丙酸桿菌素的發酵及其分離純化的初步探究

邢勝杰,賈彩鳳,楊雪霞,何新舟,劉曉霞,高紅亮,*,常忠義,金明飛

(1.華東師范大學生命科學學院,上海 200241;2.東華大學 化學化工與生物工程學院,上海 201620)

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丙酸桿菌素的發酵及其分離純化的初步探究

邢勝杰1,賈彩鳳1,楊雪霞2,何新舟1,劉曉霞1,高紅亮1,*,常忠義1,金明飛1

(1.華東師范大學生命科學學院,上海 200241;2.東華大學 化學化工與生物工程學院,上海 201620)

本文以薛氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)發酵液為原料,以抑菌活性為指標,利用分離純化技術提取發酵液中小分子丙酸桿菌素。丙酸桿菌素初步分離純化確定的最佳脫鹽條件為:上樣量5 mL,流速0.5 mL/min,收集方式為手動收集,電導率達到1.5 ms/cm時停止收集;Superdex peptide最佳凝膠過濾條件為:上樣量500 μL,流速0.5 mL/min,深孔板固定體積收集,每孔收集體積200 μL。最終得到一種分子量為698.9556 u的丙酸桿菌素,其單位抑菌活性為初始的6.8倍,抑菌活性得率為10.9%。酶解實驗表明純化后的丙酸桿菌素仍保留抑菌活性,且對胃蛋白酶敏感。

丙酸桿菌素,分離純化,薛氏丙酸桿菌

細菌素是一類重要的食品生物防腐劑[1-3],目前人們研究比較清楚的是乳酸鏈球菌素(Nisin)[4],它對引起食品腐敗變質的革蘭氏陽性菌具有良好的抑制作用,但不能抑制革蘭氏陰性菌和霉菌等的生長[5]。研究發現丙酸桿菌素不但能夠抑制部分革蘭氏陽性菌,而且對絕大多數革蘭氏陰性菌和霉菌具有良好的抑制和殺滅作用。

目前國內外報道過的丙酸桿菌素主要有5種[6],即丙酸桿菌素PLG-1、丙酸桿菌素T1、丙酸桿菌素JenseniiG、丙酸桿菌素SM1和丙酸桿菌素MicrogardTM。其中Microgard最初由法國羅地亞公司研發生產,它是由薛氏丙酸桿菌發酵制備得到的一種丙酸桿菌素,雖然它的主要抑菌成分進入人體后能被胃蛋白酶消化分解,但它是一種混合物,里面還含有丙酸、乙酸及無機鹽等小分子物質[7]。目前國內對于丙酸桿菌素的研究主要集中在丙酸桿菌素發酵培養基的優化方面[3,7-9]。最新的研究成果潘淼等人[10]也只是研究了玉米漿和大豆蛋白胨作為替代氮源對薛氏丙酸桿菌產生丙酸桿菌素的影響,對于薛氏丙酸桿菌素的分離純化還未見報道,因此本文在發酵罐制備丙酸桿菌素粗提物的基礎上通過初步分離純化技術制備出一種小分子丙酸桿菌素,并對它的相對分子量和胃蛋白酶敏感性做了初步的分析。既為薛氏丙酸桿菌代謝物的工業化生產提供了參考,又建立了一種小分子細菌素的分離純化方法。

1　材料與方法

1.1材料與設備

1.1.1菌種薛氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)為發酵菌株由華東師范大學生命科學院微生物實驗室分離并保存;

惡臭假單胞菌(Pseudomonas putiu)為抑菌活性測定中指示菌株由上海疾病控制中心提供。

1.1.2培養基惡臭假單胞菌培養基,LB培養基;丙酸桿菌種子培養基,SLB培養基[3]:胰蛋白胨10 g,酵母粉10 g,60%乳酸鈉16.7 mL,KH2PO40.25 g,MnSO40.005 g,蒸餾水溶解定容至1 L,pH7.0;發酵培養基為葡萄糖培養基,用1.5%葡萄糖取代SLB中的乳酸鈉,其它成分不變。

