沉默GLUT-1表達對食管鱗癌細胞株TE-TE-1313增殖和遷移的影響△

陳濤　劉小興　陳虞梅　施一平　萬良榮　劉建軍上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院核醫學科，放療科，上海007

沉默GLUT-1表達對食管鱗癌細胞株TE-TE-1313增殖和遷移的影響△

陳濤1*#劉小興2*陳虞梅1施一平1萬良榮1劉建軍1
上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院1核醫學科，2放療科，上海200127

目的研究沉默葡萄糖轉運蛋白-1（glucose transporter protein-1，GLUT-1）的表達對食管鱗癌TE-13細胞增殖、周期及遷移的影響及可能的作用機制。方法采用慢病毒轉染的方法將特異性針對GLUT-1基因的GLUT-1-shRNA轉入TE-13細胞，建立穩定干擾GLUT-1表達的TE-13細胞株，分成GLUT-1-shRNA組和陰性對照組進行對比研究。采用實時熒光定量PCR和蛋白質印跡法檢測GLUT-1-shRNA對TE-13細胞GLUT-1 mRNA及其蛋白表達的影響。CCK-8法、FCM法和Transwell小室遷移實驗分別檢測沉默GLUT-1表達后對TE-13細胞增殖、細胞周期和遷移的影響；同時采用蛋白質印跡法檢測細胞遷移以及乏氧相關蛋白的表達情況。結果采用慢病毒將GLUT-1-shRNA轉入TE-13細胞后，可明顯下調GLUT-1蛋白（t=6.713，P<0.01）和mRNA的表達水平（t= 4.181，P<0.05）。與陰性對照組相比，GLUT-1干擾后細胞的增殖至72 h（t=3.097，P<0.05）和96 h（t=3.497，P<0.05）明顯被抑制，同時細胞的遷移能力可見下降，但是細胞周期至24 h未見影響；基質金屬蛋白酶的MMP-9（t= 6.895，P<0.01）和缺氧誘導因子HIF-1α（t=13.74，P<0.001）的表達明顯下調，但是MMP-2的表達沒有變化（t= 2.582，P>0.05）。結論沉默GLUT-1的表達可抑制食管磷癌細胞株TE-13細胞的增殖和遷移，并明顯下調細胞內MMP-9和HIF-1α蛋白的表達，為尋找靶向治療食管癌新靶點提供了初步的實驗基礎。

食管鱗癌；GLUT-1；增殖；細胞周期；遷移

Oncol prog,2016,14(1)

食管癌是常見的消化系統的惡性腫瘤，其發病率在世界上排名惡性腫瘤的第七位[1]。中國是世0界上食管癌的高發地區，發病率位列惡性腫瘤的第四位[2]。食管癌惡性程度高、預后差，盡管隨著手術方式以及放、化療等治療模式的不斷改進，其遠期生存率有所提高，但是經過幾次大樣本的調查之后發現，總的術后5年生存率仍舊為25%～40%[3-4]。近年來各種分子靶向治療方法有效地控制了腫瘤的生長和擴散，在延長腫瘤患者生存期、降低患者病痛方面取得了一定的效果[5]。但是，關于食管癌的分子靶向治療的研究甚少。因此，尋求新的食管癌分子靶向治療方法迫在眉睫。

惡性腫瘤組織生長速度快，對能量的需求遠大于正常組織，即使是在有氧狀態下，惡性腫瘤細胞仍以活躍的葡萄糖酵解這一特征性生化代謝模式作為其能量的主要提供者[6]。然而，1分子葡萄糖經無氧糖酵解產生的三磷酸腺苷（ATP）僅為有氧三羧酸循環的1/18[7]，因此，為了滿足腫瘤細胞的這種代謝特征，需要攝取大量的葡萄糖[8-9]。大多數哺乳動物組織細胞攝取葡萄糖的過程都需要膜結合糖蛋白家族即易化葡萄糖轉運載體家族（facilitates glucose transporters，GLUT）的參與[10]。

