棕櫚酸與油酸影響肝細胞功能的比較研究

劉　萌,吳永沛,劉翼翔,陳海秀

(集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021)

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棕櫚酸與油酸影響肝細胞功能的比較研究

劉萌,吳永沛,劉翼翔*,陳海秀

(集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021)

膳食中不平衡的脂肪酸攝入導致一系列慢性代謝綜合征的產生,嚴重威脅人體健康。以體外肝細胞模型為研究對象,以細胞增殖、細胞膜完整性、炎癥產生水平及胞內脂質累積為指標,通過比較油酸和棕櫚酸對肝細胞功能的影響,以期評估過量膳食脂質對人體健康的影響,減少慢性病的產生。結果表明不同膳食脂肪酸對肝細胞的影響明顯不同:棕櫚酸的細胞毒性大,抑制細胞的增殖,破壞細胞膜的完整性,容易導致肝炎發生;油酸則更容易導致肝細胞脂質累積,引起脂代謝異常;復合脂肪酸(油酸∶棕櫚酸的摩爾比為2∶1)的細胞毒性有所下降,但仍然容易導致肝細胞脂肪變性。實驗結果為合理的膳食攝入油脂提供了理論依據。

脂肪酸,肝細胞,脂質累積,油酸,棕櫚酸

近年來我國居民生活水平不斷提高,膳食中雜糧攝入量減少,油脂攝入量明顯增高,不平衡的油脂攝入致使脂代謝紊亂,肥胖、脂肪肝、心血管疾病等健康問題日益明顯。研究表明[1],過量油脂攝入會引起血漿脂肪酸水平升高,刺激脂質合成基因表達,導致肝細胞脂質過量蓄積而形成脂肪肝。

大量研究表明[2],不同脂肪酸對人體健康有著不同的影響。日常飲食中存在最多的脂肪酸是棕櫚酸(palmitic acid,PA,16∶0)和油酸(oleic acid,OA,18∶1)[3]。PA多存在于動物性脂肪中,如牛油、奶油、豬油和黃油等。PA對胰腺β細胞、心肌細胞、乳腺癌細胞等有較強的脂毒性,可啟動內質網應激誘導細胞凋亡[4]。OA幾乎存在于所有的植物油和動物脂肪中,其中以紅花籽油、橄欖油、棕櫚油、低芥酸菜子油、花生油、茶籽油、杏仁油和魚油中含量最高。OA具有降低血液總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇、升高高密度脂蛋白膽固醇的生理功能。然而,過量OA也會導致肝細胞脂質累積[5]。

雖然人們在膳食脂肪酸的脂代謝途徑方面進行了大量的研究[6-7],但忽視了脂肪酸對肝細胞功能的影響。因此,本實驗以常見膳食油脂中的主要脂肪酸為研究對象,從膳食營養角度評估脂肪酸對肝細胞增殖能力、細胞膜完整性、炎癥產生情況及胞內脂質累積方面的影響,為居民膳食油脂的合理攝入提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

HepG 2細胞株廈門大學生命科學學院,實驗所用其它試劑均購自Sigma公司。谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉氨酶(AST)試劑盒、甘油三酯(TG)含量試劑盒南京建成;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、蛋白濃度試劑盒碧云天試劑公司;油紅O阿拉丁網站。

二氧化碳培養箱Thermo公司;酶標儀Tecan公司;漩渦震蕩儀IKA公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養HepG 2細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養,置于37 ℃,5%二氧化碳培養箱中,隔天換液,細胞鋪滿瓶底80%左右,用0.25%胰酶消化傳代。調整細胞密度后接于96孔板和24孔板,待細胞長至80%左右,以不同濃度脂肪酸誘導處理24 h,然后測定細胞存活率,ALT、AST釋放量,細胞TG累積程度,并用油紅O染色觀察細胞內脂滴形態。

1.2.2脂肪酸的配制由于OA與PA在日常飲食中主要以2∶1的比例存在[3],因此將復合脂肪酸FA中的OA與PA的摩爾比定為2∶1。將所需劑量的脂肪酸用乙醇助溶,溶于pH為10的含一定量牛血清白蛋白的不完全DMEM培養基中,超聲溶解,最后將復合物溶液pH調為7.4,0.22 μm膜過濾分裝,-20 ℃貯存。

1.2.3細胞存活率的測定24 h培養后,移去上清,于各孔加入一定量的0.5 mg/mL的MTT溶液,之后繼續置于37 ℃的培養箱中培養4 h,加入DMSO終止反應,震蕩培養板,酶標儀測定OD570值,以OD620值為參考。以正常對照組細胞活力設為100%,各處理組與對照組的比值為細胞存活率。

