扶正化瘀膠囊對心肌梗死大鼠Rock1、Rock2表達的影響

張冬梅，吳愛明，婁利霞，趙明鏡，呂晞瀅，趙一舟，柴立民，高永紅，孫逸坤，趙久麗北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部和北京市重點實驗室，北京 100700

扶正化瘀膠囊對心肌梗死大鼠Rock1、Rock2表達的影響

張冬梅，吳愛明，婁利霞，趙明鏡，呂晞瀅，趙一舟，柴立民，高永紅，孫逸坤，趙久麗
北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部和北京市重點實驗室，北京 100700

目的 觀察扶正化瘀膠囊對心肌梗死大鼠RhoA/Rock信號轉導通路主要成員Rock1、Rock2表達的影響，探討其改善心室重構心肌纖維化的可能機制。方法 采用冠狀動脈左前降支結扎術制備急性心肌梗死模型，成模大鼠隨機分為模型組、扶正化瘀膠囊組和鹽酸法舒地爾組，另設假手術組只穿線不結扎作為對照，每組8只。造模后第2日開始給予相應藥物干預，連續4周。免疫組化檢測心肌組織Rock1、Rock2蛋白表達，實時熒光定量PCR檢測Rock1、Rock2 mRNA表達。結果 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織Rock1、Rock2蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，鹽酸法舒地爾組和扶正化瘀膠囊組大鼠心肌組織Rock1、Rock2蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織 Rock1 mRNA表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，鹽酸法舒地爾組大鼠心肌組織Rock1 mRNA表達明顯降低（P＜0.05），鹽酸法舒地爾組和扶正化瘀方組大鼠心肌組織Rock2 mRNA表達明顯降低（P＜0.05）。結論 扶正化瘀膠囊通過降低心肌梗死大鼠梗死邊緣區心肌組織Rock1、Rock2的表達，發揮其抗心室重構心肌纖維化的作用。

心肌梗死；心肌纖維化；Rock；扶正化瘀膠囊；大鼠

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.018

心肌纖維化是多種心血管疾病發生發展的共同病理基礎，是造成心律失常、心衰的微觀病理機制［1］。近年來研究發現，RhoA/Rock信號轉導通路參與了心肌纖維化的發生［2］。扶正化瘀膠囊臨床用于抗肝纖維化，前期研究顯示，其具有改善心肌梗死大鼠左室重構、提高心功能、防治心肌梗死后心肌纖維化的作用［3-4］，但具體作用機制仍未闡明。因此，本實驗采用冠狀動脈左前降支結扎術制備急性心肌梗死大鼠模型，觀察扶正化瘀膠囊對RhoA/Rock信號轉導通路主要成員Rock1、Rock2表達的影響，探討其改善心室重構心肌纖維化的可能機制。

1 實驗材料

1.1動物

健康雄性SD大鼠40只，6周齡，體質量200～220 g，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2009-0007。飼養于北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部和北京市重點實驗室動物房，SPF級常規飼養。

1.2藥物

扶正化瘀膠囊，每粒0.5 g，上海黃浦制藥有限責任公司，批號110611，以生理鹽水配制成0.08 g/mL藥液；鹽酸法舒地爾注射液，30 mg/2 mL，天津紅日藥業股份有限公司，批號1108241。

1.3主要試劑與儀器

Rabbit anti-Rock1、Rock2抗體，武漢博士德生物工程有限公司；二步法免疫組化檢測試劑盒PV-6001，北京中杉金橋生物有限公司；RT試劑盒，Promega公司；SYBER Green，ABI公司，引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。RSP-1002型呼吸機（Kent Scientific Corporation），XJ-11型心電示波儀（上海醫學電子儀器廠），JA1003N型千分之一電子天平（上海精密科學儀器有限公司），SPOTⅡ數碼成像系統（Diagnostic Instruments公司），Meta Morph圖像分析系統（Vniversal Imaging公司），Gene Quant （Pharmacia Biotech），GeneAmp PCR system 9700 （Applied Biosystems公司），Mx3000P實時熒光定量PCR儀（stratagene）。