GLUT的功能是攝取和轉運葡萄糖進入胞質，到達細胞葡萄糖代謝的主要場所——線粒體，它是關鍵的細胞能量代謝調節器[10]。目前發現GLUT家族共有14種亞型，其中GLUT-1在人類不同來源的惡性腫瘤中表達水平明顯升高[11-12]。應用食管癌術后的組織病理免疫組化分析研究表明[13-14]，腫瘤細胞膜表面GLUT-1過度表達與食管癌的生長、侵襲、轉移及預后生物學行為密切相關。Kato等[15]通過正電子發射斷層顯像（PET）與術后病理比較發現，食管鱗癌氟化去氧葡萄糖（FDG）攝取程度與GLUT-1密切相關，且FDG高攝取及GLUT-1高表達的食管癌患者預后明顯差于FDG低攝取及GLUT-1低表達者。因此，調低或抑制食管癌細胞膜表面GLUT-1蛋白的表達，是否能夠降低或抑制食管癌細胞的生長增殖以及侵襲遷移成為我們關注的焦點。

本研究選擇食管鱗癌細胞株TE-13作為惡性腫瘤研究對象，采用以慢病毒為載體介導的RNA干擾（RNAi）技術，通過控制腫瘤細胞內調節細胞膜表面GLUT-1蛋白合成的靶基因，抑制或調低腫瘤細胞膜表面GLUT-1蛋白的表達，進而觀察RNA干擾GLUT-l蛋白表達對食管鱗癌細胞株TE-13的生長增殖、遷移以及相關蛋白如基質金屬蛋白酶-9 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）等表達的影響，尋找抑制食管鱗癌細胞生長和侵襲的新路徑和方法。

1　材料與方法

1.1細胞、試劑及儀器

人食管鱗癌細胞株TE-13購自上海美軒生物科技有限公司。攜帶有針對GLUT-1基因的shRNA（GLUT-1-shRNA）和陰性對照（negative control，NC）的shRNA（NC-shRNA）的重組慢病毒載體購自上海吉瑪制藥技術有限公司。GLUT-1-shRNA序列為5′-GCATCAACGCTGTCTTCTATT-3′；NC-shRNA序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。達爾伯克必需基本培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）和胎牛血清購自美國Gibco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和CCK-8試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所；RNA抽提試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司。兔抗人β-actin、HIF-1α、MMP-9和MMP-2單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；小鼠抗人GLUT-1多克隆抗體購自美國Proteintech公司；ECL試劑盒購自美國Millipore公司；反轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；嘌呤霉素購自美國Sigma公司；細胞組織快速裂解液（RAPI裂解液）購自美國Thermo公司。聚合酶鏈反應（polymerase chainReaction，PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成。其他試劑均為國產分析純。PCR擴增儀為美國Applied Biosystems公司產品，酶標儀為美國Bio Tek公司產品；流式細胞儀為美國Becton-Dickinson公司產品；凝膠成像儀為美國Bio-Rad公司產品。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養將食管鱗癌TE-13細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養液中，置于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱培養、傳代。取對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.2.2病毒轉染接種對數生長期的細胞，按5× 104/孔的密度接種于12孔板中，分別于接種后次日更換培養液并向各組細胞中分別加入病毒液進行轉染，感染復數（multiplicity of infection）為20。實驗分為2組：①GLUT-1-shRNA組，以攜帶有GLUT-1-shRNA的慢病毒轉染TE-13細胞；②陰性對照組，以攜帶有NC-shRNA的慢病毒轉染TE-13細胞。病毒轉染24 h后更換培養液，72 h后加入嘌呤霉素（終質量濃度為2 μg/ml）篩選細胞。待細胞生長至融合度為80%，行常規傳代培養。

1.3檢測方法

1.3.1實時熒光定量PCR檢測TE-13細胞中GLUT-1 mRNA的表達將穩定轉染shRNA后的GLUT-1-shRNA組和陰性對照組TE-13細胞，按1× 105/孔的密度接種于6孔板，培養24 h后收集細胞，棄培養液，預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗細胞2遍，加入Trizol提取總RNA，用紫外分光光度計測定波長比值為260 nm/280 nm的光密度（optical density，OD）值為1.8～2.0，檢測總RNA的濃度和純度。采用反轉錄試劑盒將提取獲得的總RNA反轉錄合成cDNA，取轉錄獲得的cDNA 1 mg進行實時熒光定量PCR反應。GLUT-1基因上游引物序列為5′-TGTGGATTGAGGGTAGGAGGT-3′，下游引物序列為5′-TGAGCAAGAGGACACTGATGA-3′，內參照GAPDH上 游 引 物 序 列 為 5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3′，下游引物序列為5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3′，每組樣品均設3個重復孔。PCR反應條件如下：第一步，95℃預變性30 s；第二步，95℃5 s、60℃30 s，共40個循環。以每個反應管內的熒光信號到達設定域值時所經歷的循環數為Ct值，用2-δδCt法計算目的基因的mRNA相對表達水平。實驗重復3次。

