牛磺酸對四氯化碳所致大鼠肝硬化門靜脈高壓的影響

李靜，楊雅娟，李常娟，馮艷邯鄲市第一醫院，河北 邯鄲 056002

牛磺酸對四氯化碳所致大鼠肝硬化門靜脈高壓的影響

李靜，楊雅娟，李常娟，馮艷
邯鄲市第一醫院，河北 邯鄲 056002

目的 觀察牛磺酸對四氯化碳所致大鼠肝硬化門靜脈高壓的影響，探討其作用機制。方法 采用四氯化碳復合法制備肝硬化門靜脈高壓大鼠模型。實驗大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥組和牛磺酸低、中、高劑量組，各給藥組給予相應藥物灌胃。治療4周后，生化分析儀測定大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）和總膽紅素（TBIL）含量；ELISA測定大鼠血清肝纖4項［Ⅳ型膠原（CⅣ）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、層粘連蛋白（LN）、透明質酸（HA）］含量以及肝組織羥脯氨酸（HYP）水平；血流動力學法測定大鼠門靜脈壓（PVP）、門靜脈血流量（PVF）、平均動脈壓（MAP）并測定心率（HR）；硝酸還原酶法測定一氧化氮（NO）含量，化學比色法測定內皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性，放射免疫法測定環鳥苷酸（cGMP），紫外-可見分光光度計測定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量；HE染色觀察大鼠肝組織病理形態。結果 與模型組比較，牛磺酸中、高劑量組大鼠血清ALT、AST和TBIL含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），CⅣ、PCⅢ、HA及HYP含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），牛磺酸高劑量組LN含量顯著降低（P＜0.05）；牛磺酸中、高劑量組大鼠PVP、PVF顯著降低（P＜0.05），牛磺酸高劑量組MAP顯著升高且HR顯著降低（P＜0.05）；牛磺酸中、高劑量組大鼠肝組織NO含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），牛磺酸高劑量組eNOS活性、cGMP含量顯著升高（P＜0.05）；牛磺酸中、高劑量組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性顯著升高且MDA含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；牛磺酸各劑量組大鼠肝組織病變明顯改善，其中牛磺酸高劑量組效果最為顯著。結論 牛磺酸對肝硬化門靜脈高壓大鼠具有抑制作用，其機制可能與牛磺酸保肝降酶，抑制氧化應激損傷，上調eNOS表達、提高NO含量，改善肝功能有關。

牛磺酸；四氯化碳；肝硬化；門靜脈高壓；大鼠

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.016

肝硬化患者多伴有門靜脈高壓，是影響肝硬化患者預后的重要因素。牛磺酸是一種含硫β-氨基酸，是牛黃的重要成分，并且廣泛存在于動物組織細胞中。現代藥理研究表明，牛磺酸具有促進膽汁排泄、抗氧化、保護心血管、抑制肝組織纖維化等生物學作用［1-4］。本實驗采用四氯化碳復合法制備肝硬化門靜脈高壓大鼠模型，觀察牛磺酸對四氯化碳所致大鼠肝硬化門靜脈高壓的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1動物

雄性清潔級SD大鼠96只，7周齡，體質量200～250 g，河北省實驗動物中心，許可證號SCXK（冀）2008-1-003。飼養于室溫22～25 ℃、相對濕度60%～70%的環境，人工光照明暗交替12 h/12 h。

1.2藥物

牛磺酸，美國Sigma公司，批號140213，含量≥98%；復方鱉甲軟肝片，內蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司，批號20140624。

1.3主要試劑與儀器

丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）和總膽紅素（TBIL）檢測試劑盒，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；Ⅳ型膠原（CⅣ）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、層粘連蛋白（LN）、透明質酸（HA）、羥脯氨酸（HYP）、一氧化氮（NO）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、環鳥苷酸（cGMP）檢測試劑盒，北京博奧森生物工程有限公司。BS380生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司），紫外-可見光分光光度計（日本島津），DNM-9602酶標儀（上海圣科儀器設備有限公司），AOWERLAD-85型八道生理記錄儀（AD公司），光學顯微鏡（日本Olympus）。

2 實驗方法

2.1造模、分組及給藥

大鼠皮下注射40%四氯化碳0.3 mL/100 g，3 d注射1次，并給予高脂高膽固醇飼料喂養，15%乙醇作為飲用水，6周后病理檢查證實肝硬化大鼠模型制備是否成功。選取80只成模大鼠，隨機分為模型組、陽性藥組和牛磺酸低、中、高劑量組，每組16只，并另取16只同齡正常大鼠作為正常組。取牛磺酸精確稱量，用生理鹽水配制成濃度為300 mg/mL溶液為中劑量，150、600 mg/kg牛磺酸溶液分別為低、高劑量；取復方鱉甲軟肝片準確稱量，用生理鹽水配制成濃度為270 mg/mL的溶液。各給藥組均腹腔注射相應劑量藥液2 mL/kg，正常組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，每日1次，連續4周。

