DHPM處理下 β乳球蛋白與油酸相互作用對其功能性質的影響

劉成梅,俞宏達,鐘俊楨,洪啟通,劉　偉

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

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劉成梅,俞宏達,鐘俊楨*,洪啟通,劉偉

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

采用動態高壓微射流處理β-乳球蛋白與油酸混合物,研究β-乳球蛋白與油酸相互作用對其功能性質和表面疏水性的影響。與標準β-乳球蛋白相比,未經DHPM處理的混合物的功能性質和表面疏水性沒有顯著性變化(p>0.05)。隨著DHPM壓力從40 MPa增至160 MPa,β-乳球蛋白油酸復合物的溶解度、乳化性、起泡性和表面疏水性都呈先增加后減少的趨勢。溶解度和起泡性在80 MPa壓力條件下達到最大,分別為95.36%和32.00%。而乳化性和表面疏水性呈正相關關系,在120 MPa壓力條件下達到最大,分別為1.09和640.20。結果表明功能性質和表面疏水性的變化與不同DHPM壓力下β-乳球蛋白與油酸相互作用的程度有關。

β-乳球蛋白,油酸,動態高壓微射流,功能性質

乳清因具有良好的功能性質,被廣泛應用于食品產品中[1]。β-乳球蛋白是乳清的主要成分,由162個氨基酸組成,含有9條β-折疊股和一個α-螺旋,其中8條β-折疊股形成一個疏水空腔[2]。

β-乳球蛋白作為載脂蛋白,能與脂肪酸、視黃醇等疏水小分子形成復合物,其中β-桶疏水空腔是其最主要的結合位點[3]。從牛奶中提取的β-乳球蛋白含有部分β-乳球蛋白脂肪酸復合物[4],與其結合的脂肪酸主要是軟脂酸和油酸,大約占75%比例[5]。β-乳球蛋白與脂肪酸疏水結合后蛋白質結構穩定性顯著增加,對蛋白酶酶解作用、熱誘導變性和離液劑誘導變性的抵抗能力提高[4,6-7]。有研究表明[2,8],β-乳球蛋白與亞油酸鈉或油酸鈉復合物對腫瘤細胞具有細胞毒性。

然而,目前很少有關于β-乳球蛋白脂肪酸復合物功能性質方面的研究。本實驗采用動態超高壓微射流處理β-乳球蛋白與油酸混合物以促進β-乳球蛋白與油酸相互作用。動態超高壓微射流(DHPM)是一種新興的物理改性技術,通過高壓對液體物料進行高速撞擊、強烈剪切、空穴膨爆等綜合作用,起到超微細化、乳化和均一化效果,進而對其理化性質產生影響[9]。本實驗主要研究不同DHPM壓力處理后β-乳球蛋白油酸復合物功能性質和表面疏水性的變化,以期為改性β-乳球蛋白在乳制品中的應用提供一定的理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牛β-乳球蛋白、油酸購于美國Sigma公司；其他所需試劑均為分析純。

紫外分光光度計北京譜析通用公司;F-4500熒光分光光度計日立HITACHI公司;M-7125 Microfluidics微射流均質機(DHPM)國Microfluidics公司。

1.2實驗方法

1.2.1復合物的制備將β-乳球蛋白與油酸以1∶4的質量比混勻在pH7.4的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline,PBS)中,β-乳球蛋白的濃度為1 mg/mL。將混合溶液均分成5等份,分別在40、80、120、160 MPa不同DHPM表壓力下處理3次,超濾除去未結合的油酸,收集樣品并4 ℃保存。未加油酸的β-乳球蛋白作為空白對照。本實驗用0.1 MPa表示未經過DHPM壓力處理。

1.2.2溶解度的測定根據文獻[10],分別取等量樣品溶液,在15000×g下離心15 min,取上清液。上清液中蛋白質的含量以牛血清白蛋白做標準用考馬斯亮藍G-250法進行測定。

1.2.3乳化性的測定根據文獻[10],分別取5 mL樣品溶液,邊攪拌邊緩緩加入一級油5 mL,PBS緩沖液10 mL,于10000 r/min高速均質1 min制成乳狀液,從底部吸取乳狀液50 μL,立即與5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)混合,然后用分光光度計于500 nm處測其吸光度,實驗重復三次。乳化性大小用吸光度值表示。