2 實驗方法

2.1造模

大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，背位固定，氣管插管，連接呼吸機，80次/min、潮氣量0.7～0.8 mL行人工呼吸。左胸前區備皮去毛，消毒，于左側第3、4肋處橫向切開皮膚，長約1.5 cm，鈍性分離肌層，沿第3、4肋間隙打開胸腔，以開胸器擴大手術視野，撕開心包，在動脈圓錐與左心耳間下約2 mm處用5/0線結扎左冠狀動脈，當心電圖導聯顯示ST段顯著抬高后，重置心臟于胸腔，并立即分層縫合胸壁。術后3 d腹腔注射青霉素80萬U/d預防感染。假手術組手術過程同上，但只穿線不結扎左冠狀動脈。造模組和假手術組大鼠術后常規飼養。

2.2分組與給藥

剔除心電圖無心肌梗死表現的模型大鼠，隨機分為模型組、扶正化瘀膠囊組、鹽酸法舒地爾組，另設假手術組做對照，每組8只。造模后第2日灌胃給藥，每日1次。給藥劑量根據等效體表面積公式計算，扶正化瘀膠囊組按0.5 mL/100 g劑量灌胃給藥（相當于扶正化瘀膠囊0.4 g/kg體質量），鹽酸法舒地爾組按0.07 mL/100 g劑量腹腔注射，模型組和假手術組給予等量生理鹽水灌胃。每7 d稱重調整藥量1次，連續4周。

2.3免疫組化檢測心肌組織Rock1、Rock2蛋白表達

心肌組織切片脫蠟至水，3%H2O2滅活內源性過氧化酶，枸櫞酸緩沖液熱修復，自然冷卻后0.01 mol/L PBS沖洗，相應的一抗1∶100稀釋后，4 ℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS沖洗，滴加PV-9001山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS沖洗，DAB室溫孵育5 min，鏡下觀察顯色情況，自來水終止反應。梯度乙醇和二甲苯脫水透明，中性樹脂封片。染色后心肌組織切片，采用圖像分析軟件采集數據，每組4張切片，每張切片隨機選擇5個視野，計算陽性區域所占總面積。

2.4RT-qPCR檢測心肌組織Rock1、Rock2 mRNA表達

取約 50 mg梗死邊緣新鮮心肌組織，加 1 mL Trizol，冰上勻漿，提取組織總RNA。經紫外分光光度計A260及A280定量，計算RNA濃度及純度。采用二步法檢測Rock1、Rock2的mRNA表達。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。取2 μg總RNA進行反轉錄，得cDNA鏈。以cDNA為模板進行RT-qPCR反應，反應體系為25 μL，含1 μL cDNA，10 μmol/L上下游引物各1 μL，2×SYBER Green PCR mix 12.5 μL，不足體積以無RNA酶的水補齊。以β-actin作為內參照。引物序列：Rock1 sense 5'-AGGGACATCATGGCATTT GC-3'，antisense 5'-CCACTTTTCAGGCACTCGT-3'，產物長度 150 bp；Rock2 sense 5'-CTTCCCAACCA ACTGTGAGG-3'，antisense 5'-AAATTTGCAGGGGGC TATG-3'，產物長度146 bp；β-actin sense 5'-TGTGAT GGACTCCGGAGACGG-3'，antisense 5'-ACAGCTTC TCTTTGATGTCACGC-3'，產物長度197 bp。PCR條件：95 ℃、10 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、20 s，共35個循環。所得Ct值采用均一化處理，按2-ΔΔCt法進行計算。

3 統計學方法

4 結果

4.1扶正化瘀膠囊對模型大鼠心肌組織 Rock1、Rock2蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織Rock1、Rock2蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，鹽酸法舒地爾組和扶正化瘀膠囊組大鼠心肌組織Rock1、Rock2蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。結果見表1、圖1、圖2。

