響應面法優化雞胸肉肌原纖維蛋白酶法水解工藝條件

白騰輝,馬亞萍,康壯麗,潘潤淑,馬漢軍

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

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響應面法優化雞胸肉肌原纖維蛋白酶法水解工藝條件

白騰輝,馬亞萍,康壯麗,潘潤淑,馬漢軍*

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

以雞胸肉為原料,提取肌原纖維蛋白,測定其蛋白質濃度及氨基酸組成;以水解度為測定指標,利用響應面法優化該肌原纖維蛋白酶解工藝條件,并考察其產物肽分子量分布。結果表明:提取的肌原纖維蛋白濃度為59.27%;該蛋白氨基酸種類齊全,組成比例均衡,必需氨基酸含量高達40.90%;堿性蛋白酶是肌原纖維蛋白酶解的最佳用酶;在單因素實驗基礎上,經Box-Behnken實驗優化得到堿性蛋白酶水解肌原纖維蛋白最佳工藝條件為:加酶量3500 U/g、pH7.8、溫度44 ℃,此條件下經6 h酶解,水解度達33.17%;肽分子量分布分析知,最佳水解條件下酶解液中<1000 Da的小肽含量高達61.5%,說明堿性蛋白酶能較高程度的水解肌原纖維蛋白。

肌原纖維蛋白,酶解,響應面法,蛋白質提取率,水解度

雞肉是增長速度快、供應足、物美價廉的優質肉類,以肉質柔軟、高蛋白、低脂肪、低膽固醇和低熱量等著稱,且肉性偏溫,有補氣、調髓補精等功效,是理想的動物性蛋白來源[1]。據美國農業部統計,2013年中國雞肉產量約1400萬t,已成為世界第二大雞肉生產、消費和貿易國家[2]。然而,中國用于深加工的雞肉量還不足總量的6%,且存在著產品種類較少、科技含量低、附加值低等不足,缺乏行業抗風險能力及在國際市場上的競爭力[3],因此發展雞肉的精深加工迫在眉睫。最新研究表明,雞肉蛋白經酶法水解,是改善雞肉消化吸收率和綜合利用效率的有效途徑之一。如Rojas等研究發現蛋白質經酶解后的消化吸收率顯著提高[4],Saiga等從雞胸肉酶解產物中分離出降血壓肽[5],Seth等報道了雞肉酶解物促鐵吸收功效和機理研究[6],國內劉改英等采用響應面法優化了復合蛋白酶水解雞肉蛋白的工藝[7],趙謀明等系統研究了以雞肉蛋白酶解物通過Maillard反應制備風味香精的方法[8-10]。

有研究表明,從肌肉中提取出蛋白質再水解,可更好的獲取酶解產物中的功能性成分[11-12];而Mohr等也發現魚肉中大部分水溶性蛋白熱變性后不利于被酶作用轉化成可溶性氮[13]。所以,從雞肉中提取出肌原纖維蛋白,再經蛋白酶解水解是提高酶解效率的有效途徑。然而,目前國內外在蛋白酶解方面研究多采用單一酶對雞肉或雞肉蛋白進行水解。有鑒于此,本實驗以雞胸肉為原料提取肌原纖維蛋白,分析了該蛋白的氨基酸組成,篩選了其水解最佳用酶,通過單因素和響應面實驗對最優酶酶解肌原纖維蛋白酶解的工藝條件進行優化,并以酶解液肽分子量分布評估其酶解效果,以期為雞肉蛋白酶解的機理研究及酶解產物生物活性肽的制備提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

雞胸肉當地超市;胰蛋白酶酶活力250 U/mg,aladdin,上海晶純生化科技股份有限公司;胃蛋白酶酶活力15000 U/mg,aladdin,上海晶純生化科技股份有限公司;木瓜蛋白酶酶活力≥3 U/mg,aladdin,上海晶純生化科技股份有限公司;堿性蛋白酶酶活力≥200 U/mg,Solarbio,北京索萊寶科技有限公司;中性蛋白酶酶活力≥60 U/mg Solarbio,北京索萊寶科技有限公司;甲醛、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸鹽等,實驗中所用化學試劑均為分析純。

