[C4mim]BF4/MgSO4雙水相萃取鎖陽總黃酮及抗氧化分析

張喜峰,張芬琴,羅光宏

(1.河西學院農業與生物技術學院,甘肅張掖 734000;2.河西學院凱源生物技術開發中心,甘肅省微藻工程技術研究中心,甘肅張掖 734000)

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[C4mim]BF4/MgSO4雙水相萃取鎖陽總黃酮及抗氧化分析

張喜峰1,張芬琴1,羅光宏2,*

(1.河西學院農業與生物技術學院,甘肅張掖 734000;2.河西學院凱源生物技術開發中心,甘肅省微藻工程技術研究中心,甘肅張掖 734000)

對[C4mim]BF4(1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽)/MgSO4雙水相萃取鎖陽總黃酮的工藝條件及抗氧化作用進行研究。以[C4mim]BF4質量分數、MgSO4質量分數、鎖陽總黃酮粗提物質量分數為響應因子,利用三因素三水平的響應面分析對鎖陽總黃酮萃取條件進行優化,初步評價鎖陽總黃酮抗氧化作用。結果表明,鎖陽黃酮的最佳萃取條件為:[C4mim]BF4質量分數為13.025%、MgSO4質量分數為17.5%及粗提液質量分數12%,萃取率達到98.4%。鎖陽總黃酮的抗氧化性隨著濃度升高而升高,當總黃酮濃度為0.6 mg/mL時,OH自由基清除率和DPPH自由基清除率分別達到65%和67.2%。

鎖陽,雙水相體系,總黃酮,抗氧化

鎖陽(CynomoriumsongaricumRuPr.)是鎖陽科(Cynomoriaceae)鎖陽屬多年生肉質草本植物,多寄生于蒺黎科(Zygophvllaceae)白刺屬(Nityaria L.)植物根部,是全寄生種子植物[1]。主要產于甘肅、新疆、青海、寧夏、內蒙古等地。黃酮是鎖陽中主要活性成分之一[2],具有抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老作用[3-6]。

目前鎖陽黃酮提取方法主要有醇提法[7]、超聲波輔助提取[8]、超臨界CO2萃取法[9]。這些提取方法存在提取效率較低、溶劑殘留、能耗高、成本高等缺點。雙水相是指兩種水溶性的物質不相容而造成它們的混合溶液分離形成兩相,通過溶質在兩相之間分配系數的差異而進行萃取純化或直接用其作為提取劑的體系[10]。離子液體雙水相具有無毒、不易乳化、粘度低、分相時間短、操作簡單等特點[11],已被廣泛用于天然產物的分離[12-15]。

本實驗以鎖陽為材料,采用單因素實驗和響應面分析法,優化C4mim]BF4/MgSO4雙水相體系萃取黃酮的工藝,并探討鎖陽黃酮抗氧化能力,為其進一步開發提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鎖陽產地甘肅,由甘肅凱源生物技術開發中心提供。

蘆丁標準品(純度≥98%)上海源葉生物科技有限公司;[C4mim]BF4中國科學院蘭州化學物理研究所;MgSO4,無水乙醇,VC天津光復精細化工研究所;亞硝酸鈉,硝酸鋁,硫酸亞鐵,雙氧水,鄰二氮菲均為分析純天津百世化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)天津市富宇精細化工有限公司。

722可見分光光度計上海光譜儀器有限公司;旋轉蒸發儀上海青浦滬西儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1鎖陽粗黃酮的制備精確稱取鎖陽干粉約10 g,置于500 mL燒杯中,按照1∶25(g/mL)加入80%乙醇,在325 W功率超聲提取其中黃酮10 min,2000 r/min,離心10 min,得上清液,在旋轉蒸發儀中蒸發濃縮,轉入50 mL容量瓶中,加80%乙醇定容,即得鎖陽黃酮粗提液[16]。

1.2.2鎖陽黃酮雙水相萃取方法體系總質量為10.00 g,加入適量的[C4mim]BF4、MgSO4和黃酮粗提液,充分振蕩使成相物質溶解,靜置至兩相達到分離,鎖陽黃酮富集于雙水相系統的上相中,讀取上下相體積,求相比R;分別測定上下相黃酮濃度,計算鎖陽黃酮的分配系數K及提取率Y[14],如下式:

R=上相體積(Vt)/下相體積(Vb)

