苦菜不同部位營養成分及其生理活性測定

霍　莉,鎖　然,李　寧,王　頡

(1.河北農業大學園藝學院,河北保定 071001;2. 河北大學化學與環境科學學院,河北保定 071000)

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苦菜不同部位營養成分及其生理活性測定

霍莉1,2,鎖然1,李寧1,王頡*

(1.河北農業大學園藝學院,河北保定 071001;2. 河北大學化學與環境科學學院,河北保定 071000)

苦菜不同部位(根、花、莖、葉)及苦菜全草用70%的乙醇溶劑超聲輔助提取30 min,測定苦菜不同部位酚酸、黃酮、多糖和皂苷等營養成分含量,并用自由基清除法檢測各提取物的抗氧化能力及考察提取物對尼古丁急性中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響。結果表明:苦菜不同部位有效成分含量差別明顯,多糖、皂苷含量為根>葉>花>莖;黃酮、酚酸含量為葉>花>莖>根;苦菜各部位提取液抗氧化性強弱順序為葉>花>莖>根,可以推斷苦菜抗氧化性與黃酮、酚酸含量有關;而對尼古丁急性中毒小鼠血清乙酰膽堿均有一定抑制作用。

苦菜,營養成分,生理活性

苦菜(IxerisChinensis)能使尼古丁中毒的蛇“起死回生”[1-2],但機理報道很少。苦菜是一種藥食兩用的菊科苦苣屬多年生草本植物,折斷有白汁且味苦,廣泛生長于全國各地,全草含有多種營養成分[3-4]。其中,苦菜多糖有抗腹瀉和防便秘的雙向效果[5];小鼠實驗性肝損傷經苦菜黃酮作用后有良好的受保護效果[6-9];酚酸類化合物有消炎、抗菌、抗血栓形成等作用[8-9];苦菜皂苷具有清熱解毒,消癰排濃,祛瘀止痛作用[7]。苦菜中有多種成分具有抗氧化性,韓陽陽等[10]研究了苦菜不同部位提取物的抗氧化活性,但苦菜不同部位營養成分含量的差異性及與其抗氧化能力的關系鮮見報道。尼古丁中毒的蛇是尼古丁刺激神經系統中煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs),從而產生生物學效應,內源性神經遞質是乙酰膽堿(ACH)[11-14]。本實驗室首次從小鼠體內探討了苦菜對尼古丁急性中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響[14]。

本文主要利用紫外-可見分光光度法對苦菜不同部位提取液中多糖、黃酮、酚酸、皂苷等營養成分進行測定,并通過考察苦菜不同部位提取液的抗氧化能力以及對尼古丁急性中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響,探究苦菜營養成分與其生理活性的關系。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

苦菜(山苦荬,采于河北保定田間,經河北農業大學生命科學學院植物學系馮大領老師鑒定為菊科苦荬菜屬植物苦菜Ixerischinxensis),鮮苦菜洗凈自然晾干后高速粉碎成粉末;實驗動物:雄性昆明種小鼠(18～22 g),32只,購于北京阜康生物科技有限公司。動物許可證號為SCXK(京)2009-0004;冰乙酸,高氯酸、無水碳酸鈉,十二烷基磺酸鈉,鐵氰化鉀、三氯化鐵、溴甲酚綠,無水氯化鋁,苯酚、硫酸銅亞硝酸鈉、硼酸,硫酸鉀天津市塘沽區新華化工廠;鄰苯二甲酸氫鉀天津市化學試劑研究所;以上試劑均為分析。純葡萄糖、蘆丁、熊果酸、綠原酸、香草醛,DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(北京中生瑞泰科技有限公司),以上試劑均為標準品99%;尼古丁,陜西弘康生物科技有限公司提供;乙酰膽堿(ACH)測定試劑盒南京建成生物工程研究所。

可見分光光度計722N上海精密科技儀器有限公司;紫外-可見分光光度計TU-19011,北京普析通用有限責任公司;臺式高速離心機德國艾本德股份公司;超聲波清洗器(B32005T,40 KHZ,必能信超聲有限公司);RE_52A旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠;Thermo Scientific全波長酶標儀美國Thermo fisher scientific公司。

1.2苦菜不同部位有效成分的提取

分別稱取苦菜各部位粉末(根、花、莖、葉)0.5000 g于錐形瓶中,用70%乙醇30 mL于室溫下超聲(40 kHZ)30 min,離心后取上清液,備用。測定苦菜不同部位皂苷、黃酮、多糖、酚酸含量及其抗氧化活性[15-19]。

干苦菜葉提取物(根、葉):取干苦菜5 g(根或葉),按料液比1∶60(質量比)加入70%乙醇溶液,加熱至沸騰2 min,超聲30 min,離心后取上清液,50 ℃旋轉蒸去乙醇后加水25 mL超聲溶解,用于喂食尼古丁急性中毒小鼠,測定其對血清乙酰膽堿含量影響。