FA224型電子天平上海舜宇恒平科學儀器有限公司;79-1磁力加熱攪拌器江蘇正基儀器有限公司;SHA-C數顯水浴恒溫振蕩器江蘇省金壇市華峰儀器有限公司;電子萬用爐北京光明醫療儀器廠;PHS-3C型精密pH計上海雷磁儀器廠;Waters 600高效液相色譜儀 USA;KjeltecTM8400全自動凱氏定氮儀,FOSS Denmark;MULTIFUGE XIR型冷凍離心機,Thermo German等。

1.2實驗方法

1.2.1肌原纖維蛋白的提取參照Wonnop Visessanguan等[14]的方法:取雞胸肉20 g,加入10倍體積磷酸酸鹽緩沖液A(15.6 mmol/L Na2HPO4,3.5 mmol/L KH2PO4,pH7.5),組織搗碎機10000 r/min下均質1 min,勻漿在冷凍離心機中離心(5000 r/min,15 min),此提取過程重復操作二次。取上清液部分,加入50% TCA使上清液最終TCA濃度達到10%,離心機中5000 r/min離心15 min,上清液部分為非蛋白氮,沉淀部分為肌漿蛋白。在沉淀部分加入10倍體積磷酸酸鹽緩沖液B(0.45 mol/L KCl,15.6 mmol/L Na2HPO4,3.5 mmol/L KH2PO4,pH7.5)于組織搗碎機中10000 r/min下均質1 min,勻漿在離心機中離心(5000 r/min,15 min),此提取過程重復操作二次,合并上清液得鹽溶部分,即肌原纖維蛋白。并用微量凱氏定氮法[15]測定提取出的肌原纖維蛋白濃度。

1.2.2肌原纖維蛋白氨基酸組成分析將樣品置于水解管中,加入6 mol/L 的HCl溶液,真空封口,在110 ℃下水解24 h,冷卻后定容、過濾、蒸干,再加入0.02 mol/L的HCl溶液在空氣中放置30 min,采用HPLC測定除色氨酸以外的氨基酸含量,檢測條件:美國Waters高效液相色譜,PICO.TAG氨基酸分析柱,柱溫38 ℃,流速1 mL/min,檢測波長254 nm。

1.2.3酶解工藝流程稱取肌原纖維蛋白1 g→溶于50 mL磷酸鹽緩沖液B(詳見1.2.1)→調pH→加定量酶→恒溫水浴震蕩酶解→沸水浴滅酶10 min→冷卻至室溫→6000 r/min 4 ℃離心20 min→取上清液→測定各指標。

操作要點:

定量酶的加入:依據實驗設計,以“酶量/底物蛋白”,即“U/g”的形式,并參考生產商推薦的各酶酶活力來加入定量的水解酶。

恒溫水浴震蕩酶解:酶解開始前將加入的酶均勻混入酶解反應體系。

1.2.4水解酶的選擇分別采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶及中性蛋白酶對提取的肌原纖維蛋白按照1.2.3的步驟進行水解,各酶作用條件根據廠家推薦參數(見表1)。通過水解度、蛋白質提取率、水解液風味及外觀來確定肌原纖維蛋白酶解的較佳用酶。

表1　各酶較適宜的水解條件[16]

1.2.5單因素實驗

1.2.5.1加酶量對酶解效率的影響取1.2.4中肌原纖維蛋白酶解的較佳用酶,在2%的肌原纖維蛋白液中加入1000、2000、3000、4000、5000 U/g的蛋白酶,對酶解液的水解度和蛋白質提取率進行分析,酶解體系的pH8.5、酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h。

1.2.5.2pH對酶解效率的影響以1.2.5.1中優化的最佳酶濃度,調節反應體系的pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,分析各組酶解液的水解度和蛋白質提取率,酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h。