1.2.4起泡性的測定根據文獻[10],分別取10 mL樣品溶液,在室溫下于微射流均質機中均質1 min,轉速為5000 r/min,然后快速移至100 mL量筒內,記錄泡沫的體積,實驗重復三次。按下式計算起泡性。

起泡性=泡沫體積×100%/溶液體積

1.2.5表面疏水性的測定根據文獻[11],分別取4 mL樣品溶液,加入20 μL的1-苯胺基-8-萘(1-anilino-8-naphthalene sulfonic acid,ANS)溶液(8 mmol/L ANS溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液),立即搖勻,在F-4500熒光分光光度計中于390 nm波長激發,檢測發射熒光光譜,以最大發射波長處的相對熒光強度表示表面疏水性。

1.2.6數據統計分析所有實驗重復三次,結果以“平均值±標準偏差”表示。使用SPSS 19.0統計分析軟件,One-Way ANOVA用于單因素方差分析,Tukey法比較平均值之間的差異性(p≤0.05)。作圖采用Origin 8.6軟件。

2　結果與分析

2.1溶解度

蛋白質的溶解度大小與蛋白質與蛋白質,蛋白質與水,蛋白質與離子和離子與水等相互作用有關[12]。在pH7.4下,β-乳球蛋白與油酸在不同DHPM壓力條件下形成的復合物的溶解性見圖1。如圖1所示,對照組的β-乳球蛋白的溶解度為82.32%±1.82%。經過0.1、40、80、120、160 MPa處理后,β-乳球蛋白油酸復合物的溶解度分別為81.17%±2.10%、87.13%±2.48%、95.36%±1.37%、86.21%±1.43%、82.78%±1.05%,呈先增高后減少的趨勢。

圖1　不同DHPM壓力條件下β-乳球蛋白 與油酸復合物的溶解度Fig.1　The solubility of β-lactoglobulin/oleic acid complex treated at different DHPM pressure注:不同的字母表示在p≤0.05水平上 有顯著差異,圖2～圖4同。

蛋白質在水中的溶解度主要取決于蛋白質變性和聚集的程度[13]。與對照組相比,未經DHPM處理(0.1MPa)的蛋白質溶解度沒有顯著變化(p>0.05)。這可能由于不溶于水的油酸在簡單混勻形成的體系中,難以與β-乳球蛋白發生相互作用。然而,β-乳球蛋白與油酸混合體系在動態高壓微射流處理過程中,受到高速撞擊、強烈剪切等綜合作用,會形成均一、乳化的體系。在40 MPa和80 MPa壓力條件下,復合物溶解度依次增加(p≤0.05),這可能因為β-乳球蛋白與油酸相互作用形成復合物引起的。油酸結合在β-乳球蛋白的疏水區域,減弱β-乳球蛋白之間的相互作用,因此復合物溶解度相對增加。而在120 MPa和160 MPa壓力條件下,復合物溶解度都分別減小。前期研究[14]發現在120 MPa以上壓力處理時,由于β-乳球蛋白的再聚集會導致疏水殘基和自由巰基被包埋。在本實驗中,這很可能減弱β-乳球蛋白與油酸之間的相互作用,導致復合物的溶解度相對降低。

2.2乳化性

蛋白質是兩性大分子,能在油水界面形成緊密的薄膜[15]。在本實驗中,通過蛋白質和油形成的乳化液在500 nm下的吸光度值表示蛋白質的乳化性。如圖2所示,對照組的β-乳球蛋白的吸光度值為0.72±0.02。與對照組相比,未經DHPM處理(0.1 MPa)的樣品乳化性為0.73±0.02,沒有顯著性變化(p>0.05)。經過40、80、120、160 MPa不同壓力處理后,復合物的吸光度值分別為0.76±0.03、0.89±0.04、1.09±0.06和0.81±0.03。

