白背毛木耳多糖APP3a羧甲基化修飾工藝研究

陳　慧,陳義勇

(1.中國礦業大學化工學院,江蘇徐州 221008;2.常熟理工學院生物與食品工程學院,江蘇常熟 215500)

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白背毛木耳多糖APP3a羧甲基化修飾工藝研究

陳慧1,2,陳義勇2,*

(1.中國礦業大學化工學院,江蘇徐州 221008;2.常熟理工學院生物與食品工程學院,江蘇常熟 215500)

以白背毛木耳多糖APP3a為原料,用堿性氯乙酸法制備羧甲基化白背毛木耳多糖(CM-APP3a),研究其羧甲基化的工藝。以羧甲基取代度為指標,通過單因素實驗對氯乙酸用量、氫氧化鈉用量、反應時間、反應溫度等工藝參數進行研究,并用響應面Box-Behnken實驗設計對羧甲基化工藝進行優化。實驗結果表明,APP3a羧甲基修飾的最佳工藝條件為:反應介質為異丙醇,多糖APP3a 60 mg,氯乙酸用量1.45 g,氫氧化鈉用量 2.48 g,反應溫度55 ℃,反應時間3.5 h。在該優化條件下,羧甲基白背毛木耳多糖(CM-APP3a)的取代度達為0.892,與理論預測值0.895相比,其相對誤差為0.33%。說明通過響應面優化后得出的回歸方程具有一定的實踐指導意義。

白背毛木耳多糖APP3a,羧甲基化,取代度,響應面

白背毛木耳(Auriculariapolytricha),屬于真菌門擔子菌綱,銀耳目黑木耳科黑木耳屬[1],是近年來新引進的一個木耳品種,分布在全國各地,它營養豐富,質地脆滑,含有豐富的多糖,根據研究表明白背毛木耳多糖具有提高免疫力[1]、抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗凝血、抗血栓、降血脂[4]等作用。

近年來,隨著對多糖結構的研究表明,采用一定的方法對多糖化學結構進行適當的修飾,可在很大程度上提高多糖的生物活性,具有很好的應用前景。目前,多糖的硫酸化、羧甲基化和乙酰化已有了初步的研究[5-7]。多糖羧甲基化即指向多糖大分子鏈上引入羧甲基基團,多糖羧甲基化能增大多糖的溶解度和電負性,可以提高多糖的水溶性,能給多糖增加新的活性[8-11],因其成本低、操作簡單及生成物毒性小等優點,已成為一種重要的多糖衍生化方法。

目前對白背毛木耳多糖的研究主要集中在提取、分離純化等方面,而對白背毛木耳多糖化學結構修飾的研究還未見報道。基于白背毛木耳多糖單一組分在化學修飾的研究尚未見報道的現狀,以前期分離得到的白背毛木耳多糖APP3a為研究對象,采用堿性氯乙酸法對白背毛木耳多糖APP3a進行羧甲基化修飾及其工藝研究,為白背毛木耳多糖及其衍生物在藥品、保健食品領域的應用提供相關的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

白背毛木耳購于江蘇省常熟市;氯仿、正丁醇、氯乙酸、異丙醇、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、酚酞等均為分析純;聚酰胺樹脂國藥集團化學試劑有限公司;Sephadex G-200、DEAE-cellulose52、透析袋(截留分分子量3500)北京索萊寶科技有限公司。

HH-2智能數顯恒溫水浴鍋金壇市杰瑞爾電器有限公司;真空冷凍干燥機Alpha 1-2 LD plus,德國CHRIST公司;高速冷凍離心機CR22GⅡ,日本HITACHI公司;722分光光度計上海菁華科技儀器有限公司;分析天平XS105 DualRange,瑞士METTLER TOLEDO公司;pH計Seven Easy S20K,瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.2實驗方法

1.2.1白背毛木耳多糖APP3a的制備白背毛木耳經洗滌、干燥、粉碎后,用95%的乙醇回流脫脂,以除去色素及脂溶性物質,干燥得到預處理的白背毛木耳粉末。準確稱取50 g粉末,按料液比1∶40,提取溫度80 ℃條件下提取3次,合并提取液,在3000 r/min條件下離心20 min,除去沉淀,收集上清液。將上清液減壓濃縮至一定體積,經Sevage法除蛋白,聚酰胺樹脂脫色后,用4倍體積95%的乙醇進行醇沉,沉淀經離心后冷凍干燥。將干燥后的多糖通過DEAE-cellulose離子交換柱分離純化,分別收集所需洗脫液,透析、濃縮后冷凍干燥得到四個組分(分別命名為APP1,APP2,APP3,APP4),其中APP3占總洗脫量的39.2%,接著對APP3進一步分離,通過葡聚糖G-200凝膠柱分級純化,得到單一組分,定義為APP3a。