1.3.2蛋白質印跡法檢測細胞中GGLLUUTT-- 11、MMMMPP-- 22、MMMMPP-- 99和HHIIFF-- 11 α蛋白的表達將穩定轉染shRNA后的GLUT-1-shRNA組和陰性對照組TE-13細胞，按1×105/孔的密度接種于6孔板，培養24 h后收集細胞，預冷的PBS漂洗細胞2遍，用RAPI提取細胞蛋白，取裂解好的蛋白樣品上樣，進行10%SDSPAGE電泳，經濕轉至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），麗春紅染色觀察各電泳帶的蛋白表達量。以5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，分別加入小鼠抗人GLUT-1多克隆抗體和兔抗人MMP-2、MMP-9、HIF-1α單克隆抗體（稀釋比例均為1∶1000）以及內參照β-actin單克隆抗體（稀釋比例為1∶1000），4℃孵育過夜，TBST漂洗4次，每次10 min，再加入二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG，均按1∶3000稀釋），室溫孵育1 h，TBST漂洗6次，每次10 min，最后以化學發光液顯色，凝膠成像儀顯像。使用Image J軟件進行圖像分析，以目的蛋白條帶的灰度值與內參照βactin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。實驗均重復3次。

1.3.3CCK- 8檢測細胞增殖取對數生長期的GLUT-1-shRNA組和陰性對照組細胞，以3000/孔接種于96孔板。待細胞貼壁后，分別在24、48、72 和96 h時間點，每孔加入CCK-8 10 μl繼續培養1 h，在酶標儀450 nm波長下檢測各孔OD值，以此反映細胞增殖能力。每組設3個復孔。實驗重復3次。

1.3.4FCM法檢測細胞周期將穩定轉染shRNA后的GLUT-1-shRNA組和陰性對照組TE-13細胞制備單細胞懸液，分別于12、24 h收集細胞，用預冷的70%的乙醇溶液于-20℃固定細胞3 h，離心收集細胞，PBS漂洗1次，加入500μl含50μg/ml碘化丙啶及100μg/mlRNase A的PBS，4℃避光染色30 min，流式細胞儀上機檢測。實驗重復3次。

1.3.5Transwell遷移實驗檢測細胞遷移能力收集GLUT-1-shRNA組和陰性對照組對數期細胞，用無血清的DMEM培養液重懸后按6×104/孔的密度將細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入1ml含10%FBS的高糖DMEM培養液。培養72 h后取出小室，PBS漂洗2次，4%的多聚甲醛溶液固定15 min，用棉簽擦去上層細胞，加入0.1%結晶紫染色液染色15 min。自來水沖洗3次，顯微鏡拍照。實驗重復3次。

1.4統計學方法

采用Graphpad Prism 5軟件對所有的實驗數-據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間的比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1shRNA慢病毒轉染后TE-13細胞GLUT-1表達明顯降低

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，穩定轉染GLUT-1-shRNA的TE-13細胞中GLUT-1 mRNA的表達水平較陰性對照組明顯下調（t=4.181，P<0.05；圖1A）。

蛋白質印跡法檢測結果顯示，穩定轉染GLUT-1-shRNA的TE-13細胞中GLUT-1蛋白表達水平明顯低于陰性對照組（t=6.713，P<0.01；圖1B）。

2.2沉默GLUT- 1表達對食管鱗癌細胞TE-13增殖的影響

24、48、72、96h時CCK-8法檢測結果顯示，與陰性對照組細胞相比，穩定轉染GLUT-1-shRNA的TE-13細胞在24、48 h的增殖水平未見明顯變化，但是在72、96 h時GLUT-1-shRNA組細胞的增殖水平表現為明顯抑制（t=3.097，P<0.05；t=3.497，P< 0.05）。（圖2）

