FAK對黑米花青素抑制HER-2陽性乳腺癌轉移的影響研究

周　杰,陳祥燕,陳靜瑤,李　飛,朱彥鋒,余小平

(成都醫學院公共衛生系,四川成都 610500)

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FAK對黑米花青素抑制HER-2陽性乳腺癌轉移的影響研究

周杰,陳祥燕,陳靜瑤,李飛,朱彥鋒,余小平*

(成都醫學院公共衛生系,四川成都 610500)

目的:探討粘著斑激酶(Focal Adhesion Kinase,FAK)在黑米花青素(Black Rice Anthocyanins,BRACs)抑制人表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor-2;HER-2)陽性乳腺癌轉移中的作用。方法:以正常永生化乳腺細胞MCF-10A、HER-2陰性乳腺癌細胞MCF-7、HER-2陽性乳腺癌細胞MDA-MB-453為研究對象,使用Cell Counting Kits-8(CCK8)試劑盒檢測細胞活性;傷痕愈合實驗檢測細胞轉移狀態;免疫印跡實驗測定FAK、cSrc表達及磷酸化水平;免疫共沉淀實驗檢測HER/FAK蛋白間相互作用。結果:與對照組相比,分別用50、100、200、400 μg/mL BRACs處理MDA-MB-453細胞后,抑制率分別為18.74%、21.06%、22.82%、40.12%;200 μg/mL BRACs處理后MDA-MB-453細胞遷移距離減少37%;FAK及cSrc磷酸化水平降低,HER-2/FAK蛋白間相互作用減弱。結論:BRACs通過減弱FAK與HER-2受體相互作用抑制FAK及cSrc磷酸化從而抑制MDA-MB-453細胞增殖和轉移,這可能是黑米花青素抑制MDA-MB-453細胞增殖和轉移的分子機制之一。

人表皮生長因子受體2,乳腺癌,轉移,粘著斑激酶

乳腺癌占全球癌癥病例的25%,患癌女性死亡病例中乳腺癌患者占15%[1],極大威脅著女性健康。黑米花青素(BRACs)是來源于黑米皮中的黃酮類植物化學物質,現有研究資料證實這類化合物具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等生物學效應[2-3]。已有研究表明,BRACs具有抑制HER2陽性乳腺癌血管生成、促進細胞凋亡作用[4]。在裸鼠MDA-MB-453移植瘤模型中,灌胃黑米花青素腫瘤增長速度減緩、腫瘤生長體積減小[5]。粘著斑激酶(FAK)是一種非受體酪氨酸激酶,主要作用是在整合素及黏著斑的作用下調節細胞表面受體從而參與調節細胞生理過程,FAK在多類腫瘤細胞中表現為過表達狀態[6]。研究表明FAK通過整合素介導的信號通路參與調節細胞遷移和粘附[7],HER-2/HER-3受體信號通路通過在Y397、Y861以及Y925位點引起FAK磷酸化從而促進腫瘤侵襲[8],Vadlamudia等人發現HER-2受體能通過cSrc/FAK信號通路調節乳腺癌細胞轉移能力[9]。本研究探討BRACs對HER-2陽性乳腺癌細胞抗轉移效應及FAK和cSrc對其抗轉移效應的影響。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

BRACs吉林新星天然藥物公司(花青素含量43.2%);L-15不完全培養基凱基生物;DMEM高糖不完全培養基、DMEM/F12高糖不完全培養基美國Hyclone公司;胎牛血清、馬血清美國Gbico公司;胰島素日本Wako公司;EGF美國Peprotech公司;磁珠美國millipore公司;BCA試劑盒美國Thermo公司;鼠多克隆抗體Anti-HER-2、兔單克隆抗體Anti-FAK、鼠單克隆抗體Anti-cSrc、兔多克隆抗體Anti-Phospho-FAK(Y861)、兔多克隆抗體Anti-Phospho-cSrc(Y216)英國Abcam公司。

IX71倒置顯微鏡日本Olympus公司;XS2酶標儀中國BioTek公司;Thermo Scientific Forma 3110 CO2培養箱美國Thermo公司;PowerPacTMHC電泳儀美國Bio-RAD公司。

1.2細胞培養及分組

人乳腺癌細胞MDA-MB-453(雌激素受體陰性ER-,HER-2/neu高表達)中國科學院上海細胞庫,含10%胎牛血清的L-15培養基常規培養;人乳腺癌細胞MCF-7(雌激素受體陽性ER+,HER-2/neu弱表達或不表達)中國科學院上海細胞庫,含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基常規培養;人正常上皮永生化細胞MCF-10A第三軍醫大學糜漫天教授惠贈,DMEM/F12培養基(5%馬血清、20 ng/mL EGF、10 μg/mL胰島素、0.5 μg/mL氫化可的松、100 μg/L霍亂毒素)常規培養。實驗分為2組:空白對照組、BRACs處理組,處理濃度根據以往研究資料[10],設定為200 μg/mL,處理時間為24 h。