1.2.2羧甲基白背毛木耳多糖(CM-APP3a)的制備羧甲基化多糖(CM-APP3a)的制備按照文獻[12]方法制備。稱取APP3a 60 mg,置于20 mL 異丙醇中,磁力攪拌反應30 min,然后加入適量20% NaOH溶液繼續攪拌反應1 h,再將一定量的氯乙酸溶于少量蒸餾水中,緩慢加入上述反應液中,混合液置于一定溫度的恒溫水浴鍋中繼續攪拌反應,待冷卻至室溫,用4 mol/L的鹽酸中和至pH為中性,然后將混合液置于透析袋中,用蒸餾水透析48 h后,減壓濃縮至一定體積,用4倍體積的無水乙醇在4 ℃下沉淀12 h,所得沉淀經冷凍干燥后得羧甲基白背毛木耳多糖(CM-APP3a)。

1.2.3羧甲基取代度的測定羧甲基化取代度的測定采用堿滴定法[13-15]。準確稱取10 mg CM-APP3a置于100 mL 燒杯中,加入0.2 mol/L HCl 溶液(70%乙醇溶液配制)4 mL,振蕩反應3 h。用80%的乙醇水溶液洗滌固體,樣品用0.01 mol/L 的標準NaOH溶液溶解,微熱條件下使溶液成透明后,立即用0.01 mol/L標準HCl溶液反滴定,記錄加入鹽酸的體積VHCl。

式中:CNaOH為0.01mol/L;CHCl為0.01mol/L;W為多糖樣品質量,g;B為每克樣品消耗NaOH的物質的量,mmol/g。

1.2.4單因素實驗

1.2.4.1氯乙酸用量對APP3a羧甲基化修飾的影響在NaOH用量為2.0g,反應時間為4h,反應溫度為55 ℃,反應介質為異丙醇的條件下,分別考察不同氯乙酸用量(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g)對取代度的影響。

1.2.4.2氫氧化鈉用量對APP3a羧甲基化修飾的影響在氯乙酸用量為1.5g,反應溫度為55 ℃,反應時間為4h,反應介質為異丙醇的條件下,分別考察不同氫氧化鈉用量(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g)對取代度的影響。

1.2.4.3反應溫度對APP3a羧甲基化修飾的影響在NaOH用量為2.5g,氯乙酸用量為1.5g,反應時間為4h,反應介質為異丙醇的條件下,分別考察不同反應溫度(40、45、50、55、60 ℃)對取代度的影響。

1.2.4.4反應時間對APP3a羧甲基化修飾的影響在NaOH用量為2.5g,氯乙酸用量為1.5g,反應溫度為55 ℃,反應介質為異丙醇的條件下,分別考察不同反應時間(1、2、3、4、5h)對取代度的影響。

1.2.5響應面實驗設計根據單因素實驗結果,利用Design-Expert8.06 設計原理,設計氯乙酸用量、氫氧化鈉用量、反應時間、反應溫度4因素3水平的中心組合實驗,水平因素表見表1所示。利用響應面分析與優化,得到最佳的APP3a多糖羧甲基化工藝條件。

表1　響應面分析實驗因素與水平

1.2.6紅外光譜分析取干燥的APP3a和CM-APP3a各3 mg,與一定量的溴化鉀(KBr)混合后壓片,在4000～400 cm-1進行紅外光譜掃描。

1.3數據統計分析

采用PASW statistics 18軟件實驗數據進行差異顯著性檢驗,ANVOA 程序用于方差分析,最小顯著差異法(LSD)用于數據多重比較分析,采用Excel 2003軟件作圖。

2　實驗結果與討論

2.1單因素對APP3a羧甲基化修飾的影響

2.1.1氯乙酸用量對APP3a羧甲基化修飾的影響氯乙酸乙酸用量對APP3a羧甲基反應的影響見圖1。由圖1可知,隨著氯乙酸的增加,多糖取代度先升高后降低,在氯乙酸用量為1.5 g時,羧甲基取代度達到最大,之后繼續增加氯乙酸的用量,取代度逐漸下降。這是因為隨著氯乙酸的增加,體系中的CH2COO-增多,使多糖反應的機率增大,但整個取代反應需要在堿性條件下進行,隨著氯乙酸的增加,氯乙酸的水解加快,需要消耗一部分的NaOH,從而使整個反應體系的pH降低,致使取代度下降[16]。因此,確定最佳的氯乙酸用量為1.5 g。

