響應面法優化超聲-微波協同輔助提取橄欖多酚工藝研究

項昭保,劉星宇

(重慶郵電大學 生物信息學院,重慶 400065)

?

響應面法優化超聲-微波協同輔助提取橄欖多酚工藝研究

項昭保,劉星宇

(重慶郵電大學 生物信息學院,重慶 400065)

目的:優化超聲-微波協同提取橄欖多酚的工藝條件,為工業化生產中提取橄欖多酚提供參考。方法:在單因素實驗的基礎上,采用響應面法優化超聲-微波協同提取橄欖多酚的提取工藝。結果:橄欖多酚最佳提取工藝為:微波功率為550 W,微波提取時間為4.4 min,超聲功率為 330 W,乙醇濃度為62%,此條件下的橄欖多酚實際得率為6.33%,接近于模型預測值6.35%。結論:該工藝簡便、快速、得率高,為工業化應用提供了精確有效的參考標準,為廣泛開發利用橄欖資源提供了良好的參考價值。

橄欖,多酚,超聲,微波,提取,響應面法

橄欖(Canariumalbum(Lour.)Raeusch.)是橄欖科橄欖屬植物,為衛生部首批公布的藥食兩用物種,有較高的藥用價值,《農書》、《增補本草備要》、《本草綱目》、《日華子本草》等闡明了橄欖具有消酒解毒、清咽生津作用,能治咽喉痛,有開胃、下氣、止瀉等功效。隨著橄欖的廣泛應用,國內外學者從橄欖中分離出了多種酚類物質,并證明了其具有較強的抗氧化[1],抗菌[2],抗炎[3],抗腫瘤[4]和抗乙肝病毒[5]等藥理作用,橄欖多酚成為當前的研究熱點。

超聲波和微波作為現代化提取技術,與傳統溶劑提取法相比,具有提取間短,提取效率高,能耗低等優點,在天然產物有效部位提取中廣泛應用[6-8],但是超聲-微波協同提取的報道較少,但效果更好。如閆海清[9]等運用超聲微波聯用技術提取藍莓總多酚,優化結果表明超聲微波聯用技術較單一超聲提取或微波提取能大大提高多酚得率。對于橄欖多酚的提取研究,羅永會等[10]采用傳統乙醇浸提,最佳工藝需4 h,得率5.75%;曾培源等[11]采用超聲輔助提取橄欖多酚,最佳工藝需提取3次,每次40 min,共2 h,得率2.32%;何志勇等[12]采用微波輔助提取橄欖多酚,最佳工藝僅需15 s,得率1.2%,傳統提取法耗時但得率較高,現代提取法省時但得率較低,為提高現代提取技術橄欖多酚的得率,本文采用橄欖多酚的提取研究中未見報道超聲微波協同提取技術,利用響應面法對橄欖多酚的提取工藝進行優化,為進一步推動橄欖多酚的工業生產和深加工,加大開發利用橄欖資源提供重要基礎資料。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

橄欖采自重慶市江津區石蟆鎮橄欖種植基地,曬干、打粉、過篩、備用;沒食子酸標準品、福林酚試劑國藥集團化學試劑有限公司;乙醇重慶川東化工有限公司;碳酸鈉上海虹光化工廠;均為分析純。

T6新悅型可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;20B型萬能粉碎機江陰市祝塘永昌藥化機械廠;Sartorius LE225D型電子分析天平蘇州賽恩斯儀器有限公司;超聲微波組合反應系統南京先歐儀器制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1建立標準曲線精密稱取沒食子酸50 mg,用蒸餾水溶解,定容至100 mL,制備得0.50 mg/mL的標準液。再精密吸取1.25、2.50、3.75、5.00、6.25、7.50 mL沒食子酸標準液分別定容于25 mL容量瓶內,配成梯度質量濃度分別為 0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mg/mL 的沒食子酸溶液。然后從各稀釋溶液中吸取1.00 mL加入25 mL容量瓶中,先加10 mL蒸餾水,搖勻,再加1.50 mL福林酚試劑,充分搖勻,5 min 后加入6 mL 10% Na2CO3溶液,定容,搖勻,然后在30 ℃避光放置反應60 min,以蒸餾水作參比,在765 nm處測定其吸光值[13]。以吸光值為縱坐標,標準溶液濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