表1　各組大鼠心肌組織Rock1、Rock2蛋白表達比較（±s，OD值）

表1　各組大鼠心肌組織Rock1、Rock2蛋白表達比較（±s，OD值）

注： 與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 　只數 　 Rock1 　 Rock2假手術組 　8 　0.095±0.013 　0.056±0.003模型組 　8 　0.301±0.010*　0.227±0.005*扶正化瘀膠囊組 　8 　0.120±0.014△　0.112±0.003△鹽酸法舒地爾組 　8 　0.125±0.019△　0.105±0.008△

圖1　各組大鼠心肌組織Rock1蛋白表達（免疫組化染色，×400）

圖2　各組大鼠心肌組織Rock2蛋白表達（免疫組化染色，×400）

4.2扶正化瘀膠囊對模型大鼠心肌組織 Rock1、Rock2 mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織 Rock1 mRNA表達略升高（P＞0.05），Rock2 mRNA表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，鹽酸法舒地爾組Rock1 mRNA表達明顯降低（P＜0.05），鹽酸法舒地爾組和扶正化瘀方組心肌組織Rock2 mRNA表達明顯降低（P＜0.05）。結果見表2。

表2　各組大鼠心肌組織Rock1、Rock2 mRNA表達比較（±s）

表2　各組大鼠心肌組織Rock1、Rock2 mRNA表達比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 　只數 Rock1 　 Rock2假手術組 　6 　0.981±0.125 　0.988±0.184模型組 　6 　0.991±0.320 　1.271±0.166*扶正化瘀膠囊組 　6 　0.985±0.402 　1.047±0.173△鹽酸法舒地爾組 　6 　0.874±0.216△　1.059±0.053△

5 討論

扶正化瘀膠囊主要由丹參、桃仁、松花粉、五味子、絞股藍、蟲草菌絲等藥物組成，具有活血化瘀、益氣扶正的功效，研究表明，其具有較理想的抗肝纖維化的作用［5］。

多臟器纖維化（肝、腎、肺、心等）雖然是相對獨立的疾病，但都有著相同的病理改變及正虛血瘀的共同發病規律，即器官纖維化因子分泌增加、細胞外基質合成增多與降解減少、纖維結締組織增生，通過扶正化瘀可達到異病同治的效果。正虛血瘀病機同樣體現在心室重構心肌纖維化的過程中。我們的前期研究表明，采用冠脈左前降支結扎致心肌梗死后心力衰竭模型大鼠血瘀證貫穿于病變整個過程，心氣虛證隨著病變的發展而出現并加重，呈現氣虛血瘀證候表現及左室重構和功能損傷的病理表現［6］。扶正化瘀膠囊不僅可縮小模型大鼠心肌梗死范圍區面積和梗死百分比，提高心功能，還具有抑制心肌膠原表達、改善左室重構的作用，在一定程度上防治心肌梗死后心肌纖維化［3-4］。

Rock又稱Rho激酶，是小GTP結合蛋白RhoA重要效應分子［7］，包括Rock1和Rock2兩個亞型，是Rho/Rock信號通路的關鍵信號分子。有研究顯示，RhoA/Rock信號轉導通路在心肌梗死后心肌纖維化及心室重構中起關鍵的調節作用［8］，它參與細胞外基質的調控，在轉化生長因子（TGF）β引發的膠原合成中扮演著中繼子的角色。Rock1可調節心肌素相關轉錄因子介導的肌纖維母細胞激活，促進血清應答因子活化和膠原沉積［9］。主動脈縮窄Rock1基因敲除大鼠術后第3周血管周圍和間質纖維化減輕，且心肌細胞釋放 TGF-β2和結締組織生長因子等細胞因子減少。RhoA還可以通過與Rho激酶結合刺激基質金屬蛋白酶-3、基質金屬蛋白酶-9表達，引起細胞外基質結構改變，促進心室重塑和心功能惡化［10］。應用Rock抑制劑可減弱Ⅰ型膠原啟動子的活性［11］，延緩或抑制心室重構，改善預后［12］。