這可能是因為油酸易溶于大豆油,β-乳球蛋白油酸復合物能更容易地吸附到油水界面。同時DHPM處理會導致β-乳球蛋白埋藏內部的疏水基團的暴露。許多文獻表明蛋白質疏水基團的暴露會增加蛋白質的乳化性[16-18]。在160 MPa壓力條件下,復合物的乳化性顯著性減少。前期研究發現高壓處理下β-乳球蛋白容易發生再聚集現象[14]。這種蛋白質的再聚集可能導致β-乳球蛋白疏水殘基和巰基被包埋在蛋白質構象內,從而減弱β-乳球蛋白與油酸之間的相互作用,導致乳化性相對降低。

圖2　不同DHPM壓力條件下β-乳球蛋白 與油酸復合物的乳化性Fig.2　The emulsifying activity of β-lactoglobulin/oleic acid complex treated at different DHPM pressure

2.3起泡性

蛋白質作為兩親大分子,在分散液中具有降低氣-液界面的表面張力的作用,劇烈攪拌能形成泡沫。分散液形成泡沫時,蛋白質分子需吸附到氣-水界面,并伴隨著折疊化和重排過程[19]。如圖3所示,天然β-乳球蛋白的起泡性為14.33%±2.08%。經過0.1、40、80、120、160 MPa不同壓力處理后,復合物的起泡性分別為15.00%±2.00%、20.00%±2.00%、32.00%±2.00%、25.00%±1.00%、22.33%±2.52%。

圖3　不同DHPM壓力條件下β-乳球蛋白 與油酸復合物的起泡性Fig.3　The foaming activity of β-lactoglobulin/oleic acid complex treated at different DHPM pressure

蛋白質溶解度是影響蛋白質功能性質的重要性質之一。在一定程度內,蛋白質起泡性變化與其溶解度有關[20]。在本實驗結果中,β-乳球蛋白油酸復合物起泡性的變化與溶解度變化趨勢是一致的。通過對溶解度的分析,這可能說明β-乳球蛋白油酸復合物更容易吸附到氣水界面以形成薄膜。

2.4表面疏水性

測定蛋白質的表面疏水性是準確預測蛋白質功能性質的必不可少的一步[18]。圖4為在不同DHPM壓力條件的樣品中ANS的發射熒光光譜。在本實驗中,通過ANS熒光光譜的最大熒光強度來表示β-乳球蛋白的表面疏水性大小。在圖4中,對照組的ANS發射熒光光譜的最大發射波長以及最大熒光強度分別為490.00 nm和153.70。

圖4　不同DHPM壓力下β-乳球蛋白油酸復合物的 ANS熒光發射光譜Fig.4　The ANS fluorescence emission spectra of β-LG/oleic acid complex treated at different DHPM pressure

經過不同壓力0.1、40、80、120、160 MPa處理后,復合物的ANS熒光光譜的最大發射波長逐漸藍移至488.00、476.40、474.40、473.60、473.00 nm。在相關的研究中[21-22],ANS與β-乳球蛋白結合的位置主要在β-桶內部和β-桶與α-螺旋之間的凹槽,而脂肪酸以比ANS大2～3個數量級的結合常數競爭結合在β-桶內部。在本實驗中,DHPM壓力處理引起的β-乳球蛋白與油酸的相互作用導致ANS與β-乳球蛋白結合位置的環境極性發了變化,因此ANS熒光發射光譜發生藍移。

在0.1、40、80、120、160 MPa壓力條件下,最大熒光強度分別為157.80、312.00、397.10、640.20和463.00。前期研究發現β-乳球蛋白在DHPM處理中內部疏水基團容易暴露[14]。疏水基團的暴露可能同時增強β-乳球蛋白與油酸之間的相互作用,從而促使其表面疏水性逐漸增加。然而,當壓力達到160 MPa時,蛋白質在高壓環境下發生再聚集現象,疏水集團被包埋在蛋白質構象內部,同時減弱β-乳球蛋白與油酸之間的相互作用,導致表面疏水性降低。另外,許多文獻[20,23]指出,蛋白質表面疏水性與乳化性有著正相關的關系。如圖5所示,在本實驗中的表面疏水性與乳化性同樣有著正相關的關系(p≤0.05)。