1.1.3儀器BIOF-6000B型10L國產發酵罐上海高機生物工程公司;Sorvall RC-6 plus 冷凍離心機Thermo公司;GLZY-05B冷凍干燥機上海浦東冷凍干燥設備有限公司;RE52-3旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠;CD400電導率測定儀安萊利思儀器科技有限公司;SynergYHT酶標檢測儀基因有限公司;VERsaflux超濾儀上海通用電氣有限公司UFP-3-C-3MA超濾柱上海通用電氣有限公司;Sephadex G-10 XK16/40脫鹽柱,Superdex peptide 10/300GL凝膠過濾柱上海通用電氣有限公司;AKTA avant蛋白質純化儀上海通用電氣有限公司;4800Plus MALDI TOF/TOF質譜系統美國AB SCIEX公司;JY-356602型游標卡尺寧波建業工具有限公司;胃蛋白酶(3000 U/mg)上海鼎國生物技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1薛氏丙酸桿菌素發酵條件的研究將丙酸桿菌種子接入SLB培養基中,30 ℃靜置培養,活化48 h后作為種子液接入發酵罐中,接種量5%。10 L發酵罐裝液量為7 L,115 ℃滅菌30分鐘,發酵期間通入CO2使罐壓保持0.05 MPa,轉速為100 r/min,培養溫度30 ℃,連續發酵168 h,每隔24 h取樣測量菌體干重、發酵液pH、還原糖含量和氨基氮含量以及發酵上清液抑菌活性。

1.2.2菌體干重(DCW)測定方法采用陳玉梅等人[8]研究中菌體干重測定方法

1.2.3還原糖和氨基氮含量的測定方法采用3,5-二硝基水楊酸法[11]測定不同發酵時間發酵液中還原糖的殘留量。采用Ueschel等人[12]利用NH4Cl繪制標準曲線的方法測定發酵液中氨基氮含量。

1.2.4指示菌惡臭假單胞菌的制備方法惡臭假單胞菌接種量為0.5%,30 ℃,搖床轉速180 r/min過夜震蕩培養至菌液的OD600 nm為0.2,并用無菌LB溶液稀釋100倍備用。

1.2.5抑菌活性測定方法采用改良過的梯度稀釋法[3,7]測定代謝物的抑菌活性,將抑菌物質用無菌的LB溶液進行2N梯度稀釋,然后將不同稀釋倍數的抑菌物質分別加入96孔酶標板中,每孔總體積為200 μL,其中20 μL為不同稀釋倍數的抑菌物質,180 μL為上述方法中備用的指示菌稀釋液。用20 μL空白LB液體培養基和180μL指示菌菌液作為對照,將酶標板置于30 ℃條件下恒溫培養,每隔一定時間取出用酶標液測定各加樣孔在600 nm處吸光值。當OD600 nm吸光值為對照組吸光值的一半時的稀釋度定義為一個抑菌活性單位,單位為AU/mL。

1.2.6丙酸桿菌素粗提物的制備把500 mL離心后的丙酸桿菌發酵上清液采用旋轉蒸發儀濃縮2.5～10倍,濃縮溫度為75 ℃。濃縮后的發酵液用型號為UFP-3-C-3MA,截留量為3000 u的超濾膜進行超濾,料液流速0.3 L/min,最大壓力差為0.35 MPa,去除較大分子量的蛋白質和雜多肽,得到粗丙酸桿菌素溶液,用于接下來分析研究。

1.2.7丙酸桿菌素的純化方法

1.2.7.1Sephadex G-10脫鹽采用Sephadex G-10脫鹽柱,檢測波長為280 nm。首先用2 mL/min的流速pH5.3,10 mmol/L的HAC-NaAc緩沖液對脫鹽柱平衡兩個柱體積后上樣,上樣期間流速為0.5 mL/min并用相同的緩沖液洗脫,流速為2 mL/min;為保證收集樣品的純度,收集方法為深孔板固定體積收集,每個深孔板中收集體積為1 mL,電導率超過1.5 ms/cm時停止收集樣品(即每次脫鹽收集樣品體積為4 mL),相同緩沖液洗脫至基線平穩后進行新一輪脫鹽操作。

1.2.7.2superdex peptide凝膠過濾采用型號為superdex peptide10/300GL凝膠過濾柱,檢測波長為280 nm,首先用1 mL/min的流速,pH5.3,10 mmol/L的HAC-NaAc緩沖液對柱子平衡3個柱體積后上樣,上樣流速為0.5 mL/min,洗脫流速為1.2 mL/min。AKTA avant產生的原始數據及圖譜由Unicorn 6.3軟件導出。

1.2.8樣品冷凍干燥方法將1.2.7純化后的丙酸桿菌素平鋪在塑料托盤上,厚度為4 mm,-20 ℃預凍過夜,一次升華18 h,二次升華9 h,得到的干粉即為丙酸桿菌素的純化產品,置于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2.9MALDI-TOF法測定丙酸桿菌素的相對分子質量將1.2.8冷凍干燥后的丙酸桿菌素干粉送至上海中科新生命研究所,經 ZipTip C4脫鹽處理后,在正離子模式下選擇反射方法測試樣品分子量。質譜數據及圖譜處理:4800 plus MALDI-TOF/TOF產生的原始數據及圖譜由4000 Series Explorer V3.5軟件導出。