K=上相黃酮濃度(Ct)/下相黃酮濃度(Cb)

Y(%)=RK/(1+RK)×100

1.2.3標準曲線的繪制采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定黃酮[17]。

1.2.4雙水相萃取單因素實驗室方法[C4mim]BF4質量分數對鎖陽黃酮分配行為的影響:在[C4mim]BF4/MgSO4雙水相體系中,MgSO4質量分數為20%,粗提液質量分數為10%,分別設定[C4mim]BF4質量分數為10%、12.5%、15%、17.5%、20%進行雙水相萃取;MgSO4質量分數對鎖陽黃酮分配行為的影響:在[C4mim]BF4/MgSO4雙水相體系中,[C4mim]BF4質量分數為15%,粗提液質量分數為10%,改變MgSO4質量分數為15%、17.5%、20%、22.5%、25%進行雙水相萃取;在[C4mim]BF4/MgSO4雙水相體系中,[C4mim]BF4質量分數為15%,MgSO4的質量分數為17.5%,改變粗提液質量分數為1%、2%、3%、4%、5%進行雙水相萃取。

1.2.5Box-Behnken組合設計研究最佳萃取條件在單因素實驗的基礎上,選取[C4mim]BF4、MgSO4和粗提液三個自變量,采用Design-Expert 7.0軟件設計三因素三水平Box-Behnken實驗,因素水平及編碼見表1。

表1　Box-Behnken實驗因素與水平

1.2.6鎖陽總黃酮抗氧化分析

1.2.6.1鎖陽總黃酮對·OH的清除實驗參照加列西·那甫等[16]的方法。取0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL于試管中,依次加入0.2 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液2 mL,0.75 mmol/L硫酸亞鐵1 mL,搖勻,加入0.01%過氧化氫溶液1 mL,于37 ℃水浴加熱60 min,在536 nm波長處測定吸光度,所測得吸光度為損傷管的吸光值(A損傷)。未損傷管以1 mL水代替損傷管中過氧化氫,利用1.2.5萃取后的總黃酮溶液,配制不同濃度的樣品溶液。依次取0.2 mL代替損傷管中的水,操作方法同損傷管,可測的536 nm波長處未損傷管的吸光值(A空白,A樣品);蘆丁、維生素C對羥自由基的清除效果測定方法同上。

1.2.6.2鎖陽黃酮對DPPH的清除實驗利用1.2.5萃取后的總黃酮溶液,配制不同濃度的樣品溶液。分別取2 mL樣品溶液,分別加入濃度為3×10-4mol/L的DPPH溶液2.0 mL,混合搖勻,反應20 min后在517 nm測定其吸光值A1。以2 mL無水乙醇代替DPPH的吸光值為A2,以2 mL蒸餾水代替樣品溶液的吸光值為A0,以無水乙醇作空白對照[16]。DPPH自由基清除率可表示:

E(%)=[(1-(A1-A2)/A0]×100

1.3數據統計分析

單因素實驗數據和響應面分析分別采用Excel2003和Design-Expert7.0.5軟件分析,所有實驗均重復三次,取平均值。

2　結果與分析

2.1標準曲線繪制

在510 nm處測定不同含量的蘆丁的吸光值,以蘆丁含量(mg)為橫坐標(X),吸光值為縱坐標(Y),計算得到回歸方程:Y=1.367X-0.0134,R2=0.9912。

2.2單因素實驗結果與分析

2.2.1[C4mim]BF4質量分數對鎖陽黃酮分配行為的影響由圖1可知,隨著[C4mim]BF4質量分數逐漸增大,黃酮萃取率和分配系數先增加后減小,在[C4mim]BF4質量分數為15%時,萃取率和分配系數達到最大值。主要原因是離子液體[C4mim]BF4和黃酮化合物之間形成π-π體系,促使黃酮轉移至上相,當離子液體質量分數過大時,使得體系的黏稠度高,阻止相間分子轉移,不利于黃酮的轉移、分配及萃取。我們的觀點與Yan etal等[17]的觀點是一致的。因此,確定[C4mim]BF4質量分數為15%。

圖1　[C4mim]BF4質量分數對鎖陽黃酮分配行為的影響Fig.1　Effect of the mass percent of [C4mim]BF4on partitioning behaviour of total flavonoids of cynomorium songaricum