圖5　表面疏水性與乳化性的相關性Fig.5　Correlation relationship between surface hydrophobicity and emulsifying ability

3　結論

長鏈脂肪酸難溶于水,要與溶液中的蛋白發生相互作用,可以通過物理手段形成乳化液或者加入乙醇等有機溶劑。動態高壓微射流是一種新興的物理改性技術,β-乳球蛋白與油酸混合體系經過動態高壓微射流處理后會形成均一、乳化的體系。與標準β-乳球蛋白相比,未經DHPM處理的混合物的功能性質和表面疏水性沒有顯著性變化(p>0.05)。經過不同DHPM壓力處理后,β-乳球蛋白的ANS熒光發射光譜藍移表明β-乳球蛋白與油酸發生了相互結合。經過40、80、120、160 MPa不同壓力處理后,β-乳球蛋白油酸復合物的溶解度、乳化性、起泡性和表面疏水性都有隨壓力增加呈先增加后減少的趨勢,復合物的溶解度分別為87.13%±2.48%、95.36%±1.37%、86.21%±1.43%、82.78%±1.05%;復合物的乳化性分別為0.76、0.89、1.09和0.81;復合物的起泡性分別為20.00%±2.00%、32.00%±2.00%、25.00%±1.00%、22.33%±2.52%;復合物表面疏水性分別為312.00、397.10、640.20和463.00。其中,乳化性和表面疏水性正相關,都在120 MPa壓力條件下達到最大值。溶解度和起泡性都在80 MPa壓力條件下達到最大值。β-乳球蛋白油酸復合物功能性質和表面疏水性的變化與不同DHPM壓力下β-乳球蛋白與油酸相互作用的程度有關。

[1]Chevalier F,Chobert J M,Popineau Y,et al. Improvement of functional properties ofβ-lactoglobulin glycated through the Maillard reaction is related to the nature of the sugar[J]. International Dairy Journal,2001,11(3):145-152.

[2]Solène Le Maux,Sa?d Bouhallab,Giblin L,et al. Complexes between linoleate and native or aggregatedβ-lactoglobulin:Interaction parameters andinvitrocytotoxic effect[J]. Food Chemistry,2013,141(141):2305-2313.

[3]Sawyer L,Kontopidis G. The core lipocalin,bovine beta-lactoglobulin[J]. Biochimica Et Biophysica Acta,2000,1482(1):136-148.

[4]Barbiroli A,Bonomi F,Ferranti P. Bound fatty acids modulate the sensitivity of bovineβ-lactoglobulin to chemical and physical denaturation[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2011,59(10):5729-5737.

[5]Pérez M D,Calvo M. Interaction of beta-lactoglobulin with retinol and fatty acids and its role as a possible biological function for this protein:a review[J]. Journal of Dairy Science,1995,78(5):978-988.

[6]Puyol P,Perez M D,Mata L,et al. Effect of retinol and fatty acid binding by bovineβ-lactoglobulin on its resistance to trypsin digestion[J]. International Dairy Journal,1993,3(7):589-597.

[7]Puyol P,Perez M D,Peiro J M,et al. Effect of binding of retinol and palmitic acid to bovineβ-lactoglobulin on its resistance to thermal denaturation[J]. Journal of Dairy Science,1994,77(6):1494-1502.

[8]Li?ková K,Auty M A E,Chaurin V,et al. Cytotoxic complexes of sodium oleate withβ-lactoglobulin[J]. European Journal of Lipid Science & Technology,2011,113(10):1207-1218.

[9]鐘俊楨,劉成梅,劉偉,等. 動態高壓微射流技術對乳清蛋白性質的影響[J]. 食品科學,2009,30(17):106-108.

[10]涂越,劉偉,鐘俊楨,等. 低聚木糖修飾對牛乳β-乳球蛋白功能性質的影響[J]. 中國乳品工業,2012,40(12):12-15.

[11]Liu C M,Zhong J Z,Liu W,et al. Relationship between functional properties and aggregation changes of whey protein induced by high pressure microfluidization[J]. Journal of Food Science,2011,76(4):E341-E347.