1.2.2橄欖多酚得率的計算精密吸取1 mL多酚提取液,蒸餾水定容至25 mL容量瓶。再采用1.2.1的方法測定其吸光值。重復實驗三次,橄欖樣品中的總多酚含量以沒食子酸標準品計。

多酚得率:Y(%)=ρ×A×V/(1000M)×100

式中,Y為橄欖多酚得率,%;ρ為待測液中多酚濃度,mg/mL;A為稀釋倍數;V提取液總體積,mL;M為稱取的橄欖粉末質量,g。

1.2.3單因素實驗對橄欖多酚提取條件的優化

1.2.3.1超聲波時間對多酚得率的影響稱取1 g橄欖樣品6份,各加入65%乙醇溶液30 mL,分別在150 W超聲波功率下各提取10、20、30、40、50、60 min。提取液按1.2.2法進行多酚得率的計算,重復實驗三次。

1.2.3.2超聲波功率對多酚得率的影響 稱取1 g橄欖樣品6份,各加入65%乙醇溶液30 mL,分別在超聲波功率為75、150、225、300、375、450 W條件下提取40 min。提取液按1.2.2法進行多酚得率的計算,重復實驗三次。

1.2.3.3微波功率對多酚得率的影響稱取1 g橄欖樣品6份,各加入65%乙醇溶液30 mL,超聲波功率300 W提取40 min,分別在微波功率為350、400、450、500、550、600 W條件下協同提取1 min,提取液按1.2.2法進行多酚得率的計算,重復實驗三次。

1.2.3.4微波時間對多酚得率的影響稱取1 g橄欖樣品6份,各加入65%乙醇溶液30 mL,超聲波功率300 W提取40 min,分別在微波功率為500 W條件下協同提取1、2、3、4、5、6 min,提取液按1.2.2法進行多酚得率的計算,重復實驗三次。

1.2.3.5乙醇濃度對多酚得率的影響稱取1 g橄欖樣品6份,分別加入45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液30 mL,超聲波功率300 W提取40 min,微波功率500 W條件下協同提取4 min,提取液按1.2.2法進行多酚得率的計算,重復實驗三次。

1.2.3.6液固比對多酚得率的影響稱取1 g橄欖樣品6份,分別加入65%乙醇溶液10、15、20、25、30、35 mL,超聲波功率300 W提取40 min,微波功率500 W條件下協同提取4 min,提取液按1.2.2法進行多酚得率的計算,重復實驗三次。

1.2.4響應面法優化橄欖多酚的提取工藝在單因素實驗的基礎上,進行四因素三水平的Box-Behnken的中心組合設計,見表1,采用響應面法分析所選4個因子對響應值(橄欖多酚得率)的影響,同時優化橄欖多酚的提取工藝。每組實驗重復三次。

表1　Box-Behnken的中心組合因素水平表

1.2.5統計分析單因素實驗數據使用SPSS 19.0 軟件進行顯著性分析。響應面實驗數據采用Design expert 8.0.6 進行數據處理。

2　結果與討論

2.1標準曲線

據步驟1.2.1得回歸方程:A=6.1977C+0.0592,R2=0.9987,表明在 0.025～0.150 mg/mL濃度范圍內,沒食子酸濃度C與吸光度A之間有著很好的線性相關性,如圖1所示。

圖1　沒食子酸標準曲線Fig.1　Standard curve of gallic acid

2.2單因素實驗結果

2.2.1超聲波提取時間對多酚得率的影響由圖2可知,在40 min內,隨著超聲波提取時間的增長,多酚得率逐漸增大,當提取時間延長到40 min后,多酚得率開始略有下降,但經顯著性分析,無明顯差異,與曾培源等[11]采用超聲輔助提取橄欖多酚的單次提取時間40 min相同,因此在隨后的實驗中選擇的超聲波提取時間為40 min,且不作為響應面考察條件。

圖2　超聲波提取時間對橄欖多酚得率的影響Fig.2　Effect of ultrasonic extraction time on the yield of polyphenols注:圖中不同字母表明差異性顯著(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異(p>0.05),下同。