圖1　氯乙酸用量對取代度的影響Fig.1　Effect of chloroacetic acid amount on substitution degree of CM-APP3a

2.1.2氫氧化鈉用量對APP3a羧甲基化修飾的影響NaOH用量對APP3a羧甲基反應的影響見圖2。由圖2可知,隨著NaOH用量的增加,多糖取代度呈現先增加后降低的趨勢,在NaOH用量為2.5 g時,取代度達到最大值。這是因為隨著NaOH用量的增加,生成較多的多糖鈉鹽,增大了與氯乙酸反應的機率,使醚化反應更充分,從而增加了取代度。但過多的NaOH會導致部分副反應發生,降低氯乙酸的利用率,不利于取代反應,使取代度降低[17]。因此,確定最佳的NaOH用量為2.5 g。

圖2　NaOH用量對取代度的影響Fig.2　Effect of NaOH amount on substitution degree of CM-APP3a

2.1.3反應溫度對APP3a羧甲基化修飾的影響反應溫度對APP3a羧甲基反應的影響見圖3。由圖3可知,隨著溫度的升高,多糖取代度先升高后降低,在反應溫度為55 ℃時,多糖取代度達到最大值。這是因為溫度過高時,氯乙酸水解副反應加快,不利于取代反應的進行,同時會加劇多糖在堿性介質中的降解,增加副反應的發生,使取代度降低。因此,確定最佳的反應溫度為55 ℃。

圖3　反應溫度對取代度的影響Fig.3　Effect of reaction temperature on amount on substitution degree of CM-APP3a

2.1.4反應時間對APP3a羧甲基化修飾的影響反應時間對APP3a羧甲基反應的影響見圖4。由圖4可知,隨著反應時間的增加,多糖取代度先升高后降低,在反應時間為4 h,取代度為最大值,這是因為隨著時間的增加,活性中心明顯增多,當反應時間超過4 h,副反應會增加,從而使取代度下降。因此,確定最佳的反應時間為4 h。

圖4　反應時間對取代度的影響Fig.4　Effect of reaction time amount on substitution degree of CM-APP3a

2.2響應面方法確定APP3a羧甲基化工藝條件

2.2.1響應模型的建立與分析在單因素實驗的基礎上,用Design-Expert 8.06軟件進行響應面實驗設計,以取代度為響應值,結果見表2。根據響應面分析,得出回歸模型參數的方差分析見表3。

由表3可知,模型的F值為47.64,p<0.0001,表明該模型是極顯著的,具有統計學意義。失擬項p值為0.0541(>0.05),差異不顯著,未知因素對實驗結果干擾很小,說明殘差均由隨機誤差引起。R2=0.9794,說明模型擬合程度良好,實驗誤差小,具有較好的可靠性,因此該模型可以反映響應值的變化。由Box-Behnken 實驗擬合出的回歸方程為:Y=0.89-0.015A-0.0051B+0.0068C-0.0020D+0.0098AB-0.060AC+0.000AD+0.021BC+0.027BD-0.023CD-0.096A2-0.071B2-0.015C2-0.12D2

式中:Y-取代度;A、B、C、D-分別為氯乙酸用量、NaOH用量、反應溫度、反應時間。同時直觀分析表3中數據,方程中AC,A2,B2,C2,D2為影響高度顯著項(p<0.01),A,BC,BD,CD為影響顯著項(p<0.05)。影響羧甲基取代度大小的主次順序依次為氯乙酸(A)>反應溫度(C)>NaOH用量(B)>反應時間(D)。

表2　響應面實驗設計及結果

2.2.2響應面分析結果氯乙酸用量、氫氧化鈉用量、反應溫度以及反應時間之間的交互作用對多糖取代度的影響見圖A～圖D。響應面圖和等高線圖可直觀反映各因素之間的相互作用,曲面陡峭表明因素對取代度的影響顯著,曲線平緩則相反,表明因素對取代度的影響不顯著[18]。等高線的形狀反映兩個因素交互作用的強弱,橢圓形表明交互作用強,影響顯著,圓形則相反[19]。等高線密集表明對取代度的影響較大,稀疏表明影響較小[18]。

從圖5可以看出,氯乙酸用量(A)是影響多糖羧甲基化取代度最為顯著的因素。圖5(A-D)為響應面圖和等高線圖,可以反映氯乙酸用量、氫氧化鈉用量、反應溫度、反應時間對羧甲基多糖取代度的影響。由圖5B和圖5C可見,各因素處于不同實驗水平時,對響應值的影響呈現出不同的變化規律,響應曲面呈現出高度扭曲,說明BC(NaOH用量和反應溫度)、BD(NaOH用量和反應時間)存在著顯著的交互作用,這也與回歸分析的結果一致(p分別為0.0462和0.0155),為影響顯著項。圖5A-5D所示,各等高線呈橢圓形,響應曲面走勢劇烈,表明上述各因素之間交互作用較強。由表3可知AC之間的交互作用大于BD之間的交互作用,各因素的交互作用對取代度的影響由強到弱依次為AC、BD、CD、BC。