1.3CCK-8法檢測BRACs對細胞增殖的影響

將MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-453細胞調整細胞數至104個/mL,取100 μL接種于96孔板,培養24 h后加入終濃度為(0、50、100、200、400)μg/mL BRACs,每組設3個復孔。培養24 h,每孔加入10 μL CCK-8,繼續培養3 h,于450 nm處測定吸光度(A)值。增殖率(proliferation rate,PI)=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.4傷痕愈合實驗檢測細胞遷移能力

MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-453細胞接種于24孔培養板,待細胞生長至90%密度,劃痕處理,加入無血清培養基,分別用0、200 μg/mL BRACs處理細胞24 h后于相差顯微鏡下觀察細胞遷移變化,用ImageJ軟件計算各組劃痕區域寬度平均遷移距離。

1.5Western Blot檢測蛋白表達

Western Blot檢測HER-2、FAK蛋白表達及FAK磷酸化水平。收取各實驗組細胞總蛋白,用BCA法測定濃度,取100 μg總蛋白進行凝膠電泳后轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),含10%脫脂牛奶的TBST封閉1 h,1∶1000稀釋抗體4 ℃孵育過夜,TBST(含0.1%Tween-20的TBS緩沖液)漂洗3次(10 min/次),1∶2000稀釋二抗室溫孵育1h,TBST漂洗(3次,10 min/次)后進行化學發光法顯色,Quantity One 軟件分析結果。

1.6免疫共沉淀檢測蛋白相互作用

Co-IP檢測HER-2與FAK的相互關系。取細胞總蛋白,等量蛋白(1000 μg)液中加入HER-2抗體及免疫磁力珠進行免疫沉淀,SDS-PAGE電泳,轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上,然后加入FAK抗體4 ℃孵育過夜,HRP 結合的二抗37 ℃孵育2 h,ECL增強化學發光法檢測蛋白間相互作用,并進行圖像定量分析。

1.7統計學分析

實驗數據用x±S表示,采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),組間比較采用t檢驗。

2　結果與分析

2.1BRACs對MDA-MB-453細胞增殖的影響

BRACs分別處理正常乳腺上皮MCF-10A細胞、HER-2陰性乳腺癌MCF-7細胞以及HER-2陽性乳腺癌MDA-MB-453細胞24 h以后,用CCK8試劑盒檢測細胞活性。如圖1所示,BRACs對MCF-10A細胞活性無明顯影響(p>0.05),50、200 μg/mL BRACs處理后MCF-7細胞活性有適當減少,無統計學意義(p>0.05),BRACs抑制了MDA-MB-453細胞的活性呈劑量依賴效應,與未加BRACs對照組相比,50、100、200、400 μg/mL BRACs對MDA-MB-453細胞抑制率分別為18.74%、21.06%、22.82%、40.12%(p<0.05)。

圖1　BRACs對MDA-MB-453細胞活性的影響Fig.1　Effects of BRACs on the cell viability of MDA-MB-453 cells

2.2BRACs對MDA-MB-453細胞遷移的影響

細胞遷移是腫瘤細胞發生轉移的重要過程,遷移有利于細胞從原來位置遷移到其他器官從而促進轉移發生。BRACs處理MCF-10A、MCF-7以及MDA-MB-453三種細胞24 h后于相差顯微鏡下觀察細胞遷移變化,用ImageJ軟件計算各組平均遷移距離。如圖2所示,與MCF-10A細胞相比,BRACs抑制了乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-453細胞的遷移能力。200 μg/mL BRACs分別作用于MCF-7、MDA-MB-453細胞后,與未加BRACs對照組相比,MCF-7遷移距離與未加BRACs對照組相比降低了28%;MDA-MB-453細胞遷移距離相比未加BRACs對照組降低了37%,(p<0.05)。

圖2　BRACs對MDA-MB-453細胞遷移的影響Fig.2　Effects of BRACs on the migration of MDA-MB-453 cells注:圖A:a:對照組;b:200μg/mL BRACs組。

2.3BRACs對FAK磷酸化水平的影響

cSrc/FAK信號通路在調節HER-2陽性乳腺癌細胞轉移中發揮著重要作用[9],使用免疫印記法(western blot)檢測BRACs對HER-2陽性乳腺癌細胞cSrc、FAK磷酸化的影響,如圖3所示,200 μg/mL BRACs分別作用于MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-453細胞后,cSrc、FAK總表達量沒有變化,cSrc、FAK磷酸化水平下降,BRACs降低了HER-2陽性乳腺癌MDA-MB-453細胞FAK的磷酸化,抑制了cSrc/FAK信號通路的激活。

圖3　BRACs對FAK和cSrc磷酸化水平的影響Fig.3　Effects of BRACs on the phosphorylation of FAK and cSrc