2.2.2超聲波功率對多酚得率的影響由圖3可知,隨著超聲波功率的增大,多酚得率逐漸增大,但是當超聲波功率超過300 W以后,多酚得率開始明顯下降。可能是由于大功率的超聲波導致某些多酚物質結構被破壞,從而得率下降,這與王涓等[14]報道一致,故根據實驗結果,選取超聲波功率225、300、375 W作為響應面考察條件。

圖3　超聲波功率對橄欖多酚得率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic power on the yield of polyphenols

2.2.3微波功率對多酚得率的影響由圖4可知,在500 W的微波功率內,隨著功率的增大多酚得率逐漸增大,當微波功率為500 W時,多酚得率達到最大值。隨后呈逐漸下降的趨勢。可能是因為較大的微波功率使得多酚物質結構被破壞,從而導致得率下降,這與閆海清等[9]報道一致。故根據實驗結果,選取微波功率450、500、550 W作為響應面考察條件。

2.2.4微波提取時間對多酚得率的影響由圖5知,隨著微波提取時間的增大,多酚的得率也隨之增大,但是當提取時間大于4 min后,其得率開始呈現下降的趨勢,可能是由于長時間的微波輻射,導致提取溫度增大,某些多酚類物質被降解,從而導致多酚得率下降,這與閆海清等[9]報道一致。因此根據實驗結果,選取微波提取時間3、4、5 min作為響應面考察條件。

圖5　微波提取時間對橄欖多酚得率的影響Fig.5　Effect of microwave extraction time on the yield of polyphenols

2.2.5乙醇濃度對橄欖多酚得率的影響由圖6知,乙醇濃度在45%～65%的范圍內,隨著濃度的增加,多酚得率也隨之增大,但是65%的濃度范圍以后,得率開始逐漸減少,原因可能是過高的乙醇濃度不能強有力地破壞橄欖中多酚類物質與蛋白質或其他物質的連接,使得多酚得率降低;但過低的乙醇濃度,會使糖類等水溶性雜質的浸出率提高,多酚的得率也會降低,這與饒瑜等[15]報道一致。所以根據實驗結果,選取乙醇濃度55%、65%、75%三個水平作為響應面考察條件。

圖6　乙醇濃度對橄欖多酚得率的影響Fig.6　Effect of the concentration of ethanol on the yield of polyphenols

2.2.6液固比對橄欖多酚得率的影響由圖7知,液固比在10∶1～25∶1(mL/g)范圍內,橄欖多酚得率隨液固比的增加顯著提高,當液固比超過25∶1(mL/g)時,多酚得率基本沒有顯著變化,其原因可能是在料液比為25∶1(mL/g)時,溶劑對多酚類物質溶解已達到平衡,增加溶劑量對增加多酚的得率幾乎無影響,這與曾培源等[11]報道一致。故實驗中選擇的料液比為25∶1(mL/g),并且不作為響應面考察條件。

圖7　液固比對橄欖多酚得率的影響Fig.7　Effect of ratio of liquid to solid on the yield of polyphenols

2.3響應面法優化橄欖多酚的提取工藝

在單因素實驗的基礎上,采用Box-Behnken中心組合進行四因素三水平的實驗設計。以微波功率、微波提取時間、超聲波功率和乙醇濃度為自變量,以橄欖多酚得率Y為響應值。實驗設計及結果如表2。

表2　響應面分析方案及實驗結果

表2中,1～24為析因實驗,25～29為中心實驗,29個實驗點分為析因點和零點,其中析因點為因素A、B、C和D所構成的多維空間頂點,零點為區域的中心點,中心點實驗進行5次,用以估計實驗誤差。根據表2的實驗方案進行實驗后,通過design expert 8.0.6軟件對數據進行二次回歸擬合,獲得橄欖多酚得率對編碼自變量微波功率、微波時間、超聲功率和乙醇濃度的二次多項回歸。根據實驗結果建立的數學模型為:

Y=6.24+0.20A+0.23B+0.093C-0.41D-0.069AB-0.071AC-0.054AD-0.19BC-0.31BD-0.39CD-0.36A2-0.55B2-0.57C2-0.71D2

模型的可靠性可通過方差分析和相關系數來考察。當P(Pr>F)值小于0.01時影響為高度顯著,P(Pr>F)值小于0.05影響顯著。由表3的回歸分析結果可知,模型的P(Pr>F)值<0.0001,說明回歸方程具有高度的顯著性。此外,R2=92.05%,表明響應值橄欖多酚得率實際值與預測值之間具有較好的擬合度,該實驗方案是可行的。一次項B和D對Y值的影響高度顯著(p<0.01),A對Y值也有顯著影響(p<0.05),交互項CD影響極顯著(p<0.01),BD也有顯著影響(p<0.05),二次項A2,B2,C2,D2對Y值也有極顯著的影響(p<0.01)。響應曲面圖可以形象地描述各因素之間的相互作用,如圖8～圖13所示。

圖8　微波時間和微波功率對多酚得率的交互影響Fig.8　Effect of microwave extraction timeand microwave power on the yield of polyphenols

圖9　超聲功率和微波功率對多酚得率的交互影響Fig.9　Effect of ultrasonic power and microwave power on the yield of polyphenols

表3　回歸分析結果

圖10　乙醇濃度和微波功率對多酚得率的交互影響Fig.10　Effect of the concentration of ethanoland microwave power on the yield

圖11　超聲功率和微波時間對多酚得率的交互影響Fig.11　Effect of ultrasonic power and microwave extraction time on the yield of polyphenols

圖12　乙醇濃度和微波時間對多酚得率的交互影響Fig.12　Effect of the concentration of ethanoland microwave extraction time on the yield

圖13　乙醇濃度和超聲功率對多酚得率的交互影響Fig.13　Effect of the concentration of ethanoland ultrasonic power on the yield

注:**:差異高度顯著(p<0.01);*:差異顯著(p<0.05)。

當響應曲面坡度比較平滑,說明響應值受各個變量變化的影響較小,相反,當響應曲面坡度較陡峭,則說明響應值受變量交互作用較為明顯。通過比較圖8～圖13,考察微波功率、微波時間、超聲波功率和乙醇濃度四個因素兩兩之間交互作用對橄欖多酚提取的影響,可知乙醇濃度和微波時間以及乙醇濃度和超聲功率之間存在明顯的交互作用,這與響應面曲線的分析結果相一致。

2.4橄欖多酚最佳提取條件的確定及實驗驗證

通過design expert 8.0.6軟件對響應面優化工藝結果分析得到最佳提取工藝為:微波功率為550 W,微波時間為4.4 min,超聲功率為329.98 W,乙醇濃度為61.85%,此條件下模型給出的橄欖多酚得率預測值為6.35%。為驗證響應面法所得預測值的可靠性,采用上述實驗條件進行橄欖多酚提取的工藝驗證,考慮到實驗中實際操作的方便,將上訴工藝條件修正為超聲波時間40 min、液料比25∶1(mL/g)、微波功率550 W、微波時間4.4 min、超聲功率330 W、乙醇濃度62%。在上述條件下進行平行實驗三次,得到橄欖多酚得率的平均值為6.33%。此工藝參數下的結果與預測值非常接近,證明了響應面法優化橄欖多酚提取工藝參數的準確性和有效性,說明所建模型擬合良好且可靠。

3　結論

本實驗是在六個單因素實驗結果的基礎上,選取四個對橄欖多酚得率影響較大的四個因素(微波功率、微波時間、超聲功率和乙醇濃度)進行四因素三水平的響應面優化。從而得到了橄欖多酚的最佳提取工藝參數:超聲波時間40 min、液料比25∶1(mL/g)、微波功率550 W、微波時間4.4 min、超聲功率330 W、乙醇濃度62%,在此條件下,橄欖多酚的得率可達6.33%,與預測值6.35%基本一致,說明響應面法得到橄欖多酚超聲微波提取工藝的條件真實可靠。充分利用超聲微波協同提取技術和響應面分析,得到的工藝簡單、快速、得率高,很好地兼顧了橄欖多酚提取的省時和高得率。

[1]張亮亮,楊志偉,林益明. 橄欖多酚抗氧化活性研究[J].食品工業科技,2008,29(4):57-59.