1.2.10丙酸桿菌素酶解實驗方法[7]將1.2.8純化后的丙酸桿菌素配成1%的水溶液,pH調節至2.0,加入胃蛋白使其濃度為1 mg/mL,胃蛋白酶酶活為3000 U/mg;37 ℃恒溫水浴3 h后將胃蛋白酶滅活,冷卻至室溫后將其pH回調至初始值;然后將經不同處理的丙酸桿菌素和空白培養基加入LB平板上直徑為6 mm的小孔中,LB平板上鋪有指示菌惡臭假單胞菌菌液。30 ℃培養12 h后用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。

2　結果與分析

2.1薛氏丙酸桿菌發酵條件的研究

2.1.1丙酸桿菌發酵過程中各項生化指標變化曲線發酵結果如圖1和圖2所示。從圖1可以看出96 h抑菌活性達到最大,為17.69 Au/mL,菌體干重在96 h也達最大值,為3.1 g/L。96 h以后抑菌活性不再增加,故以后的發酵選取96 h下罐比較合適。

圖1　抑菌活性、菌體干重和pH隨發酵時間變化曲線Fig.1　antimicrobial activity、DCW and pH change curve with fermentation time

由圖2可知,還原糖含量在96 h降到最低值1.22 g/L,氨基氮也降至最低0.175 g/L;這與圖1中菌體干重和抑菌活性曲線相一致。表明菌體對碳源、氮源的利用和生物量的增加、抑菌活性的增加相吻合。此后氨基氮又有所增加,可能由于菌體死亡后裂解菌體內部氨態氮釋放至培養基中所致。

圖2　發酵液還原糖和氨基氮變化曲線Fig.2　The curves of reducing sugar and amino nitrogen in the supernate

2.2丙酸桿菌素的分離提取

2.2.1旋轉蒸發濃縮倍數對丙酸桿菌素粗提物抑菌活性的影響賈彩鳳等人[7]研究結果顯示,丙酸桿菌代謝物熱穩定性很好,故采用旋轉蒸發濃縮發酵上清液。該步操作既提高了發酵液丙酸桿菌素的單位含量,又減少了后續純化的工作量。由表1可知,當濃縮倍數大于5倍時抑菌活性得率較低,可能由于濃縮倍數較高時濃縮時間延長,部分抑菌物質活性損失所致。故本研究中5倍為最佳濃縮倍數。

表1　旋轉蒸發濃縮倍數對丙酸桿菌粗提物抑菌活性的影響

2.3丙酸桿菌素的純化

2.3.1Sephadex G-10脫鹽將經1.2.6步驟制備的丙酸桿菌素粗提物用Sephadex G-10脫鹽柱處理,280 nm吸收值和電導率如圖3所示,由圖可知:280 nm處吸收峰和電導峰完全分開。說明選用1.2.7中Sephadex G-10脫鹽方法時該丙酸桿菌素有較好的脫鹽效果。

圖3　Sephadex G-10脫鹽柱層析圖Fig.3　Desalination column chromatographyby Sephadex G-10

2.3.2Superdex peptide 10/300GL凝膠過濾由于Sephadex G-10脫鹽后樣品單位抑菌活性有較大稀釋,同時鑒superdex peptide凝膠過濾上樣量較小,不利于后續純化的進行,故對脫鹽后樣品冷凍干燥。接著用4 mL緩沖液復溶,0.45 μm過濾后上樣。脫鹽后活性得率較低,僅為17.1%,然后用superdex peptide凝膠過濾,280 nm處的吸收峰如圖3所示,樣品抑菌活性測定結果顯示,體積為42～43.2 mL之間吸收峰有抑菌活性,其它吸收峰處均無抑菌活性,故該處為丙酸桿菌素吸收峰(見圖4)。說明選用1.2.7凝膠過濾條件時丙酸桿菌素和雜質有較好的分離效果。

表2　丙酸桿菌素分離與純化各步數據

圖4　Superdex peptide 10/300凝膠過濾圖譜Fig.4　Gel filtration chromatographyby superdex peptide 10/300GL

本實驗經旋轉蒸發濃縮、超濾除雜、Sephadex G-10脫鹽、冷凍干燥和superdex peptide凝膠過濾初步分離純化丙酸桿菌素的各步抑菌活性數據見表2。

由表2可知,發酵上清液經旋轉蒸發、超濾、Sephadex G-10脫鹽、冷凍干燥和Superdex peptide凝膠過濾后,與發酵上清液相比單位抑菌活性提高了6.8倍,活性得率為10.9%。