圖1　shRNA慢病毒轉染后TE-TE-1313細胞GLUT-GLUT-1 1表達

圖2 CCK-8法檢測陰性對照組與GLUT-1-shRNA組TE-13細胞增殖的比較

2.3沉默GLUT-1表達對食管鱗癌TE-13細胞周期分布的影響

FCM法檢測結果顯示，沉默GLUT-1的表達對食管鱗癌細胞TE-13細胞周期在12、24 h時均無影響。（圖3）

圖3　FCM檢測陰性對照組與GLUT-1-shRNA組TE-1313細胞周期的比較

2.4沉默GLUT- 1表達對食管鱗癌TTEE--1133細胞遷移能力的影響

Transwell小室遷移實驗檢測結果顯示（圖4），直觀評價見GLUT-1-shRNA組細胞較陰性對照組穿過小室膜的細胞數減少。

圖4　4　Transwellswell法檢測陰性對照組與GLUT-1-shRNAshRNA組TE-13細胞遷移的比較（×100100）

2.5沉默GLUT- 1表達對食管鱗癌TE-13細胞中MMP- 2、MMP- 9和HIF-1α蛋白表達的影響

蛋白質印跡法檢測結果見圖5。與陰性對照組相比，沉默GLUT-1表達后對TE-13細胞中MMP-2蛋白的表達無影響（t=2.582，P>0.05），而MMP-9和HIF-1α蛋白的表達水平則均被明顯下調（t=6.895，P<0.01；t=13.74，P<0.001），詳見圖6。

圖 5　陰性對照組與GLUT- 1-shRNA組TE-13細胞MMP-2、MMP- 9和HIF-1α表達的蛋白質印跡法檢測結果

圖6　蛋白質印跡法檢測陰性對照組與GLUT-1-shRNA組TE-13細胞MMP-2、MMP-9和HIF-1α 表達的比較

3　討論

GLUT是分布在哺乳動物細胞膜上的一類跨膜糖蛋白，幾乎存在所有的組織中，其主要功能是轉運葡萄糖跨過細胞膜進入細胞內，為細胞能量代謝提供基本的葡萄糖供應[10]。惡性腫瘤組織為了滿足其無序、快速增殖以及無氧糖酵解為主要能量代謝途徑的要求，通常在大多數腫瘤細胞表面呈現GLUT-1蛋白的異常高表達，來增加葡萄糖的攝取，并與腫瘤的惡性進展程度和侵襲轉移表現密切相關[6,11-12]。本研究利用慢病毒包裝質粒轉染食管鱗癌細胞TE-13，干擾其GLUT-1的表達，穩定轉染GLUT-1-shRNA慢病毒后的TE-13細胞的GLUT-1蛋白和mRNA表達水平明顯下降，表明本研究成功地建立了GLUT-1蛋白穩定低表達的食管癌細胞株。后續的細胞增殖實驗顯示：相比陰性對照組，GLUT-1干擾后TE-13細胞的增殖在72、96 h表現為明顯的抑制，考慮是由于TE-13細胞膜表面GLUT-1蛋白表達降低后，減少了葡萄糖通過GLUT-1進入細胞內的數量，降低了細胞的能量供給，即糖酵解的速率；同時，由于糖酵解速率的降低，致使糖酵解過程中產生的6-磷酸葡萄糖、丙酮酸數量減少，從而導致腫瘤細胞快速增殖所需的脂肪酸、核苷酸等合成降低，最終抑制了食管癌細胞的增殖[6]。這個結果有力地證實了選擇調低或抑制食管癌細胞GLUT-1蛋白的表達，將會有效抑制食管癌細胞的增殖。但是檢測的細胞周期結果顯示，沉默GLUT-1表達后TE-13的細胞周期在12、24 h未見明顯變化，這與增殖實驗中TE-13細胞在48 h內未見明顯增殖表現相吻合，可能由TE-13細胞的生長增殖特性所決定。