1.3各營養成分的測定方法

1.3.1總皂苷含量的測定參考文獻[15]準確配制100 μg/mL熊果酸標準溶液。梯度吸取熊果酸標液于試管中,水浴真空抽干溶劑,加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.6 mL和0.8 mL高氯酸,搖勻,60 ℃下水浴加熱15 min,取出后立即用冰水冷卻10 min,加入5 mL冰乙酸,搖勻后靜置20 min,以空白溶液作為對照,在最大吸收波長548 nm下測定其吸光度。

吸取0.1 mL試樣于試管中水浴真空抽干溶劑后,作與標準液相同的顯色處理,在最大吸收波長548 nm下,以70%乙醇作上述同樣處理做空白,測定其吸光度。

1.3.2黃酮含量的測定參考文獻[16-17]梯度吸取0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液分別置于10 mL的試管中,先用30%的乙醇補至5 mL,再分別加入10%硝酸鋁0.3 mL,靜置5 min,加入5%亞硝酸鈉0.3 mL,靜置5 min,加入4%氫氧化鈉3 mL,最后用30%乙醇定容至10 mL,搖勻,靜置15 min,以空白溶液作為對照,在510 nm下測其吸光度。

取1.0 mL苦菜各部位提取液于試管中,與上述的蘆丁做相同的顯色處理,以70%乙醇作上述同樣處理做空白,在510 nm下測定其吸光度。

1.3.3多糖含量的測定參考文獻[18]梯度吸取1 mg/mL的葡萄糖標準溶液于25 mL容量瓶,按糖液∶顯色液=1∶5比例加入試管,震蕩混勻,置于沸水浴中保溫30 min,取出冷卻至室溫,以空白溶液作對照,在490 nm波長下測定吸光度。

取0.1 mL苦菜各部位提取試液于試管中,加5 mL苯酚-濃硫酸顯色液,混勻后于沸水中保溫30 min后取出冷卻至室溫,然后以70%乙醇作上述同樣處理做空白,在490 nm下測定吸光度。

1.3.4酚酸含量的測定參考文獻[16]梯度吸取35.0 μg/mL綠原酸標準溶液分別置于容量瓶(25 mL),加無水乙醇(5.0 mL),搖勻后加入0.3% 十二烷基磺酸鈉溶液(2.0 mL)、1%鐵氰化鉀-1%三氯化鐵(體積比1∶1)混合液(2.0 mL),混勻放于暗處5 min后,用0.1 mol/L鹽酸稀釋定容至25.0 mL,再于暗處放置20 min,以空白作對照,在最大吸收波長634 nm 處測定其吸光度。

吸取0.2 mL苦菜各部位提取液于25 mL的容量瓶中,與上述綠原酸做相同的顯色處理,以70%乙醇作上述同樣處理做空白,在最大吸收波長634 nm下測定其吸光度。

1.4苦菜不同部位提取液抗氧化能力的測定

[19]梯度吸取50.0μg/mL的DPPH標準溶液0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL分別置于試管中,用70%乙醇溶劑稀釋至4 mL,搖勻,以70%乙醇作上述同樣處理做空白,在最大吸收波長519 nm下測定吸光度。

取1 mL DPPH溶液于試管中,加入70%乙醇3 mL,在最大吸收波長519 nm下測定吸光度A0(溶劑與DPPH溶液混合后的吸光度);同理,取1 mL DPPH溶液于試管中,加入苦菜樣品提取液3 mL,測定吸光度A1(樣品與DPPH作用后的吸光度);吸取苦菜樣品提取液3 mL,加入70%乙醇稀釋至4 mL,測定吸光度A2(樣品溶液的吸光度)。

苦菜樣品對DPPH自由基的清除率(scavenging activity,SA),可表示為:

SA(%)=1-(A1-A2)/A0×100

1.5苦菜不同部位對尼古丁急性中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響

32只小鼠隨機分為模型對照組、苦菜葉組、苦菜根組和陰性對照組[14],每組8只小鼠。陰性對照組背部皮下注射0.9%氯化鈉注射液,其余三組均背部皮下注射0.6 mg/mL的尼古丁溶液(小鼠尼古丁急性中毒劑量),注射量均為0.1 mL/10 g·bw。注射后即刻等體積苦菜提取液灌胃(灌胃量均為0.2 mL/10 g·bw),模型對照組和陰性對照組灌胃蒸餾水,其他組灌胃相應的苦菜樣品,灌胃后45 min摘眼球取血,血液凝固后于4 ℃,3500 r/min離心15 min,分離血清,-28 ℃冰箱冷凍保存待測血清乙酰膽堿含量[14]。

表1　相關標準物質的標準曲線

表2　苦菜不同部位營養成分含量的比較(單位:mg/g)

