響應面分析法優化超臨界CO2萃取藍莓花色苷工藝條件的研究

田密霞,李亞東,胡文忠,王艷穎,姜愛麗,劉程惠

(1.吉林農業大學園藝學院,吉林長春 130118;2.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600)

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響應面分析法優化超臨界CO2萃取藍莓花色苷工藝條件的研究

田密霞1,2,李亞東1,*,胡文忠2,王艷穎2,姜愛麗2,劉程惠2

(1.吉林農業大學園藝學院,吉林長春 130118;2.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600)

以藍莓為原料,利用響應面法優化超臨界CO2萃取藍莓花色苷的工藝。在單因素實驗基礎上,以萃取壓力、萃取溫度、萃取時間和液料比為影響因素,應用Box-Behnken方法進行四因素三水平實驗,以花色苷含量為響應值,進行響應面分析。確定萃取的最佳工藝條件是萃取時間60 min,萃取溫度40 ℃,萃取壓力28 MPa,液料比為7∶1(mL∶g),花色苷含量的預測值為1.59 mg/g,驗證值為1.58 mg/g。結果表明利用響應面分析方法對超臨界CO2萃取藍莓花色苷的工藝條件進行優化,可獲得最優的工藝參數,從而為進一步的研究提供依據。

藍莓,花色苷,超臨界二氧化碳萃取,響應面法

藍莓是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)多年生落葉或常綠灌木漿果類果樹,因其果實中含有獨特的功效物質,以及含有豐富的蛋白質、碳水化合物、維生素、礦物質、超氧化物歧化酶等,被國際糧農組織列為人類五大健康食品之一[1-2]。藍莓中最重要的物質就是花色苷,許多研究表明,藍莓花色苷有良好的保健功能,對于癌癥[3-5]、肝臟損傷[6-7]、高血壓[8]、糖尿病[9-10]、動脈硬化[11-13]、記憶力減退[14-15]、視網膜剝離[10]、骨質疏松[16-17]等疾病,均有較好療效。

花青素性質很不穩定,為提取及保存帶來了一定的困難。目前主要提取方法為溶劑法[18-21],超聲波提取法[22-23]和酶解提取法[24],國內外尚未有超臨界CO2流體萃取法萃取藍莓花色苷的報道。此法可避免萃取物在高溫下分解,保護生理活性物質的活性及保護萃取物的天然風味。本文采用Box-Behnken響應面曲線設計法對超臨界CO2萃取關鍵影響因素進行優化,建立超臨界CO2萃取藍莓花色苷的數學模型,為藍莓的產品開發開辟新的途徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

采摘自吉林農業大學果園內新鮮、成熟度一致、無病蟲害的藍莓果實,冷凍保藏溫度在-40 ℃冰柜中備用。無水乙醇、正己烷、鹽酸(均為分析純)國藥集團。

Labda-250型紫外可見分光光度計美國PE;電子天平上海梅特勒-托利多;pHS-25 型酸度計上海偉業儀器廠;202-2A型電熱恒溫干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司;SHB-Ⅲ型循環水多用真空泵鞏義市英峪予華儀器廠;PC/PLC箱式冷凍干燥儀(MILLROCK TECHNOLOGY);7071型超臨界CO2流體萃取儀美國ASI公司;11B S25型食品粉碎機IKA;LC20AB液相色譜儀日本島津。

1.2實驗方法

1.2.1超臨界CO2萃取藍莓花色苷工藝流程藍莓凍果打漿→(稱取一定質量的藍莓凍果,充分打漿)→冷凍干燥(藍莓漿冷凍干燥,干燥后的粉末過80目篩,得到實驗用的藍莓粉)→樣品裝釜(準確稱取2 g藍莓粉,加80%乙醇,密閉)→超臨界萃取(控制合適的溫度、壓力等實驗條件在超臨界狀態下萃取)→分離(萃取完成后,由分離釜獲得花色苷)[25]

1.2.2總花色苷含量的測定色譜柱:Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm,2.5μm),流動相:50% A:0.5%冰乙酸,50%;B:100%甲醇,流速0.8 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量20 μL,檢測波長520 nm,檢測時間30 min。方法參照文獻[26]。