已知腫瘤的侵襲和轉移是一個多因素參與，多階段、多步驟完成的復雜過程[16]。其中糖酵解過程生成的乳酸轉移至細胞外可造成腫瘤組織微環境酸化，從而為腫瘤細胞侵襲和轉移做好了環境準備。同時，腫瘤細胞或周圍間質細胞分泌的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可以通過降解細胞外基質、調節細胞間黏附及促進新生血管形成來促進惡性腫瘤的侵襲和轉移，其中MMP-2、MMP-9是金屬蛋白酶家族中與腫瘤浸潤轉移關系最為密切的因子。對人體不同部位和組織所進行的研究顯示，MMP表達類型和組織類型之間存在著特定的緊密聯系。溫洪濤等[17]采用免疫組織化學和Westem blot法檢測了41例食管鱗癌組織及相應正常食管組織中MMP-2、MMP-9的表達發現：食管鱗癌組織中MMP-9的陽性表達率明顯高于正常組織，且與淋巴結轉移及靜脈侵襲顯著相關；而食管鱗癌組織中MMP-2的陽性表達率與蛋白相對表達量均明顯低于MMP-9，且與腫瘤淋巴結轉移及靜脈侵犯無關。而Liao等[18]的研究發現，抑制肺腺癌細胞A549的GLUT-1蛋白表達，通過GLUT-1/MT1-MMP/MMP-2通路降低MMP-2的表達，從而達到降低腫瘤侵襲轉移的目的。雖然目前尚未見有關食管鱗癌GLUT-1/MT1-MMP/ MMP通路的研究報道，但是我們的實驗發現：沉默GLUT-1表達后，食管鱗癌TE-13細胞的MMP-9蛋白表達明顯降低，而MMP-2蛋白的表達未見明顯的變化，提示我們在食管鱗癌細胞應該存在著GLUT-1/MT1-MMP/MMP-9的調控通路，可能在調控食管鱗癌腫瘤侵襲轉移上起著重要的作用，這有待于進一步的研究加以證實。同時進行的腫瘤細胞遷移實驗表明，沉默GLUT-1表達，使TE-13細胞的遷移能力降低，提示沉默GLUT-1表達后TE-13細胞遷移一定程度被抑制。研究表明，腫瘤細胞的遷移和對周圍組織、血管的侵襲是腫瘤細胞轉移的關鍵步驟，其發生與進展需要與細胞增殖、分化、移動的相關基因及其表達調控模式的改變和促進細胞移動的外界因素二者的共同作用[19]。武寧等[20]的研究發現，較高濃度的二甲雙胍能夠促進肺腺癌A549細胞遷移，并與其促進腫瘤細胞MMP-9蛋白高表達密切相關。因此，我們考慮沉默GLUT-1表達，導致細胞遷移降低可能是由于GLUT-1蛋白表達下調導致腫瘤細胞葡萄糖攝取減少，細胞能量供給及增殖減低以及腫瘤細胞MMP-9表達降低等多因素所致。這些結果提示我們如果以GLUT-1蛋白作為治療靶點，有可能通過抑制食管癌細胞增殖和MMP-9的表達，降低甚至阻止食管癌細胞降解細胞外基質、調節細胞間黏附的能力，從而降低食管癌的侵襲能力，預防或減少食管癌的轉移或復發。

惡性腫瘤細胞常處于失控性生長及高代謝狀態，故缺氧是實體腫瘤微環境特征之一，與腫瘤的發展、浸潤、轉移等惡性生物學行為密切相關[21]。葡萄糖酵解不僅適合于腫瘤組織廣泛存在的低氧環境，而且缺氧時缺氧誘導因子HIF-1α和GLUT-1的過度表達將促進糖代謝增加滿足腫瘤生長能量代謝的需要。HIF-1α是介導細胞對缺氧微環境進行適應性反應的關鍵性轉錄調控因子，能激活許多缺氧反應性蛋白的表達，使組織產生一系列適應反應而得以在缺氧狀態下生存[22]。一般情況下，腫瘤組織因缺氧導致HIF-1α表達增加，過度表達的HIF-1α通過與不同缺氧反應蛋白如血管內皮生長因子和GLUT-1等啟動子和增強子上的HIF-1結合位點結合，提高這些蛋白的表達，從而促進腫瘤新生血管的生成，維持癌細胞的能量代謝，為癌細胞的進一步生長和轉移提供物質基礎[23]。本研究發現，調低食管鱗癌TE-13細胞GLUT-1蛋白的表達，其HIF-1α的表達亦呈現明顯的降低。雖然這一結果的機制尚不清楚，有待進一步的研究加以說明。考慮可能是由于GLUT-1蛋白表達降低，使得腫瘤細胞代謝、增殖能力下降，導致其乏氧程度得到改善，進而引起HIF-1α蛋白表達降低；或者因沉默GLUT-1表達，導致與HIF-1α相結合的GLUT-1靶點減少所致。