1.2.5.3酶解溫度對酶解效率的影響以1.2.5.1中優化的最佳酶濃度,并按1.2.5.2優化的最佳pH調節反應體的pH,分別在35、40、45、50、55 ℃的環境下對各反應組進行4 h的水解,分析不同酶解溫度對各組酶解液的水解度和蛋白質提取率。

1.2.5.4酶解時間對酶解效率的影響在1.2.5.1、1.2.5.2與1.2.5.3優化的最佳酶解條件下,對酶解體系進行2、4、6、8、10 h水解,以酶解液的水解度和蛋白質提取率為測定指標,確定較佳酶解時間。

1.2.6響應面實驗設計在單因素實驗的基礎上,根據Box-Behnken設計原理,以肌原纖維蛋白酶解過程中的水解度為響應值,選取加酶量、pH及溫度為影響因子,進行3因素3水平響應面實驗,確定肌原纖維蛋白酶解的最佳工藝參數。實驗因素水平表見表2。

表2　響應面實驗因素水平編碼表

1.2.7肌原纖維蛋白的水解度測定采用甲醛滴定法[17],取離心后的肌原纖維蛋白酶解液5 mL于100 mL容量瓶中,定容、混勻后取20 mL于200 mL燒杯中,加入60 mL去CO2水,用0.05 mol/L標準NaOH溶液滴定至pH 8.2。加入10 mL甲醛溶液,混勻后再用0.05 mol/L標準NaOH溶液繼續滴定至pH9.2,同時用蒸餾水代替酶解液做空白對照。記錄所消耗的標準NaOH溶液的體積,計算肌原纖維蛋白的水解度(DH)。

式中,c為標準NaOH溶液濃度,mol/L;V1為樣品消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積,mL;V2為試劑空白消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積,mL;V3為試劑稀釋液取用量,為1mL(5mL酶解液定容100mL后取用20mL);S為底物蛋白濃度,2%;W為提取的肌原纖維蛋白的純度,凱氏定氮法測得59.27%;htot為蛋白質中肽鍵總數,由2.1肌原纖維蛋白氨基酸組成測得,為7.54mmol/g。

1.2.8蛋白質提取率的測定以上清液中總蛋白質量和底物蛋白質量的百分比表示,即:

蛋白質提取率F(%)=(W1×6.25)/W2×100

式中:W1為酶解物上清液中的總氮含量;6.25為肉類蛋白的蛋白質轉換系數;W2為酶解前肌原纖維蛋白含量,總氮含量及蛋白質含量均采用微量凱氏定氮法測定。

1.2.9酶解液肽分子量分布的測定采用Waters600 高效液相色譜儀(配2487紫外檢測器和Empower工作站GPC軟件)分析,標準肽樣品:CytochromeC(MW12384)、Bacitracin(MW1450)、Gly-Gly-Tyr-Arg(MW451)、Gly-Gly-Gly(MW189)。為TSKgel2000SWXL300mm×7.8mm的分離柱,柱溫:30 ℃。吸取樣品2mL于10mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,用微孔過濾膜過濾后供進樣。檢測波長為220nm,最大壓力為2.0MPa。流動相:乙腈/水/三氟乙酸,45/55/0.1(V/V),流速為 0.5mL/min。

1.3數據處理與分析

所有實驗重復三次,采用Spss17.0和DesignExpert7.0對各實驗數據進行統計學分析,并用Origin7.0對各單因素數據作圖。

2　結果與討論

2.1肌原纖維蛋白氨基酸組成分析

蛋白質的氨基酸組成及比例在評價其酶解產物營養價值、風味、加工特性和生理活性等方面起著決定性作用[10,18]。從雞胸肉中提取肌原纖維蛋白的氨基酸分析結果見表3,從表中可知肌原纖維蛋白的氨基酸種類齊全,組成比例均衡,必需氨基酸(色氨酸在酸水解過程中不穩定而分解,未測定)含量占總氨基酸質量分數的40.90%,高于FAO/WHO推薦的成人理想氨基酸模式(36%),表明雞肉蛋白是一種優質的動物性蛋白源。