2.2.2MgSO4質量分數對鎖陽黃酮分配行為的影響由圖2可知,鎖陽黃酮的萃取率和分配系數隨MgSO4用量不同,呈規律性變化,表現為先增大后減小的趨勢。在MgSO4質量分數為17.5%時,萃取率和分配系數同時達到最大,分別為99.35%和42.5。因為隨著MgSO4質量分數的增加,雙水相體系離開成相臨界點距離增大,使上下相電位差值增大,而電位差的大小直接影響到分配系數和萃取率;MgSO4的質量分數過高,不僅影響黃酮的表面疏水性,而且擾亂雙水相系統,改變各相中成相物質的組成,使萃取率和分配系數降低。因此,確定MgSO4的質量分數為17.5%。

圖2　MgSO4質量分數對鎖陽黃酮分配行為的影響Fig.2　Effect of the mass percent of MgSO4on partitioning behaviour of total flavonoids of cynomorium songaricum

2.2.3粗提液質量分數對鎖陽黃酮分配行為的影響結果表明,粗提液質量分數為10%時,鎖陽黃酮的分配系數和萃取率達到最大,分別為98.16%和46.2(圖3),原因可能是黃酮類化合物羥基基團破壞水分子之間的氫鍵網絡,黃酮類化合物和水分子之間形成新的氫鍵網絡促使粗提物中其他類物質轉移至下相;當粗提液質量分數大于10%時,萃取率和分配系數均逐漸降低;這是由于過量黃酮類化合物集聚在兩相間,影響兩相中傳質過程。因此確定粗提液質量分數10%為最佳萃取條件。

圖3　粗提液質量分數對鎖陽黃酮分配行為的影響Fig.3　Effect of the mass percent of crude flavone on partitioning behaviour of total flavonoids of cynomorium songaricum

2.3響應面分析實驗結果

2.3.1Box-Behnken Design實驗數據分析根據以上單因素實驗結果,采用響應面方法進一步優化實驗條件。根據Box-Behnken組合設計原理,以萃取率為響應值,以[C4mim]BF4質量分數(A)、MgSO4質量分數(B)和粗提液質量分數(C)為實驗因素設計實驗,分析實驗結果見表2。

表2　Box-Behnken實驗設計與結果

以鎖陽黃酮萃取率Y(%)為響應值,根據表2的實驗結果,用Design-Expert7.0軟件對各因素進行二元多次回歸擬合,得到[C4mim]BF4質量分數(A)、MgSO4質量分數(B)和粗提液質量分數(C)與鎖陽黃酮之間的二次多項回歸方程:

Y=98.876-0.46875A+0.0175B+0.02875C+0.0625AB-1.155AC+0.0525BC-1.048A2-0.3655B2-0.323C2

由表3可以看出,本模型擬合程度明顯,p=0.001<0.01,模型極顯著。失擬項p為0.3653(p>0.05)沒有顯著意義,說明數據中沒有異常點。模型決定系數為94.82%,說明該模型具有較好的可信度,自變量與響應值之間的線性關系顯著,可用于實驗的理論預測。模型一次項A(p<0.01)對黃酮萃取率有極顯著意義,B、C對黃酮萃取率不顯著;二次項A2(p<0.01)對黃酮萃取率有極顯著意義;交互項AC(p<0.01)對黃酮萃取率有極顯著意義,AB、BC對黃酮萃取率不顯著。在所選取的各因素水平范圍內,各因素的主效應關系為:[C4mim]BF4質量分數(A)>粗提液質量分數(C)>MgSO4質量分數(B)。

表3　對擬合二次多元模型的方差分析結果

2.3.2雙水相萃取鎖陽黃酮的響應面圖分析根據回歸模型作出相應的響應面圖,如圖4所示,每個響應面圖分別代表2個獨立變量之間的相互作用,由響應面可以看出,AC之間有一定相互作用,AB、BC交互作用較小。

圖4　各因素交互作用的響應面立體圖Fig.4　Response plots for the pairwise interactive effects

2.3.3模型優化及驗證實驗以響應面優化實驗得到雙水相體系組成條件:[C4mim]BF4質量分數為13.025%、MgSO4質量分數為17.5%,粗提液質量分數12%,此時鎖陽黃酮的萃取效果最佳,萃取率為99.21%。在此條件下做三組平行實驗進行驗證,所得結果為98.4%,與模型預測值基本一致,實驗結果具有一定的使用參考價值。