表3　回歸模型方差分析

注:* 差異顯著,p<0.05;** 差異極顯著,p<0.01。

圖5　兩因素間交互作用的響應面圖Fig.5　The response surface of two factor interactions

2.2.3最佳條件的確定及驗證實驗利用Design-Expert 8.06軟件進行工藝參數的優化,建立了以羧甲基取代度為目標值,得到最佳的工藝條件為:反應介質為異丙醇,白背毛木耳多糖APP3a 60 mg,氯乙酸用量1.45 g,氫氧化鈉用量 2.48 g,反應溫度55.2 ℃,反應時間3.49 h,多糖羧甲基化取代度的預測值為0.895。考慮實際操作,調整后工藝參數為氯乙酸用量1.45 g,氫氧化鈉用量 2.48 g,反應溫度55 ℃,反應時間3.5 h,該最佳條件下測得多糖羧甲基化的取代度為0.892,與預測值0.895基本相符,其相對誤差為0.33%,證實了預測實驗的準確性和實用性。

2.3 紅外光譜分析CM-APP3a和APP3a的紅外光譜見圖6,可見CM-APP3a和APP3a均具有多糖類物質的特征吸收峰:3400 cm-1左右為羥基(O-H)的伸縮振動吸收峰,2900 cm-1左右為次甲基(C-H)的伸縮振動吸收峰。由圖6可以看出,白背毛木耳多糖APP3a經修飾后,在1600、1420和1330 cm-1處均出現強吸收峰,為-COO-的特征吸收峰,其中1600 cm-1左右處為C-O的非對稱伸縮振動吸收峰,1420 cm-1左右處為C-O的對稱伸縮振動吸收峰,這些都證明白背毛木耳多糖APP3a已成功羧甲基化。

圖6　APP3a和CM-APP3a的紅外光譜圖Fig.6　Infrared spectra of APP3a and CM-APP3a

3　結論

本文以白背毛木耳多糖APP3a為原料,采用堿性氯乙酸法,以羧甲基取代度為指標,通過單因素實驗及Box-Behnken響應面法實驗設計,建立了響應面與各因素(氯乙酸用量、氫氧化鈉用量、反應溫度、反應時間)之間數學模型,得到回歸方程,并以此模型預測了最佳工藝條件和最高取代度。由該模型分析可知,影響多糖APP3a羧甲基取代度的因素主次順序為:氯乙酸>反應溫度>NaOH用量>反應時間。確定最佳工藝參數:多糖APP3a 60 mg,反應介質為異丙醇,氯乙酸用量1.45 g,氫氧化鈉 用量2.48 g,反應溫度55 ℃,反應時間3.5 h,多糖羧甲基化取代度可達0.892,與預測值0.895無顯著差異,說明該回歸模型具有良好的預測性。

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Carboxymethyl modification ofAuriculariapolytrichapolysaccharide

CHEN Hui1,2,CHEN Yi-yong2,*

(1.School of chemical Engineering and technology,China University of mining and technology,Xuzhou 221008,China;2.School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

Auriculariapolytrichapolysaccharide(APP3a)was carboxymethylated by the method of alkaline chloroacetic acid and its carboxymethylation process was studied. The process parameters including chloroacetic acid amount,sodium hydroxide amount,reaction time,temperature,were studied through the single factor(experiment,and the optimization of carboxymethylation were adopted by response surface experiments with Box-Behnken design. The experimental results showed that the optimal conditions ofAuriculariapolytrichapolysaccharide(APP3a)carboxymethylation were obtained as followed:isopropyl alcohol used as reaction medium,60 mg of APP3a,1.45 g of chloroacetic acid,2.48 g of sodium hydroxide,55 ℃ of reaction temperature,3.5 h of reaction time. Under this condition the maximum substitution degree of 0.892 was obtained. Compared to the theoretical value,the relative error was 0.33%. It showed that the regression equation by response surface optimization had certain practical significance.

Auriculariapolytrichapolysaccharide;carboxymethylation;substitution degree;response surface methodology

2015-04-29

陳慧(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：生物化工,E-mail：chenhuizjx@126.com。

陳義勇(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：食品科學與天然活性成分，E-mail：chzjx1016@126.com。

TS255.1

B

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000