本研究通過慢病毒為載體介導的RNAi技術獲得了能夠穩定轉染干擾食管鱗癌TE-13細胞GLUT-1蛋白表達的sh-RNA；通過對沉默GLUT-1表達后TE-13細胞在細胞增殖、細胞周期、遷移以及相關蛋白表達水平的觀察，提示我們通過調低或抑制食管鱗癌細胞膜GLUT-1蛋白的表達水平，能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖、遷移，并調低與腫瘤侵襲轉移相關的MMP-9蛋白的表達，在一定程度上為尋求以調低GLUT-1蛋白表達為治療腫瘤靶點建立了初步的實驗基礎。

[1]SiegelRL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2015[J].CACancer J Clin,2015,65(1):5-29.

[2]Cui XB,Shen YY,Jin TT,et al.SLC39A6:a potential target for diagnosis and therapy of esophageal carcinoma[J].J Transl Med,2015(13):321.

[3]Wang W,Liu L,Wang Z,et al.Impact of ABO blood group on the prognosis of patients undergoing surgery for esophageal cancer[J].BMC Surg,2015(15):106.

[4]Pan W,Sun Z,Xiang Y,et al.The correlation between high body mass index and survival in patients with esophageal cancer after curative esophagectomy:evidence fromRetrospective studies[J].Asia Pac J Clin Nutr,2015,24(3):480-488.

[5]Xu WW,Li B,Lam AK,et al.Targeting VEGFR1-and VEGFR2-expressing non-tumor cells is essential for esophageal cancer therapy[J].Oncotarget,2015,6(3):1790-1805.

[6]Miles KA,WilliamsRE.WarburgRevisited:imaging tumor blood flow and metabolism[J].Cancer Imaging,2008(8): 81-86.

[7]Shim BY,Jung JH,Lee KM,et al.Glucose transporter 1 (GLUT1)of anaerobic glycolysis as predictive and prognostic values in neoadjuvant chemoradiotherapy and laparoscopic surgery for locally advancedRectal cancer[J].Int J Colorectal Dis,2013,28(3):375-383.

[8]Zhang C,Liu J,Liang Y,et al.Tumour-associated mutant p53 drives the Warburg effect[J].Nat Commun,2013(4): 2935.

[9]Vasconcelos MG,VasconcelosRG,Pereira de Oliveira DH, et al.Distribution of Hypoxia-Inducible Factor-1α and Glucose Transporter-1 in Human Tongue Cancers[J].J Oral Maxillofac Surg,2015,73(9):1753-1760.

[10]Wood IS,Trayhurn P.Glucose transporters(GLUT and SGLT):expanded families of sugar transport proteins[J].Br J Nutr,2003,89(1):3-9.

[11]Chiba I,Ogawa K,Morioka T,et al.Clinical significance of GLUT-1 expression in patients with esophageal cancer treated with concurrent chemoradiotherapy[J].Oncol Lett, 2011,2(1):21-28.

[12]Ito H,Duxbury M,Zinner MJ,et al.Glucose transporter-1 gene expression is associated with pancreatic cancer invasiveness and MMP-2 activity[J].Surgery,2004,136(3): 548-556.

[13]Kato H,Takita J,Miyazaki T,et al.Glut-1 glucose transporter expression in esophageal squamous cell carcinoma is associated with tumor aggressiveness[J].AnticancerRes,2002,22(5):2635-2639.

[14]Ogane N,Yasuda M,Shimizu M,et al.Clinicopathological implications of expressions of hypoxia-related molecules in esophageal superficial squamous cell carcinoma [J].Ann Diagn Pathol,2010,14(1):23-29.

[15]Kato H,Takita J,Miyazaki T,et al.Correlation of 18-F-fluorodeoxyglucose(FDG)accumulation with glucose transporter(Glut-1)expression in esophageal squamous cell carcinoma[J].AnticancerRes,2003,23(4):3263-3272.