2.4鎖陽黃酮抗氧化活性分析

2.4.1羥自由基清除能力由圖5可知,萃取后鎖陽黃酮對羥自由基清除能力隨著黃酮濃度增加而升高,當黃酮濃度為0.6 mg/mL時,鎖陽黃酮對羥自由基清除能力達到65%,鎖陽黃酮對羥自由基清除能力的IC50值為0.445 mg/mL;同樣條件下,VC對羥自由基清除能力強于鎖陽黃酮。

圖5　鎖陽黃酮對羥自由基的清除能力Fig.5　Hydroxyl Radical Scavenging effect of total flavonoids of cynomorium songaricum

2.4.2DPPH自由基清除能力由圖6可知,隨著黃酮濃度不斷增大,對DPPH自由基清除能力也增大;當黃酮濃度為0.6 mg/mL時,鎖陽黃酮對DPPH自由基清除能力達到67.2%。鎖陽黃酮DPPH自由基清除能力的IC50值為0.469 mg/mL;在黃酮濃度0.1～0.6 mg/mL范圍內,VC對DPPH自由基清除能力優于鎖陽黃酮。

圖6　鎖陽黃酮對DPPH自由基的清除率Fig.6　DPPH free radical scavenging effect of total flavonoids of cynomorium songaricum

3　結論

采用離子液體雙水相萃取鎖陽黃酮,在單因素實驗的基礎上,以鎖陽黃酮萃取率為響應值,得到鎖陽黃酮的最佳提取工藝為[C4mim]BF4質量分數為13.025%、MgSO4質量分數為17.5%和粗提液質量分數12%,在此提取條件下鎖陽黃酮的萃取率為98.4%,說明采用響應面法優化離子液體雙水相萃取鎖陽黃酮是比較可靠的。

萃取后鎖陽黃酮的抗氧化能力實驗結果表明,當黃酮濃度在0.1～0.6 mg/mL時,黃酮對羥自由基和DPPH清除能力逐漸增大的;鎖陽黃酮對羥自由基清除能力的IC50值為0.445 mg/mL;鎖陽黃酮DPPH自由基清除能力的IC50值為0.469 mg/mL;同樣條件下,對羥自由基和DPPH自由基清除能力低于VC。

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Aqueous two phase system based on[C4mim]BF4/MgSO4for isolation of total flavonoids fromCynomoriumSongaricumand its antioxidation activity analysis

ZHANG Xi-feng1,ZHANG Fen-qin1,LUO Guang-hong2,*

(1.The College of Agriculture and Biotechnology(CAB),Hexi University,Zhangye 734000,China;2.Microalgae Engineering Research Center of Gansu Province,Kaiyuan Bio-tech Development Center,Hexi University,Zhangye 734000,China;)

An efficient aqueous two-phase based on[C4mim]BF4/MgSO4extraction technique was developed to extract total flavonoids fromCynomoriumSongaricumand evaluate the antioxidant activity.[C4mim]BF4concentration(%w/w),MgSO4concentration(%w/w),and crude extract concentration(%w/w)were selected as response factors,and the yield of total flavonoids was used as response value. The optimum conditions for total flavonoids extraction were obtained based on three-factor-three-level experiment design according to the principles of response surface methodology,and antioxidation activity was evaluated. The optimum conditions were 13.025%(w/w),17.5%(w/w),and 12%(w/w)for[C4mim]BF4concentration,MgSO4concentration,and crude extract concentration respectively. Maximum yield of extracted total flavonoids from the experiments was determined to be 98.4% under the optimal conditions. The antioxidant property of total flavonoids enhanced with flavonoids concentration increased. Hydroxy radical scavenging rate and DPPH free radical reached 65% and 67.2% respectively when total flavonoids concentration was 0.6 mg/mL.

CynomoriumSongaricum;aqueous two-phase system;total flavonoids;antioxidation

2015-03-10

張喜峰(1982-)，男，碩士，講師，研究方向：天然產物開發，E-mail：curiouslysxsd@163.com 。

羅光宏(1965-)，男，碩士，教授，研究方向：天然產物開發，E-mail:464690924@qq.com。

甘肅省中小企業創新基金項目(1047GCCG001)；河西學院校長基金項目(XZ2014-29)。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000