表3　肌原纖維蛋白中的各種氨基酸含量

2.2肌原纖維蛋白水解酶的確定

分別采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶及中性蛋白酶在各自最適條件下水解定量肌原纖維蛋白,水解結果見表4。

從表4中可以看出,5種酶對肌原纖維蛋白的水解效果因酶切方式的不同而各有差異。從蛋白質提取率方面來看,胃蛋白酶與堿性蛋白酶處理效果顯著(p<0.05),優于中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶;五種蛋白酶在水解度方面差異不顯著,其原因可能是該蛋白水解產物中氨基酸態氮含量相近;而從酶解液風味外觀來看,各蛋白酶水解肌原纖維蛋白后產物均出現味腥味現象,且出現不同程度渾濁,僅胃蛋白酶與堿性蛋白酶感觀稍佳;但由于胃蛋白酶屬于酸性蛋白酶,對蛋白質溶解度影響較大,加之胃蛋白酶僅作用于肽鍵兩端是芳香族氨基酸的的肽鍵[19]。綜合上述因素,選定堿性蛋白酶為肌原纖維蛋白水解最佳用酶。此與周雪松報道的堿性蛋白酶最適合雞肉蛋白深度酶解相符[9]。

表4　各酶較適宜條件下水解肌原纖維蛋白的結果

注:實驗數據為3次重復實驗的平均值,下同。

2.3堿性蛋白酶水解肌原纖維蛋白的單因素實驗

根據2.2確定的堿性蛋白酶較適宜水解條件進行酶解單因素實驗,以水解度和蛋白質提取率為測定指標,確定各個因素較佳的酶解反應范圍。

由圖1可知,堿性蛋白酶酶解肌原纖維蛋白的水解度與蛋白質提取率變化趨勢相似,二者在1000～5000 U/g的加酶量范圍內呈先增加后趨于穩定的趨勢,而水解度因酶阻遏效應在酶量過剩時會略降低,二者均在3000 U/g時有較佳效果;酶解液的pH及酶解溫度都呈現出先升后降的典型趨勢,且分別在pH8.0、45 ℃時較好;在優化好的各條件下,堿性蛋白酶酶解肌原纖維蛋白的水解度和蛋白質提取率均隨酶解時間的延長而增加,在6 h以后變化不顯著。因此,單因素實驗所得堿性蛋白酶酶解肌原纖維蛋白的較佳工藝條件為:加酶量3000 U/g、pH 8.0、溫度45 ℃、酶解時間6 h;因酶解效率、經濟利益等原因,最佳酶解時間確定為6 h,該因子不參與響應面實驗優化。且因蛋白質提取率是從蛋白質層面考慮該蛋白水解效果,而水解度則是從肽鍵斷裂數目層面探討該蛋白的水解程度,前者受酶解產物中非蛋白氮影響較大,故在后續Box-Behnken優化實驗中選擇水解度為響應值。

圖1　不同加酶量(a)、pH(b)、酶解溫度(c)及時間(d)對肌原纖維蛋白水解度及蛋白質提取率的影響Fig.1　The effects of enzyme concentration(a)、pH(b)、hydrolysis temperature(c)and time(d) on degree of hydrolysis(DH)and protein extraction rate(PER)of myofibrillar protein

2.4堿性蛋白酶水解肌原纖維蛋白的響應面優化實驗

根據2.3的單因素實驗結果,從中選出對實驗影響較大的加酶量、pH及溫度三個因素為響應因子,并以水解度為響應值,按表1進行3因素3水平的Box-Behnken實驗設計,實驗設計及結果見表5。由Design Expert 7.0分析軟件對表5結果進行回歸分析,所得的方差分析結果見表6。

