶表達的影響Fig.3　Effect of induced temperature on soluble expression of Lipase 2注:1:24 ℃;2:26 ℃;3:28 ℃;4:30 ℃;5:32 ℃;6:34 ℃;7:36 ℃;8:38 ℃;9:40 ℃。

由圖3可知,誘導表達溫度在30 ℃時,目的蛋白條帶最濃(泳道4),說明在此溫度Lip2可溶表達量最高。當溫度低于30 ℃時細胞生命活動速率較慢,目的蛋白表達量較低;當溫度高于32 ℃時,目的蛋白可能轉向以包涵體的形式進行表達,導致可溶表達量不再提高。因此可認為Lip2可溶表達最佳誘導溫度為30 ℃。

2.4.3誘導物IPTG使用濃度對脂肪酶Lip2可溶表達的影響誘導物IPTG使用濃度對重組蛋白可溶表達的影響結果見圖4。

圖4　誘導物IPTG使用濃度對脂肪酶Lip2可溶表達的影響Fig.4　Effect of concentration of IPTG on soluble expression of Lipase 2注:1:0.2 mmol/L;2:0.5 mmol/L;3:1.0 mmol/L;4:1.5 mmol/L;5:2.0 mmol/L;6:2.5 mmol/L;7:3.0 mmol/L;8:3.5 mmol/L;9:4.0 mmol/L。

由圖4可知,當IPTG濃度在1.5 mmol/L以內時,Lip2可溶表達量隨著IPTG濃度的提高而升高,并在1.5 mmol/L時達到最高,繼續提高IPTG濃度并沒能提高Lip2的可溶表達量,可能較高濃度IPTG的作用下Lip2轉向包涵體形式進行表達。因此可認為Lip2可溶表達最佳IPTG使用濃度為1.5 mmol/L。

3　結論與展望

本實驗成功克隆獲得乙酸異戊酯高產菌株Loq-c的脂肪酶Lip2基因,其序列與Gene Bank中的Candida cylindracea Lip2 gene(序列號X64704.1)的序列相似度最高,為89%。構建原核表達載體pQE-lip2并進行原核可溶表達實驗,實驗結果表明:脂肪酶Lip2在大腸桿菌中能以可溶形式進行表達,其可溶表達的最佳條件為:誘導溫度30 ℃,IPTG使用濃度為1.5 mmol/L,150 r/min轉速的條件下誘導表達5 h。

目前,對目的酶基因進行異源高效表達是獲得高活力酶的一種最直接、高效、便捷的方式,當然,由于糖基化、蛋白質折疊等翻譯后修飾的不同,會導致一些異源表達的蛋白不具備其本身具有的活性,因此可溶活性表達非常重要。目前異源表達系統大致可分為原核表達與真核表達,原核表達系統與真核表達系統相比,有其自身的優點:譬如培養條件簡單,成本低,后繼純化工作簡單等,因此本實驗以原核表達的方式進行外源表達脂肪酶Lip2基因。本研究的后續工作應在脂肪酶Lip2的分離純化與活性研究方面展開,為生物高效合成乙酸異戊酯提供有價值的參考。

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Study on the cloning and prokaryotic soluble expression of Lipase geneLip2 of high-yield isoamyl acetate strain

TAN Cai-deng,ZHU Mei-juan,LIAO Yan-zhi,ZHU Xiao-li*

(Guangdong Industry Technical College,Guangzhou 510300,China)

The gene encoding Lipase2(Lip2)from high-yield isoamyl acetate strain Loq-c was amplified by polymerase chain reaction(PCR),its sequence was most similar to Candida cylindracea Lip2 gene(X64704.1),the similarity was 89%. Subsequently,the corresponding expression vector pQE-lip2 was constructed and cloned intoE.coliBL21(DE3),resulting in recombinant strain BL21(pQE-lip2). After explorations,SDS-PAGE analysis showed that the best conditions for soluble expression of Lip2 was:30 ℃,IPTG 1.5 mmol/L,150 r/min,induced for 5 hours.

Isoamyl acetate;Lipase;clone;express

2015-05-19

譚才鄧(1980-)，男，碩士，高級實驗師，研究方向：食品與生物技術，E-mail：tcdeng@126.com。

朱曉立(1980-)，男，碩士，副教授，研究方向：食品與生物技術，E-mail：zxl800101@126.com。

廣東省高等學校優秀青年教師培養計劃資助項目(Yq2013166)；廣東輕工職業技術學院自然科學基金重點項目(KJ201308)；廣東輕工職業技術學院創新強校重大科研項目培養計劃(1A20205)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000