本研究結果顯示，模型組大鼠心肌組織Rock1、Rock2蛋白表達及Rock2 mRNA表達均較假手術組明顯上調，進一步證實Rock參與了心肌梗死后心室重構心肌纖維化的發生。而扶正化瘀膠囊可降低心肌梗死邊緣區收肌組織Rock1、Rock2的蛋白表達，下調Rock2的mRNA表達，提示該方對Rock具有調節作用，其抑制心肌間質膠原合成、減輕心肌纖維化的作用可能與此有關。方中丹參的主要成分丹參酮ⅡA亦能下調RhoA、Rock1的蛋白表達，使TGF-β1和結締組織生長因子水平下降［13-14］。鹽酸法舒地爾作為特異性Rho激酶抑制劑，能降低Rock1、Rock2及其mRNA的表達，具有抗心肌纖維化的作用，其機制可能與阻斷Rho/Rock信號通路、降低炎性因子表達［15］、部分抑制肌成纖維細胞表型分化［16］、下調Ⅰ型和Ⅲ型膠原基因表達有關［17］。

綜上所述，扶正化瘀膠囊可降低心肌梗死大鼠梗死邊緣區心肌組織Rock1、Rock2的蛋白表達及Rock2 的 mRNA表達，其抑制心肌纖維化、改善心肌梗死后左室重構的作用可能與此有關。扶正化瘀膠囊是否具有通過Rho/Rock信號通路調控心肌梗死后心室重構心肌纖維化的作用機制，值得進一步研究。

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（修回日期：2015-12-28；編輯：華強）

Effects of Fuzheng Huayu Capsule on Expressions of Rock1 and Rock2 in Rats with Myocardial Infarction

ZHANG Dong-mei， WU Ai-ming， LOU Li-xia， ZHAO Ming-jing， LV Xi-ying， ZHAO Yi-zhou，CHAI Li-min， GAO Yong-hong， SUN Yi-kun， ZHAO Jiu-li （Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing， Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China）

Objective To observe the effects of Fuzheng Huayu Capsule on the expressions of the main roles，Rock1 and Rock2， in RhoA/Rock signal transduction pathway in rats with myocardial infarction （MI）； To explore the possible mechanism of Fuzheng Huayu Capsule to improve ventricular remodeling in myocardial fibrosis. Methods The MI model was induced by ligation of the left coronary artery. Rats with MI were randomly divided into the model group， Fuzheng Huayu group and Fasudil hydrochloride group. A sham-operation group threading without ligation was setting as a control group， with eight rats in each group. The rats were treated with corresponding medicine for 4 weeks from the second day after modeling. The expression of Rock1， Rock2 and its mRNA were detected by immunohistochemical and real-time PCR method. Results The protein expression of Rock1 and Rock2 in model group were significantly higher than those in the sham-operation group （P＜0.05）. The protein expression of Rock1 and Rock2 in the Fuzheng Huayu group and Fasudil hydrochloride group were lower than those in the model group. The mRNA expression of Rock2 was significantly higher in the model group than that in the sham-operation group （P＜0.05）. The mRNA expression of Rock1 in the Fasudil hydrochloride group was lower than that in the model group （P＜0.05）. The mRNA expression of Rock2 in the Fuzheng Huayu group and Fasudil hydrochloride group was lower than that in the model group （P＜0.05）. Conclusion Fuzheng Huayu Capsule can decrease the expression of Rock1， Rock2 and Rock2 in the marginal zone of myocardial infarction in rats with MI. The anti ventricular remodeling mechanism of Fuzheng Huayu Capsule maybe related with this.

myocardial infarction； myocardial fibrosis； Rock； Fuzheng Huayu Capsule； rats

R285.5

A

1005-5304（2016）09-0074-04

國家自然科學基金（81473662）；北京中醫藥大學自主創新項目（2011JYBZZJS-005）

2015-11-20）