[2]項昭保,何從林,任紹光,等. 野生橄欖黃酮抑菌效應及其在牛奶保鮮中的應用研究[J]. 食品工業科技,2004,25(10):69-70.

[3]耿成燕,宮德正,姜麗平,等. 橄欖葉提取物對大鼠急性炎癥和痛覺過敏的研究[J].天然產物研究與開發,2011,23(5):931-934.

[4]Duan WJ,Tan SY,Chen J,et al. Isolation of anti-HIV components from Canarium album fruits by high-speed counter-current chromatography[J]. Analytical Letters,2013,46:1057-1068.

[5]Xiang ZB,Mo HQ,Qu ZT,et al. Ellagic Acid from the Dried Fruits of Canarium album with Anti-hepatitis B Activity[J]. Asian Journal of Chemistry,2011,23(8):3759-3760.

[6]Hossain MB,Brunton NP,Patras A,et al. Optimization of ultrasound assisted extraction of antioxidant compounds from marjoram(Origanum majorana L.)using response surface methodology[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2012,19:582-590.

[7]Wang XS,Wu YF,Chen GY,et al. Optimisation of ultrasound assisted extraction of phenolic compounds from Sparganii rhizoma with response surface methodology[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2013,20:846-854.

[8]Teng H,Lee WY. Optimization of Microwave-assisted Extraction of Polyphenols from Mulberry Fruits(Morus alba L.)Using Response Surface Methodology[J]. Journal of Korean Society for Applied Biological Chemistry,2013,56:317-324.

[9]閻海青,陳相艷,程安瑋,等.超聲微波聯用技術提取藍莓多酚的工藝優化[J]. 中國食品添加劑,2014,1:88-94.

[10]羅永會,張翠香,徐春萍,等. 正交實驗優選大理野生橄欖總多酚的提取工藝[J]. 食品科技,2013,38(11):226-229.

[11]曾培源,朱賁峰. 超聲提取橄欖多酚工藝條件的優化[J].海峽藥學,2014,26(3):17-19.

[12]He ZY,Xia WS. Microwave-assisted extraction of phenolics from Canarium album L. and identification of the main phenolic compound[J]. Natural Product Research,2011,25(2):85-92.

[13]向麗,周鐵軍,王光西. 分光光度法測定青果多酚的含量[J]. 湖北農業科學,2012,51(6):1242-1244.

[14]王涓,潘忠禮,馬海樂,等.超聲波的空化作用及其對多酚穩定性的影響[J]. 食品工業科技,2014,35(19):388-391.

[15]饒瑜,焦士蓉,龔麗,等. 廣元地區油橄欖葉多酚提取條件及其抗氧化活性研究[J]. 西華大學學報(自然科學版),2013,32(5):96-99.

Optimization of ultrasonic-microwave synergistic extraction of polyphenol fromCanariumalbumby response surface methodology

XIANG Zhao-bao,LIU Xing-yu

(College of Bio-Information,Chongqing University of Posts and Telecommunications,Chongqing 400065,China)

Objective:The technology for ultrasonic-microwave synergistic extracting polyphenols fromCanariumalbumwas optimized,which can provide certain references for actual production. Methods:On the basis of single factor experiments,the optimum conditions for the extraction of polyphenol was obtained by response surface methodology. Results:The optimum conditions of extracting polyphenol fromCanariumalbumwere as follows:microwave power 550 W,microwave extraction time 4.4 min,ultrasonic power 330 W,ethanol concentration 62%. Under these conditions,the polyphenol yield was 6.33%,which was close to the model predictive value of 6.35%. Conclusion:the optimum process was simple and rapid,which had good yield. Furthermore,this study offered not only an accurate and effective reference standard for industrial applications,but also a good reference value for widely exploitation and utilization ofCanariumalbumresource.

Canariumalbum;polyphenols;ultrasonic;microwave;extraction;response surface methodology

2015-01-23

項昭保(1977-)，男，教授，主要從事天然產物成分研究工作,E-mail:xiangzb@126.com。

重慶市基礎與前沿研究計劃一般項目(CSTC2014jcyjA10099);重慶郵電大學大學生科研訓練項目(A2014-49)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000