表3　苦菜不同部位提取物抗氧化能力的比較

2　結果與討論

2.1相關標準曲線

表1為各有效成分及抗氧化性測定的標準物質的標準曲線,可見各標準物質在測定范圍內相關性良好。

2.2苦菜不同部位提取物營養成分含量

苦菜不同部位及全草提取物營養成分含量見表2,結果可知苦菜花、根、葉、莖中都含有多糖、黃酮、酚酸、皂苷等營養成分,且含量存在明顯的差異。多糖、皂苷含量為根>葉>花>莖;黃酮、酚酸含量為葉>花>莖>根。苦菜全草各營養成分與葉最為相似。

從“人民群眾是歷史的創造者”，到“人民對美好生活的向往，就是我們的奮斗目標”，以人民為中心的發展思想，指明改革發展的力量源泉和根本目的，成為新時代改革開放的邏輯起點和強勁引擎。

2.3苦菜不同部位提取物抗氧化能力的差異性

由表3可知,苦菜不同部位及全草提取物對DPPH自由基都有一定的清除能力,苦菜各部位提取液抗氧化性強弱順序為葉>花>莖>根;且花、莖、根抗氧化能力相差不大,根據2.2苦菜不同部位提取物營養成分含量分析,苦菜抗氧化性與苦菜黃酮、酚酸含量順序一致、而與多糖、皂苷含量相關不大。可以初步推斷其抗氧化性與苦菜黃酮、酚酸含量有關,需進一步研究。

2.4苦菜根、葉提取物對尼古丁中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響

如上所知苦菜根、葉成分相差比較大,所以主要考察苦菜根、葉提取物對尼古丁中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響,如圖1所示。數據均采用SPSS 17.0數據分析軟件對數據進行單因素方差分析,差異顯著性水平α設為0.05。實驗結果表明:方差分析結果表明苦菜葉組和苦菜根組與模型對照組小鼠血清乙酰膽堿含量之間差異顯著(p<0.05),且對尼古丁中毒小鼠出現的血清乙酰膽堿含量升高有一定抑制作用。模型對照組小鼠血清乙酰膽堿含量高出陰性對照組30%,苦菜葉組和苦菜根組小鼠乙酰膽堿含量明顯降低,苦菜根組小鼠乙酰膽堿含量略低于苦菜葉組,差異不大,但高于陰性對照組。根據2.2苦菜不同部位提取物營養成分含量分析,說明苦菜對尼古丁中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響主要與皂苷含量相關。

圖1　苦菜根、葉對尼古丁急性中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響Fig.1　The effect of different part of Ixeris chinxensis on serum ACH content in nicotine acute poisoning mice

3　結論

苦菜不同部位多糖、黃酮、酚酸、皂苷等有效成分含量存在明顯的差異;多糖、皂苷含量由大到小順序為根>葉>花>莖;黃酮、酚酸含量為葉>花>莖>根。苦菜的花、根、葉、莖對DPPH自由基都有一定的清除能力,抗氧化能力為葉>花>莖>根,與黃酮、酚酸含量順序一致,說明抗氧化能力與黃酮、酚酸含量有關,與多糖、皂苷相關不大;同理,苦菜根、葉提取物都對尼古丁中毒小鼠出現的血清乙酰膽堿含量升高有一定抑制作用,且相差不大,聯系苦菜不同部位營養成分可推測苦菜皂苷是影響尼古丁中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的主要因素,苦菜各營養成分有待進一步提純,深入研究其功用機理。

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Determination of nutritious components and physiological activities of different parts ofIxerisChinensis(Thunb.)Nakai

HUO Li1,2,SUO Ran1,NING Li1,WANG Jie1，*

(1.College of Horticulture,Agricultural University of Hebei,Baoding Hebei 071000 2.College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding Hebei 071000)

Different parts ofIxerisChinensis(Thunb.)Nakai(root,stem,leaf and flower)were extracted with 70% ethanol using ultrasonic extraction for 30 min. The contents of polysaccharide,flavonoids,phenolic acid and saponins extracted from four different parts were determined respectively. The antioxidant activity of extracts and the effect of acetylcholine content on nicotine acute poisoning in mice were investigated. The results showed that the difference was obvious among the nutritious components of different parts ofIxerisChinensis. The order of content of polysaccharide and flavonoids:root>leaf>flower>stem;the order of content of saponins and phenolic acid:leaf>flower>stem>root. The order of the antioxidant activity of the extracts:leaf>flower>stem>root. It sugessted that the antioxidant activity was mainly associated with flavonoid,phenolic acids,and the extracts had both certain inhibition to the acetylcholine on nicotine acute poisoning in mice. The results provided the theoretical base for the development ofIxerisChinensis.

IxerisChinensis;nutritious components;physiological activities

2015-03-25

霍莉 (1972-)，女，博士后，教授，研究方向：食品分析，E-mail：huolichenchen@sina.com。

王頡

河北省2012年度博士后基金(JFS-2012-13001)；國家自然科學基金(31071580)。

TS201

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000