2.3.3MALDI-TOF/TOF法測定丙酸桿菌素相對分子質量Ayres,J.W.等人的研究結果[13]指出,薛氏丙酸桿菌素的相對分子質量介于300～1200 u之間,本文采用4800 plus MALDI-TOF/TOF測定經上述步驟純化后丙酸桿菌素的相對分子質量,結果如圖5所示,最高峰呈現出質荷比(m/z,z=1)為698.9556的信號,信號強度為95%左右;故純化得到丙酸桿菌素的相對分子質量為698.9556 u。由該圖還可以看出,經過上述步驟制備的丙酸桿菌素還含有極少量雜質,信號強度為10%左右。

圖5　分離純化后丙酸桿菌素MALDI-TOF圖譜Fig.5　Propionibacterium bacteriocinMALDI-TOF map after purification

2.3.4純化后丙酸桿菌素對胃蛋白酶敏感性實驗賈彩鳳和陳玉梅[7-8]等人的研究表明,丙酸桿菌發酵粗提物對胃蛋白酶比較敏感[13]。本文用胃蛋白酶處理純化后丙酸桿菌素,結果如圖6所示,純化后的丙酸桿菌素未經胃蛋白酶處理時抑菌圈直徑最大(圖6中C所示),為23.6 mm;胃蛋白酶處理后丙酸桿菌素抑菌圈明顯減少,為10.2 mm(圖6中B所示)。表明本研究純化得到的丙酸桿菌素仍具有抑菌活性,且對胃蛋白酶非常敏感。

圖6　分離純化后丙酸桿菌素的胃蛋白酶敏感性實驗Fig.6　Pepsin sensitivity experimentsto propionibacteria bacteriocin after purificationA:空白發酵培養基+胃蛋白酶酶解；B:純化后丙酸桿菌素+胃蛋白酶酶解；C:純化后丙酸桿菌素+不添加胃蛋白酶水浴。

3　結論與討論

目前國內對丙酸桿菌發酵的研究主要集中在搖瓶發酵方面,本文采用10 L發酵罐進行放大培養,96 h抑菌活性達到最大值17.69 Au/mL,為丙酸桿菌的工業化提供了參考。

本研究采用旋轉蒸發濃縮、超濾除雜、Sephadex G-10脫鹽、冷凍干燥和Superdex peptide凝膠過濾等技術手段對薛氏丙酸桿菌粗提物進行了初步的分離純化。最終制備得到一種小分子丙酸桿菌素,MALDI-TOF分析可知該丙酸桿菌素相對分子量為698.9556 u;Sephadex G-10、冷凍干燥和Superdex peptide凝膠過濾得到的丙酸桿菌素單位抑菌活性為初始發酵液的6.8倍,最終抑菌活性得率為10.9%。同時胃蛋白酶實驗結果表明:純化后的丙酸桿菌素仍保留抑菌活性,且對胃蛋白酶敏感,說明該丙酸桿菌素很可能是小分子多肽類物質,這也與賈彩鳳等人[7]的研究結果相一致。研究結果表明利用Sephadex G-10脫鹽柱和Superdex peptide制備小分子丙酸桿菌素是可行的,為小分子丙酸桿菌素的分離純化研究提供了理論基礎。

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Propionibacteria Fermentation and Preliminary Explored on Purification of The Bacteriocin

XING Sheng-jie1,JIA Cai-feng1,YANG Xue-xia2,HE Xin-zhou1,LIU Xiao-xia1,GAO Hong-liang1,*,CHANG Zhong-yi1,JIN Ming-fei1

(1.School of Life Science of East China Normal University Shanghai 200241,China;2.Institute of chemical and biological engineering of Donghua University Shanghai 201620,China)

A micromolecule propionibacterium bacteriocin was purified from the supernate of Propionibacterium shermanii,in which the bacteriostatic activity was measured step by step.The study of preliminary purification indicated that the best desalting condition was 5 mL sample application,0.5 mL/min,manual collection,stopped collection when electrical conductivity increased to 1.5 ms/cm. The optimal gel filtration condition of superdex peptide column was 500 μL sample application,0.5 mL/min flow rate,fixed volume collection,each well volume was 200 μL. The antimicrobial activity of propionbacterium bacteriocin improved 6.8 times,but the recovery rate of inbition activity was only 10.9%.The relatively molecular weight of bacteriocin was measured to be 698.9556 u by the MALDI-TOF method.It was indicated that the bacteriocin still remained activity after purification,which was sensitive to pepsin.

propionibacterium;bacteriocin;purification;Propionibacterium shermanii

2015-03-27

邢勝杰(1987-)，男，碩士，研究方向：微生物發酵與食品生物技術，E-mail：18818273307@126.com。

高紅亮(1973-)，男，博士，副教授，研究方向：微生物谷氨酰胺轉氨酶，丙酸桿菌細菌素和大豆多糖的工業化生產及應用等，E-mail：hlgao@bio.ecnu.edu.cn。

質檢公益行業科研專項項目(201310255)。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000