[16]CairnsRA,KhokhaR,HillRP.Molecular mechanisms of tumor invasion and metastasis:an integrated view[J].Curr Mol Med,2003,3(7):659-671.

[17]溫洪濤,張蕾,李繼昌,等.人食管鱗癌組織中MMP-2、MMP-9和TIMP-1、TIMP-2的表達[J].鄭州大學學報(醫學版),2006,41(3):418-420.

[18]Liao H,Wang Z,Deng Z,et al.Curcumin inhibits lung cancer invasion and metastasis by attenuating GLUT1/ MT1-MMP/MMP2 pathway[J].Int J Clin Exp Med,2015, 8(6):8948-8957.

[19]Sahai E.Mechanisms of cancer cell invasion[J].Curr Opin Genet Dev,2005,15(1):87-96.

[20]武寧,顧紅軍,李強.二甲雙胍對肺腺癌A549細胞遷移及侵襲活性的影響[J].中國癌癥雜志,2009,19(3):179-182.

[21]Lee SL,Rouhi P,Dahl Jensen L,et al.Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination,invasion,and metastasis in a zebrafish tumor model [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(46):19485-19490.

[22]Sadlecki P,Bodnar M,Grabiec M,et al.TheRole of Hypoxia-inducible factor-1α,glucose transporter-1,(GLUT-1)and carbon anhydraseⅨin endometrial cancer patients [J].BiomedRes Int,2014(2014):616850.

[23]Fang Y,Yu S,Ma Y,et al.Association of DII4/notch and HIF-1a-VEGF signaling in the angiogenesis of missed abortion[J].PLoS One,2013,8(8):e70667.

The effects of GLUT-1 knockdown on proliferation and migration of esophageal squamous cell carcinoma cell line TE-13△

CHEN Tao1*#LIU Xiao-xing2*CHEN Yu-mei1SHI Yi-ping1WAN Liang-rong1LIU Jian-jun11
Department of Nuclear Medicine,2Department ofRadiation Oncology,Renji Hospital,School of Medicine,Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127,China.

ObjectivectiveTo investigate the effects of glucose transporter protein-1(GLUT-1)knockdown on cell proliferation,cycle and migration of the esophageal squamous carcinoma cell line TE-13,and to study the background mechanism.MethodethodCell line TE-13 were transfected with a lentiviral vector carrying the GLUT-1-shRNA which is specific to GLUT-1 gene,then the stably interfered GLUT-1 expression cells were selected and all cells were divided into 2 groups: GLUT-1-shRNA group and negative control group.Real-time PCR and western blot analysis were used to determine the mRNA and protein levels of GLUT-1 in negative control and GLUT-1-shRNA transfected TE-13 cells.The cell proliferation,cell cycle and migration were analyzed by CCK-8 assay,flow cytometry,transwell analysis,respectively.Furthermore,the levels of proteins that were involved in migration or hypoxia were analyzed by western blot.ResultesultLentivirus mediated shRNA knockdown of GLUT-1 significantly downregulated the mRNA level(t=4.181,P<0.05)and protein level(t=6.713,P<0.01)of GLUT-1.Compared with negative control,the proliferation(72 h:t=3.097,P<0.05;96 h:t=3.497, P<0.05)of migration of TE-13 cells was significantly inhibited by GLUT-1 shRNA knockdown.However,the cell cycle showed no significant changes in 24 h after transfection.Moreover,the expression of MMP-9(t=6.895,P<0.01)and HIF-1α(t=13.74,P<0.001)were significantly downregulated by GLUT-1 shRNA knockdown,while the expression of MMP-2 (t=2.582,P>0.05)remained unchanged before and after GLUT-1 knockdown.ConclusionusionGLUT-1 knockdown by shRNA significantly inhibits the proliferation and migration of TE-13 cells.And the levels of MMP-9 and HIF-1α are significantly downregulated by GLUT-1 knockdown,which provides preliminary theoretical basis in searching for targeted therapy for esophageal carcinoma.

ds:Esophageal squamous cell carcinoma;GLUT-1;proliferation;cell cycle;migration

R735.1

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.01.15

上海市科學技術委員會基金（12ZR1418100）

*兩位作者對本文的貢獻等同

（corresponding author），郵箱：drchen1207@sina.cn

2015-11-17）