由表6可以看出,模型的p值<0.0001,回歸模型極顯著;失擬項p=0.1065>0.05不顯著,說明該模型擬合度較好,故用該模型對堿性蛋白酶水解肌原纖維蛋白的水解過程進行優化是合適的。根據回歸系數,得出肌原纖維蛋白水解度的二次多項回歸方程為:DH=0.023152X1+224.506X2+7.0719X3-1.885E-003X1X2+2.245E-004X1X3+0.419X2X3-2.89025E-006X12-14.901X22-0.12421X32-1054.746。回歸系數的顯著性分析結果表明,X12、X22、X32為極顯著項,X1、X3、X1X2和X1X3項顯著,其他項均不顯著,說明加酶量及溫度對水解度的影響較大。由方差分析結果可知,研究范圍內的3個因素對水解度影響的主次順序為:X1>X3>X2,即加酶量>溫度>pH。

通過響應面的數字最優組合分析得到堿性蛋白酶水解肌原纖維蛋白的最佳工藝條件為:加酶量3463.4 U/g、pH7.72、溫度43.57 ℃,該條件下經6 h酶解,水解度為32.63%。

表5　Box-Behnken實驗設計及結果

表6　回歸模型方差分析表

注:*-顯著性(0.01

2.4.1加酶量和pH之間的交互作用的分析圖2為加酶量和pH之間的交互作用,加酶量不變時,隨著pH的升高,肌原纖維蛋白的水解度先上升后又下降,升高和下降的幅度都很顯著(p<0.05);當pH處于較高或較低水平時,加酶量的變化對水解度的影響不大,當pH處于中等水平時,隨著加酶量的增大,肌原纖維蛋白的水解度平穩升高后趨于穩定,而在酶量過于充足時水解度因酶阻遏效應而略降低。橢圓形的等高線圖說明加酶量與pH間的交互作用顯著。等高線沿加酶量軸向方向比pH軸向密集,說明加酶量對肌原纖維蛋白水解程度的影響度比pH的影響大。

圖2　酶量和pH對肌原纖維蛋白水解度影響的響應面圖Fig.2　Response surface graph of enzyme concentrationand pH on the degree of myofibrillar protein hydrolysis

2.4.2加酶量和溫度之間的交互作用的分析加酶量和溫度之間的交互作用見圖3,由圖3可以看出,加酶量與溫度之間的交互作用顯著。溫度一定時,肌原纖維蛋白的水解度隨著加酶量的增加呈先上升后趨于穩定的趨勢;在較適宜的酶添加量下,水解度隨溫度的升高呈先升高后下降的趨勢。由橢圓形等高線圖可知,加酶量與溫度間的交互作用顯著;且等高線沿加酶量軸向方向較溫度的密集,說明加酶量對肌原纖維蛋白水解程度的影響度比溫度的影響大。

2.4.3pH和溫度之間的交互作用的分析從圖4可以看出,當pH不變時,肌原纖維蛋白的水解度隨溫度的升高而先上升后又下降,且在pH在8.0左右變化最顯著(p<0.05);當溫度不變時,隨pH7.5～8.5之間的增加,肌原纖維蛋白的水解度平穩升高后迅速下降。pH和溫度的等高線圖接近圓形,說明二者之間的交互作用不顯著;等高線沿溫度軸向方向比pH軸向稍密集,pH和溫度對肌原纖維蛋白水解度的影響度程度相近。

表7　酶解液不同肽分子量分布及含量

圖3　酶量和溫度對肌原纖維蛋白水解度影響的響應面圖Fig.3　Response surface graph of enzyme concentrationand temperature on the degree of myofibrillar protein hydrolysis

圖4　pH和溫度對肌原纖維蛋白水解度影響的響應面圖Fig.4　Response surface graph of pH and temperature on the degree of myofibrillar protein hydrolysis

2.5酶解最佳工藝條件的確定及驗證結果

為驗證響應面實驗的可靠性,采用由Design Expert軟件及二次多項回歸方程得到的堿性蛋白酶水解肌原纖維蛋白最佳工藝條件(加酶量3463.4 U/g、pH7.72、溫度43.57 ℃)對其進行驗證。考慮到實驗的實際可操作性,將工藝參數中的酶量修正為3500 U/g,pH修正為7.8,水解溫度修正為44 ℃。在此條件下水解6 h,三次平行實驗所得肌原纖維蛋白水解度為(33.1±0.7697)%,與預測值32.63%差異不顯著,說明采用響應面法優化肌原纖維蛋白酶解工藝條件行之有效,具有實用價值。