2.2血清丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶和總膽紅素含量測定

腹腔注射烏拉坦麻醉，開腹、經腹主動脈取血，1500 r/min離心10 min，取血清，生化檢測儀測定大鼠血清ALT、AST、TBIL含量。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2.3血清肝纖4項含量測定

取“2.2”項所備血清，ELISA測定大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2.4肝組織羥脯氨酸水平測定

待“2.2”項取血完成后，取肝臟，剪碎后通過勻漿器進行研磨勻漿，10 000 r/min離心15min，取上清液，ELISA測定大鼠肝組織HYP水平。嚴格按試劑說明進行操作。

2.5大鼠門靜脈壓、門靜脈血流量、平均動脈壓和心率測定

腹腔注射烏拉坦麻醉，仰位固定，開腹并游離肝門靜脈主干，連接電磁流量計以測定門靜脈血流量（PVF）。門靜脈主干穿刺并固定，用于測定門靜脈壓（PVP），右頸動脈插管用于測定平均動脈壓（MAP）和心率（HR）。各指標均由八道生理記錄儀測量并記錄。

2.6肝組織一氧化氮、內皮型一氧化氮合酶、環鳥苷酸測定

取“2.4”項所備肝組織勻漿上清液，硝酸還原酶法測定NO含量、化學比色法測定eNOS活性，放射免疫法測定cCMP含量。嚴格按試劑說明進行操作。

2.7肝組織超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性和丙二醛含量測定

取“2.4”項所備肝組織勻漿上清液，紫外-可見分光光度計測定大鼠肝組織 SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

2.8肝組織病理形態觀察

治療結束后，腹腔注射烏拉坦麻醉，取肝臟，置于 4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片和展片處理，HE染色鏡下觀察大鼠肝組織病理形態。

3 統計學方法

4 結果

4.1牛磺酸對模型大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶和總膽紅素含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，牛磺酸中、高劑量組大鼠血清ALT、AST、TBIL含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表1。

表1　各組大鼠血清ALT、AST、TBIL含量比較（±s）

表1　各組大鼠血清ALT、AST、TBIL含量比較（±s）

注：與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01（下同）

組別 　只數 　劑量/（mg/kg） 　ALT/（U/L） 　AUT/（U/L） 　TBIL/（μmol/L）正常組 　16 　　48.6± 6.7 　43.1± 9.3 　 7.5±1.8模型組 　16 　　94.3±21.8△△　90.5±16.7△△　15.0±3.6△△牛磺酸低劑量組 　16 　150 　85.2±19.6 　81.4±17.7 　14.1±4.3牛磺酸中劑量組 　16 　300 　78.7±18.2*　72.8±14.1*　11.7±3.2*牛磺酸高劑量組 　16 　600 　69.0±12.4**　65.4±12.5**　10.2±2.7*陽性藥組 　16 　540 　71.5±11.7*　70.6±13.2*　12.3±2.9*

4.2牛磺酸對模型大鼠血清肝纖 4項、肝組織羥脯氨酸水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量及肝組織HYP水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，牛磺酸中、高劑量組大鼠血清CⅣ、PCⅢ、HA含量及肝組織HYP水平降低（P＜0.05，P＜0.01），牛磺酸高劑量組大鼠血清LN含量降低（P＜0.05）。結果見表2。

表2　各組大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量及肝組織HYP水平比較（±s）

表2　各組大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量及肝組織HYP水平比較（±s）

組別 　只數 劑量/（mg/kg） CⅣ/（μg/L） 　PCⅢ/（μg/L） 　LN/（μg/L） 　HA/（μg/L） 　 HYP/（μg/g）正常組 　16 　　34.6±17.8 　75.2±13.6 　25.4±13.8 　24.1± 8.3 　224.3±108.1模型組 　16 　　69.2± 8.4△△　208.5±47.1△△　142.6±61.3△△　89.6±27.5△△　1275.6±340.9△△牛磺酸低劑量組 　16 　150 　60.5±14.3 　182.6±43.8 　107.1±48.2 　74.2±25.1 　1032.5±294.3牛磺酸中劑量組 　16 　300 　48.1±12.7*　140.7±35.4*　83.5±42.7 　60.8±21.7*　918.7±212.6*牛磺酸高劑量組 　16 　600 　37.9±11.0**　117.4±23.2**　65.2±30.4*　43.5±18.4*　753.1±230.4*陽性藥組 　16 　540 　45.2±10.9*　158.1±37.5 　71.1±29.5*　63.4±20.9*　892.4±207.5*