2.4BRACs對HER-2與FAK蛋白間相互作用的影響

已有研究表明FAK在HER-2/HER-3誘導的乳腺癌發生及侵襲中發揮重要作用[11],HER-2激活具有召集FAK誘導其磷酸化的能力,HER-2活化引起HER-2與FAK之間相互聯系增加,選用免疫共沉淀法檢測HER-2/FAK相互作用。先將人抗HER-2抗體、免疫磁力珠與樣品蛋白免疫共沉淀以后檢測FAK蛋白含量的變化。MDA-MB-453細胞為HER-2高表達乳腺癌細胞,如圖4所示,選用HER-2抗體沉淀樣品蛋白后MDA-MB-453組FAK信號更強,MDA-MB-453細胞經200μg/mL BRACs處理后,FAK信號減弱,這表明HER-2/FAK蛋白間相互聯系減弱,BRACs可能是通過減弱HER-2與FAK的相互結合從而抑制FAK極其下游蛋白的磷酸化。

圖4　BRACs對HER-2與FAK蛋白間相互結合的影響Fig.4　Effects of BRACs on the associationbetween HER-2 and FAK

3　討論

HER-2是表皮生長受體家族的一員,20%～30%乳腺癌患者都表現為HER-2過表達狀態,而HER-2過表達會抑制腫瘤細胞凋亡,增加腫瘤血管增生,造成病人預后不良和復發[12-13]。有研究表明,黑米花青素(BRACs)能抑制HER-2陽性乳腺癌移種移植瘤血管形成,抑制瘤體生長;抑制裸鼠肺轉移瘤增殖,促進移植瘤細胞凋亡[14-15]。

FAK是一個非受體酪氨酸激酶,在肝細胞癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等癌癥中都表現為過表達狀態,這使其成為一個治療靶點[16]。HER-2/3受體高表達能促進FAK激活及其Y397、Y861和Y925位點磷酸化,FAK的磷酸化會通過激活下游FAK/Src/p130Cas信號通路調節細胞運動和粘附能力,從而造成腫瘤轉移發生[17]。

本實驗研究表明,BRACs處理HER-2陽性乳腺癌MDA-MD-453細胞后,細胞活性下降,抑制細胞增殖,細胞遷移和侵襲能力減弱;通過免疫印跡實驗可以發現細胞FAK、cSrc磷酸化水平下降且HER-2與FAK蛋白間相互作用減弱。這表明BRACs在體外實驗中能抑制HER-2陽性乳腺癌細胞遷移能力,且BRACs處理后FAK、cSrc磷酸化水平下調,HER-2/FAK蛋白間相互作用減弱,本課題組前期研究表明BRACs能與HER-2直接結合發揮抑制轉移作用[18],這提示FAK在HER-2介導的陽性乳腺癌轉移中發揮重要作用,BRACs可能通過抑制cSrc、FAK磷酸化以及抑制HER-2與FAK結合抑制其激活從而發揮抗HER-2陽性乳腺癌轉移作用。但對于FAK在BRACs抗HER-2陽性乳腺癌中的具體機制需要進一步的研究。

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Role of focal adhesion kinase in black rice anthocyanins inhibiting HER-2 positive human breast cancer cells

ZHOU Jie,CHEN Xiang-yan,CHEN Jing-yao,LI Fei,ZHU Yan-feng,YU Xiao-ping*

(Department of Public Health,Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China)

Objective:To explore the role of focal adhesion kinase in HER-2 positive human breast cancer cells anti-metastasis by black rice anthocyanins(BRACs). Methods:To observe the effect of BRACs on the proliferation of MCF-10A,MCF-2 and MDA-MB-453 cells with CCK8 method. Metastasis of MCF-10A,MCF-2 and MDA-MB-453 cells were detected by wound healing experiments. The level of total and phosphorylated FAK and cSrc were detected by western blot. The interaction between HER-2 and FAK were analyzed by immunoprecipitation Results:Different concentration of BRACs including 50,100,200,400μg/mL were used to detect the influence which BRACs play on the growth MDA-MB-453 cells. Compared with control,the inhibition ratio of each group were 18.74%,21.06%,22.82%,40.12% respectively. The migration distance of MDA-MB-453 cells was decreased 37% by 200 μg/mL BRACs. The level of phosphorylated FAK and cSrc were reduced by BRACs and the interaction between HER-2/FAK was also decreased by BRACs. Conclusion:BRACs suppress the metastasis of HER-2 positive breast cancer cells via inhibiting the phosphorylation of FAK and cSrc by decrease the interaction between FAK and HER-2 which maybe a mechanism of anti-metastasis by BRACs.

HER-2;Breast carcinoma;metastasis;FAK

2015-07-13

周杰(1990-)，女，碩士在讀，研究方向：植物化學物抗腫瘤分子機制研究，E-mail:bravezhoujie@sina.com。

余小平(1970-)，男，博士后，教授，研究方向：植物化學物抗腫瘤分子機制研究,E-mail:cyggwsyxp@sina.com。

國家自然科學基金資助項目(81273074)；國家自然科學基金資助項目(81573154)；四川省青年科技創新研究團隊項目(2014TD0021)；四川省省屬高校科研創新團隊項目(14TD0023)；成都醫學院學科建設項目(CYXK2012010)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000