1.2.3單因素實驗在固定分離溫度為35 ℃,分離壓力為5 MPa,CO2流量為20 kg/h,夾帶劑乙醇濃度為80%的基礎上,選擇萃取壓力(24～34 MPa)、萃取時間(20～120 min)、液料比[4∶1～8∶1(mL∶g)]和萃取溫度(25～50 ℃)4個關鍵因素進行單因素實驗,以考察各關鍵因素對藍莓花色苷含量的影響,每次取冷凍干燥后藍莓樣品2 g,確定較優萃取范圍。

1.2.3.1萃取壓力的影響稱取2 g藍莓粉,在萃取時間60 min、萃取溫度40 ℃、液料比7∶1(mL∶g)的條件下,分別在24、26、28、30、32和34 MPa下萃取,然后按照1.2.2測花色苷含量。

1.2.3.2萃取時間的影響稱取2 g藍莓粉,在萃取溫度40 ℃、萃取壓力為30 MPa、液料比7∶1(mL∶g)的條件下,分別在20、40、60、80、100和120 min下萃取,然后按照1.2.2測花色苷含量。

1.2.3.3萃取液料比的影響稱取2 g藍莓粉,在萃取時間60 min、萃取溫度40 ℃、萃取壓力為30 MPa的條件下,液料比分別為4∶1、5∶1、6∶1、7∶1和8∶1(mL∶g)下萃取,然后按照1.2.2測花色苷含量。

1.2.3.4萃取溫度的影響稱取2 g藍莓粉,在萃取時間60 min、萃取壓力為30 MPa、液料比7∶1(mL∶g)的條件下,分別在25、30、35、40、45和50 ℃下萃取,然后按照1.2.2測花色苷含量。

1.2.4響應面曲線法優化實驗根據Box-Behnken實驗設計原理,以上述4個關鍵因素為自變量,以花色苷含量為響應值,設計4因素3水平的響應面實驗[27]。

2　結果與討論

2.1單因素實驗結果

2.1.1萃取壓力的影響由圖1可知,花色苷含量隨壓力的增加先增加后下降。萃取釜中穩定的高壓可以破壞物料的細胞結構,提高滲透效果,使浸提更加充分,因此適當的壓力可以提高花色苷含量,但當壓力過大時,可能會破壞花色苷的結構使其降解[28]。所以在中心組合實驗中選擇26、28、30 MPa作為三個水平參數。

表1　響應面分析因素與水平

圖1　不同萃取壓力對萃取效果的影響Fig.1　Effect of extraction pressure on blueberry anthocyanins content

2.1.2萃取時間的影響由圖2可知,花色苷含量隨著提取時間的增加,呈現先增加后下降的趨勢,當時間為60 min時,吸光值達到最大值。這說明時間對花色苷的提取有顯著的影響,時間過短,提取不充分,時間過長,可能會導致花色苷的降解,而且時間長的話實驗周期長。從節約能源的角度出發,中心組合實驗中選擇20、40、60 min作為提取的三個水平參數。

圖2　不同萃取時間對萃取效果的影響Fig.2　Effect of extraction time on blueberry anthocyanins content

2.1.3液料比的影響由圖3可知,吸光值隨著料液比的增加而增加,當液料比為7∶1(mL∶g)時,吸光值達到最大。當液料比大于7∶1(mL∶g)時,物料太稀,萃取過程中會從萃取釜中泄露,而且裝料困難。從實際操作和成本來考慮,料液比在7∶1(mL∶g)為宜。所以在中心組合實驗中選擇6∶1、7∶1和8∶1(mL∶g)為三個水平參數。

圖3　不同液料比對萃取效果的影響Fig.3　Effect of extraction liquid materials ratio on blueberry anthocyanins content

2.1.4萃取溫度的影響由圖4可知,隨溫度的增加,吸光值先增加后下降,原因可能是隨著溫度的升高加劇了分子間的熱運動,花色苷擴散到溶劑中的速度加快。但高溫會降低CO2流體的密度,使其溶解度降低,而且高溫可能會影響花色苷的結構和活性,使之降解[28],所以從實際情況出發,在中心組合實驗中選擇35、40、45 ℃作為提取的三個水平參數。

圖4　不同萃取溫度對萃取效果的影響Fig.4　Effects of extraction temperature on blueberry anthocyanins content

2.2響應面曲線實驗結果

利用Design-Expert軟件,對實驗數據進行多元回歸擬合,回歸模型系數及顯著性檢驗結果見表3,得到響應面方程為:

花色苷含量=1.57-0.028A+0.031B-0.012C+0.014D-0.032AB+0.011AC-3.750×10-3AD-0.046BC+0.037BD-0.046CD-0.085A2-0.041B2-0.066C2-0.082D2