[12]Trevino S R,Scholtz J M,Pace C N. Measuring and increasing protein solubility[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences,2008,97(10):4155-4166.

[13]Anandharamakrishnan C,Rielly C D,Stapley A G F. Loss of solubility ofα-lactalbumin andβ-lactoglobulin during the spray drying of whey proteins[J]. LWT-Food Science and Technology,2008,41(2):270-277.

[14]Zhong J Z,Liu W,Liu C M,et al. Aggregation and conformational changes of bovineβ-lactoglobulin subjected to dynamic high-pressure microfluidization in relation to antigenicity[J]. Journal of Dairy Science,2012,95(8):4237-4245.

[15]Damodaran S. Protein stabilization of emulsions and foams[J]. Journal of Food Science,2005,70(3):R54-R66.

[16]Fachin L,Viotto W H. Effect of pH and heat treatment of cheese whey on solubility and emulsifying properties of whey protein concentrate produced by ultrafiltration[J]. International Dairy Journal,2005,15(4):325-332.

[17]Akita E M,Nakai S. Lipophilization ofβ-lactoglobulin:effect on hydrophobicity,conformation and surface functional properties[J]. Journal of Food Science,1990,55(3):711-717.

[18]Ortiz S E M,Puppo M C,Wagner J R. Relationship between structural changes and functional properties of soy protein isolates-carrageenan systems[J]. Food Hydrocolloids,2004,18(6):1045-1053.

[19]Halling PJ. Protein-stabilized foams and emulsions[J]. Critical Reviews in Food Science & Nutrition,1981,15(2):155-203.

[20]Nakai S. Structure-function relationships of food proteins with an emphasis on the importance of protein hydrophobicity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1983,31(4):676-683.

[21]Collini M,D'Alfonso L,Molinari H,et al. Competitive binding of fatty acids and the fluorescent probe 1-8-anilinonaphthalene sulfonate to bovineβ-lactoglobulin[J]. Protein Science,2003,12(8):1596-1603.

[22]Collini M,D'Alfonso L,Baldini G. New insight onβ-lactoglobulin binding sites by 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate fluorescence decay[J]. Protein Science,2000,9(10):1968-1974.

[23]Shimizu M,Saito M,Yamauchi K. Emulsifying and structural properties ofβ-Lactoglobulin at different pHs[J]. Agricultural & Biological Chemistry,1985,49(1):189-194.

Effect of interaction with oleic acid on functional properties ofβ-Lactoglobulin during DHPM treatment

LIU Cheng-mei,YU Hong-da,ZHONG Jun-zhen*,HONG Qi-tong,LIU Wei

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

The mixture ofβ-lactoglobulin(β-LG)and oleic acid was treated by dynamic high pressure mircrofluidization(DHPM). The effect of interaction with oleic acid on the functional properties and surface hydrophobicity ofβ-LG during DHPM treatment was investigated. Compared with standardβ-LG,the functional properties and surface hydrophobicity of the unteated mixture had no significant changes(p>0.05). With DHPM pressure increasing from 40 MPa to 160 MPa,the functional properties and surface hydrophobicity ofβ-LG/oleic acid complex were increased initially and then decreased. At 80 MPa,the solubility and foaming activity of complex were the biggest,respectively,95.36% and 32.00%,while the maximum surface hydrophobicity and emulsifying activity of 640.20,1.09 were obtained at 120 MPa respectively. A positive correlation between surface hydrophobicity and emulsifying activity was observed. The results indicated that the changes of functional properties and surface hydrophobicity were related to the extent of the interaction betweenβ-LG and oleic acid altered by DHPM treatment.

β-lactoglobulin;oleic acid;dynamic high pressure mircrofluidization;functional properties

2015-06-18

劉成梅(1963-),男,博士,教授,研究方向:食物資源利用與開發,E-mail:916504978@qq.com。

鐘俊楨(1984-),女,博士,副研究員,研究方向:食品科學與工程,E-mail:zhongjunzhen@163.com。

國家自然科學基金資助項目(21366021)；南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室青年研究基金項目資助(SKLF-QN-201518)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)03-0088-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.009