2.6酶解液肽分子量分布分析

雞胸肉提取的肌原纖維蛋白以大分子為主,分子量13.8～200 kDa[20-21]。在響應面優化得到的最佳工藝條件下,經堿性蛋白酶水解6 h后,肌原纖維蛋白酶解液肽分子量分布及含量見表7。由表可得,酶解產物分子質量大于3000 Da的組分僅占8.3%,而<1000 Da的小肽含量高達61.5%,說明堿性蛋白酶較高程度的水解了肌原纖維蛋白。

然而,蛋白質酶解是一動態變化的過程,酶解液分子量分布比例僅反映體系中宏觀整體的分子量情況,酶解液中寡肽的具體組成需進一步分離鑒定[22-23]。QI M[24]和NAQASH S Y[25]等研究發現小于3 kDa的寡肽組分有較好的生物功能活性,而Bamdad等[26]發現不是分子量越小肽的抗氧化能力越強,只有肽的分子量超過一定臨界值時才表現出較強的抗氧化能力。對酶解產物生物活性的分析將是本研究進一步探討的內容。

3　結論

雞胸肉中提取的肌原纖維蛋白濃度為59.27%,該蛋白氨基酸種類齊全,組成比例均衡,必需氨基酸含量達40.90%,是一種優質的動物性蛋白源。水解酶優化實驗表明肌原纖維蛋白稅額的較佳用酶是堿性蛋白酶。

在單因素實驗基礎上,經Box-Behnken實驗優化并經修正得到肌原纖維蛋白酶法水解的最佳工藝條件為:加酶量3500 U/g、pH7.8、溫度44 ℃;此條件下經6 h酶解,水解度為(33.1±0.7697)%,與預測值32.63%差異不顯著,說明響應面法能較好的用于肌原纖維蛋白酶解工藝條件的優化,可為雞肉蛋白酶解的進一步研究以及生物活性肽類產品的開發提供理論依據。肽分子量分布分析發現酶解液中<1000 Da的小肽含量高達60.5%,說明堿性蛋白酶較高程度的水解了肌原纖維蛋白。

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Optimization of enzymatic hydrolysis conditions for myofibrillar protein of chicken breast by response surface methodology

BAI Teng-hui,Ma Ya-ping,KANG Zhuang-li,PAN Run-shu,MA Han-jun*

(College of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

Based on the degree of hydrolysis,enzymatic hydrolysis conditions of the myofibrillar protein extracted from chicken breast was optimized by response surface methodology in this article,the protein content and amino acid composition of the myofibrillar protein and the molecular weight distribution of the hydrolysates were also measured. Results showed that protein content of the extracted myofibrillar was 59.27%,the types and composition ratio of amino acids in this protein was every inch and balanced,the content of essential amino acid reached 40.90%. The best enzyme for hydrolyzing myofibrillar protein was alcalase. On the foundation of single factors experiment,the optimal hydrolysis conditions for myofibrillar protein hydrolyzed by alcalase was obtained as:enzyme concentration 3500 U/g,pH7.8 and temperature 44 ℃ through the Box-Behnken methodology. After hydrolysis for 6 h under the above conditions,the DH reached 33.17%. The content of peptide<1000 Da reached 61.5% by peptide molecular weight distribution,illustrated that myofibrillar proteins hydrolyzed in a high degree by alcalase.

myofibrillar protein;enzymatic hydrolysis;response surface methodology;protein extraction rate;degree of hydrolysis

2015-04-07

白騰輝(1988-),男,碩士,研究方向:農產品加工及貯藏工程,E-mail:th2012ky@163.com。

馬漢軍(1965-),男,博士,教授,主要從事農產品深加工研究,E-mail:xxhjma@126.com。

農業部公益性行業科研專項(201303083);河南省高校科技創新團隊支持計劃資助(13IRTSTHN006)。

TS252.1

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000