從表3可以看出,模型的p<0.0001,說明該回歸模型極顯著,擬合性好,用該模型來分析各因素對花色苷含量的影響是有意義的。A,B,C,D,AB,BC,BD,CD,A2,B2,C2,D2各項p值均小于0.001說明極為顯著,AD的p值大于0.05,為不顯著。失擬項反映的是實驗數據與模型不相符情況,p=0.5310>0.05,說明失擬項不顯著,未知因素對實驗結果干擾很小。因此,該二次方程能夠較好地擬合真實的響應面。此外,校正系數Adj R-Squared2=0.9898,自變量與響應值之間線性關系好,說明方程可靠性較高。以上數據說明該回歸方程擬合程度較好,可以用此模型來分析和預測藍莓花色苷最佳提取工藝條件。

每個響應面對其中兩個因素進行分析,另外兩個因素固定在零水平。從中可以直觀地反映各因素對響應值的影響,從實驗所得的響應面分析圖上可以找到它們在提取過程中的相互作用[22]。

表2　Box-Behnken實驗設計及結果

由圖5可以看出萃取時間對花色苷吸光值的影響最為顯著,其次是萃取溫度和萃取壓力,其表現為曲線相對較陡,影響最小的是液料比,表現為曲線較為平滑。萃取壓力和萃取溫度之間交互作用不顯著,萃取壓力和液料比之間、萃取壓力和萃取時間、萃取時間和液料比、萃取時間和萃取溫度、液料比和萃取溫度之間交互作用較顯著。

表3　回歸方程方差分析表

圖5　兩因素交互作用對藍莓花色苷的交互影響Fig.5　Response surface plot showing the interactive effects of two factors on blueberry anthocyanins content

注:***為極顯著(p<0.001),**為非常顯著(p<0.01),*為顯著(p<0.05)。

2.3最佳條件的驗證實驗

由實驗模型計算出的最優參數為:萃取時間60 min,萃取溫度40.01 ℃,萃取壓力28 MPa,液料比為7∶1(mL∶g)。為了檢驗響應面分析結果與實際實驗情況是否一致,根據上述實驗結果進行驗證實驗。在萃取時間60 min,萃取溫度40 ℃,萃取壓力28 MPa,液料比為7∶1(mL∶g)的條件下萃取藍莓花色苷,進行3次平行實驗,得到藍莓花色苷含量約為1.58 mg/g,這與理論預測值1.59 mg/g相近,而且重復性好,說明優化結果可靠。

3　結論

利用響應面優化得到的藍莓花色苷萃取工藝的最佳條件為萃取時間60 min,萃取溫度40 ℃,萃取壓力28 MPa,液料比為7∶1(mL∶g)。此最佳條件下的花色苷含量理論值1.59 mg/g,實際測得值為1.58 mg/g,優化得到的預測結果與實驗結果吻合較好。

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Optimization of supercritical CO2extraction of Blueberry Anthocyanins using response surface methodology

TIAN Mi-xia1,2,LI Ya-dong1,*,HU Wen-zhong2,WANG Yan-ying2,JIANG Ai-li2,LIU Cheng-hui2

(1.Horticultural College,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;2. College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China)

The present study aimed to optimize supercritical carbon dioxide extraction of anthocyanins from blueberry using response surface methodology based on a 4-variable,3-level Box-Benhnken design. The results showed that the optimum conditions were extraction pressure of 28 MPa,extraction temperature of 40 ℃,extraction time of 60 min and liquid materials ratio of 7∶1(mL∶g). Under these conditions,the model predicted and experimental values of anthocyanins content were 1.59 mg/g and 1.58 mg/g,respectively.

Blueberry;Anthocyanins;Supercritical CO2extraction;response surface methodology

2015-05-15

田密霞(1979Q)，女，博士研究生，工程師，研究方向：果蔬保鮮加工及其功能性成分研究， E-mail：tmx@dlnu.edu.cn。

李亞東(1964-)，男，碩士，教授，研究方向：小漿果種質資源及栽培生理，E-mail:bluberryli@163.com。

農業部2011公益性行業(農業)科研專項小漿果產業技術研究與試驗示范(201103037)；大果藍莓與抗寒唐棣新品種選育及配套栽培技術研究, 吉林省財政廳項目(2012004)；藍莓優質高效組培微繁育苗技術推廣，吉林省科技廳發展計劃項目(20110828)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000