4.3牛磺酸對模型大鼠門靜脈壓、門靜脈血流量、平均動脈壓和心率的影響

與正常組比較，模型組大鼠PVP、PVF、HR升高且MAP降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，牛磺酸中、高劑量組大鼠PVP、PVF降低，牛磺酸高劑量組MAP升高、HR降低（P＜0.05）。結果見表3。

表3　各組大鼠血清PVP、PVF、MAP和HR水平比較（±s）

表3　各組大鼠血清PVP、PVF、MAP和HR水平比較（±s）

組別 　只數 　劑量/（mg/kg） 　PVP/mm Hg 　PVF/mm Hg 　MAP/mm Hg 　HR/（次/min）正常組 　16 　　9.67±1.20 　42.6±1.5 　114.8±6.1 　283.6±31.5模型組 　16 　　16.53±1.46△△　60.4±3.8△　86.3±4.2△　345.1±37.3△△牛磺酸低劑量組 　16 　150 　15.78±2.01 　54.1±3.6 　90.6±4.9 　340.2±38.7牛磺酸中劑量組 　16 　300 　14.25±1.73*　48.7±3.1*　97.4±5.3 　321.4±34.6牛磺酸高劑量組 　16 　600 　12.19±1.54*　44.3±2.7*　104.7±4.8*　292.0±32.1*陽性藥組 　16 　540 　13.95±1.68*　51.8±3.4 　95.1±4.7 　329.5±36.2

4.4牛磺酸對模型大鼠肝組織一氧化氮、內皮型一氧化氮合酶、環鳥苷酸水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織 NO、cGMP含量和eNOS活性降低（P＜0.01）；與模型組比較，牛磺酸中、高劑量組大鼠肝組織NO含量升高，牛磺酸高劑量組cGMP含量和eNOS活性升高（P＜0.05）。結果見表4。

表4　各組大鼠肝組織NO、eNOS、cGMP水平比較（±s）

表4　各組大鼠肝組織NO、eNOS、cGMP水平比較（±s）

組別 　只數 　劑量/（mg/kg） 　NO/（nmol/mg） 　eNOS/（pmol/mg） 　cGMP/（nmol/mg）正常組 　16 　　405.2±78.4 　0.39±0.11 　1547.3±314.7模型組 　16 　　172.6±53.9△△　0.16±0.07△△　782.5±169.1△△牛磺酸低劑量組 　16 　150 　243.5±60.3 　0.19±0.10 　914.0±183.4牛磺酸中劑量組 　16 　300 　291.7±62.6*　0.23±0.09 　1182.3±218.6牛磺酸高劑量組 　16 　600 　334.9±71.5**　0.28±0.10*　1275.2±279.5*陽性藥組 　16 　540 　286.1±58.2*　0.20±0.08 　1046.1±260.3

4.5牛磺酸對模型大鼠肝組織超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物和丙二醛水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性降低及MDA含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，牛磺酸中、高劑量組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性升高及MDA含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表5。

表5　各組大鼠肝組織SOD、GSH-Px、MDA水平比較（±s，U/mg）

表5　各組大鼠肝組織SOD、GSH-Px、MDA水平比較（±s，U/mg）

組別 　只數 　劑量/（mg/kg） 　 SOD正常組 　16 　　12.4±1.7模型組 　16 　　8.3±1.2△△牛磺酸低劑量組 　16 　150 　8.7±1.5牛磺酸中劑量組 　16 　300 　9.8±1.4*牛磺酸高劑量組 　16 　600 　10.7±1.8**陽性藥組 　16 　540 　9.6±1.3*GSH-Px 　 MDA 18.1±2.6 　5.31±1.26 11.3±1.9△△　13.04±3.85△△11.7±2.4 　10.92±3.60 12.5±3.3*　8.13±3.11**13.8±2.9**　6.87±2.74**12.4±2.7 　8.65±3.07*

4.6牛磺酸對模型大鼠肝組織病理形態的影響

正常組大鼠肝組織結構未見異常；模型組大鼠肝組織呈結節狀，纖維組織增生顯著、纖維間隔形成，匯管區及中央靜脈周圍可見炎細胞浸潤；牛磺酸各劑量組和陽性藥組大鼠肝組織病理形態改變顯著改善，并呈劑量依賴性。結果見圖1。

圖1　各組大鼠肝組織病理形態（HE染色，×200）

5 討論

肝硬化是一種慢性肝病，將引發肝血管結構紊亂及血流循環紊亂，最終導致門靜脈高壓形成，是導致肝硬化患者死亡的重要原因。通過四氯化碳復合法誘導制備的肝硬化大鼠模型具有與人類相似的肝硬化病理生理特征，多用于肝硬化門靜脈高壓的藥物治療研究［5-6］。

肝纖4項（CⅣ、PCⅢ、LN、HA）是臨床上用來監測肝硬化進展程度的常用指標，并且在肝硬化發生發展過程中，膠原纖維大量增生，其主要成分為膠原蛋白，而HYP主要存在于膠原蛋白中，其含量反映肝硬化程度［7］。牛磺酸是一種含硫β-氨基酸，具有抗氧化、保護心血管、抑制肝組織纖維化等多種生物學作用。本實驗采用通過四氯化碳復合法制備肝硬化門靜脈高壓大鼠模型，研究發現牛磺酸能有效降低肝硬化門靜脈高壓大鼠肝組織CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量以及HYP水平，有效降低PVP、PVF、HR并提高MAP水平，降低血清ALT、AST、TBIL的含量，改善肝組織的病理形態變化，并且上述作用均具有劑量依賴性。

體內NO是一種信號分子，能夠通過激活可溶性腺苷酸環化酶、升高細胞內cCMP水平而發揮刺激血管舒張，促進血液循環的生理作用［8］，而eNOS是體內催化NO生成的生物酶。本實驗結果發現，牛磺酸能有效促進肝硬化門靜脈高壓大鼠肝組織eNOS的表達，提高NO及cGMP的含量，提示牛磺酸能夠通過調節NO信號傳導通路，而表現出降低肝內血管阻力和門靜脈壓力的作用，且該作用具有劑量依賴性。

SOD能夠通過提供氫原子配體而還原氧自由基生成H2O2［9］，并且在GSH-Px的催化作用下，能夠進一步被還原生成對人體無害的H2O和O2［10］，從而消除氧化應激損傷；脂質過氧化終產物MDA的含量也能夠間接反映機體氧化應激損傷程度。本研究發現，牛磺酸能有效改善肝硬化門靜脈高壓大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性并降低MDA含量，并且該作用具有劑量依賴性，提示牛磺酸能劑量依賴性地抑制肝硬化門靜脈高壓大鼠肝組織氧化應激損傷。

綜上，牛磺酸對四氯化碳所致大鼠肝硬化門靜脈高壓具有劑量依賴性的抑制作用，其機制可能與牛磺酸能有效保肝降酶，抑制氧化應激損傷，上調eNOS表達、提高NO含量，改善肝功能有關。

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（修回日期：2015-11-15；編輯：華強）

Effects of Taurine on Rats with CCl4-induced Portal Hypertension

LI Jing， YANG Ya-juan，
LI Chang-juan， FENG Yan （First Hospital of Handan， Handan 056002， China）

Objective To investigate the effects of taurine on rats with CCl4-induced portal hypertension； To discuss its mechanism of action. Methods CCl4compound method was used to prepare portal hypertension rat models. Experimental rats were randomly divided into normal group， model group， positive medicine group and low-，medium- and high-dose taurine groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage. After four-week treatment， biochemical analyzer was used to detect the contents of ALT， AST and TBIL； ELISA was used to detect the contents of CⅣ， PCⅢ， LN， HA and the level of HYP in serum； hemodynamic method was used to detect PVP， PVF， MAP and HR； nitrate reduction method was used to detect the contents of NO， chemical colorimetry was used to detect the activity of eNOS， hepatic tissue； the activity of SOD， GSH-Px and the content of MDA in hepatic tissue； HE staining was used to observe the histopathological changes of the hepatic tissue. Results Compared with the model group， the contents of ALT， AST and TBIL in serum in medium- and high-dose taurine groups decreased significantly （P＜0.05， P＜0.01）； the contents of CⅣ， PCⅢ， HA and HYP in serum in medium- and high-dose taurine groups decreased significantly， and LN in high-dose taurine group decreased significantly （P＜0.05， P＜0.01）； the PVP，PVF in medium- and high-dose taurine groups and the HR in high-dose taurine group decreased significantly （P＜0.01）， and the MAP in high-dose taurine group inecreased significantly （P＜0.05）； the content of NO in hepatic tissue of medium- and high-dose taurine groups increased significantly （P＜0.05， P＜0.01）； the activity of eNOS and the content of cGMP in high-dose taurine group increased significantly （P＜0.05）； the activity of SOD， GSH-Px inhepatic tissue of medium- and high-dose taurine groups increased significantly and the content of MDA decreased significantly （P＜0.05， P＜0.01）； the hepatic tissue histopath-ological changes of low-， medium- and high-dose taurine groups were significantly improved， especially the high-dose taurine group. Conclusion Taurine has inhibitory effects on rats with portal hypertension， which perhaps are related to its effects on enzyme activity inhibition and hepatic tissue protection， inhibiting the damage of oxidative stress， upregulating eNOS expression， enhancing the content of NO and improving liver function.

taurine； CCl4； cirrhosis； portal hypertension； rats

R285.5

A

1005-5304（2016）09-0065-05

2015-10-18）