1.2.4LDH含量的測定LDH釋放被看做細胞膜完整性的重要指標,細胞凋亡或壞死而造成細胞膜結構的破壞會導致細胞漿內的酶釋放到培養液中[8]。采用商業LDH試劑盒測定,并按試劑盒操作步驟測定細胞上清液中LDH含量,結果以OD值表示。

1.2.5細胞ALT、AST的測定參照試劑盒測定方法,做出標準曲線,結果以U/L表示。

1.2.6尼羅紅熒光測定TG累積參照Donato[9]的方法,并進行改進。24 h培養后,移去上清,以PBS沖洗2次,0.25%胰酶消化,消化完全后加入完全培養基,吹打細胞,3000 r/min離心5 min,棄上清,加適量1 μmol/L的尼羅紅溶液,充分混勻,避光37 ℃孵育15 min,3000 r/min離心5 min,棄上清,加適量PBS,混勻,在激發波長488 nm,發射波長550 nm處測定熒光值。

4D技術是將模型同施工有效連接起來，利用立體模型對整個施工流程實施模擬操作，將各環節施工模型和施工計劃導入到系統中，實行施工進度的模擬分析，這樣一方面能夠及時調整施工計劃，另一方面也便于工作人員掌握施工預算等信息。

1.2.7油紅O染色染色液的配制:稱取一定量油紅O溶于異丙醇中,室溫靜置2 h后過濾,配制成0.5%的油紅O貯備液。使用前按照油紅O和蒸餾水的比例為3∶2的比例稀釋貯備液,室溫靜置后過濾兩次,即為油紅O染色液。

24 h培養后,移去上清,以PBS沖洗2次,75%酒精固定15 min,再用PBS沖洗2次,用60%異丙醇媒染1～2 min,用油紅O染色30 min,蒸餾水沖洗2次,于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.8數據分析通過excel軟件對數據進行分析作圖,實驗結果以平均值±標準誤差(Mean±SD)表示。

2　結果與分析

2.1脂肪酸處理對細胞增殖的影響

活細胞線粒體中的琥珀酸脫氧酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的甲瓚,通過測定其光吸收值,可間接反映活細胞數量[10]。我們評價樣品處理濃度對細胞增殖的影響遵從以下幾個條件:處理組和對照組的存活率差異在10%以內時即大于90%時,則認為處理組濃度對細胞增殖無影響,存活率在80%～90%范圍內認為處理組濃度對細胞是有一定影響,如果存活率低于80%時認為處理組濃度對細胞有毒害作用[11]。從圖1中可以看出,細胞增殖率隨著OA、FA濃度的增加而逐漸增加,在OA濃度為0.50 mmol/L時達到了96.90%,FA誘導濃度為0.25 mmol/L時,細胞存活率達到了95.35%,對細胞均無毒性影響。然而細胞增殖率則隨著PA濃度的增加而降低,即使是在PA較低濃度0.10 mmol/L時,增殖率也只有82.25%,活細胞數明顯減少,對于細胞增殖有一定影響。這一點與田曉媛[1]研究結果相似。同一處理濃度下,單不飽和脂肪酸OA誘導的細胞存活率要遠高于飽和脂肪酸PA誘導的存活率,這也從側面一定程度上證明了攝入過多的脂肪酸時,PA的毒性要大于OA。

圖1　脂肪酸處理下的細胞增殖情況Fig.1　The effect of fatty acid treatment to cell proliferation(n=5)

2.2細胞膜完整性的測定

圖2　細胞膜完整性的測定Fig.2　The integrity of cell membrane(n=5)

2.3細胞內炎癥水平的產生測定

ALT主要存在于肝細胞漿內,只要有1%的肝細胞壞死,就可以使血清酶增高一倍。因此,ALT被世界衛生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標。AST則主要存在于肝細胞線粒體內,當肝臟細胞發生嚴重壞死或破壞時,血清AST水平顯著升高。因此,ALT和AST水平是用于判定肝細胞炎癥發生的關鍵生化指標[12]。表1表明,與空白組相比,OA組在0.1～0.75 mmol/L各濃度范圍內ALT和AST水平均無顯著性差異;當誘導濃度達到1.00 mmol/L時,細胞培養液中ALT水平提高了14.30%。PA處理中,當誘導濃度在0.10 mmol/L時,ALT水平已經達到空白組的1.14倍,AST達到空白組1.40倍,表明細胞已經出現炎癥。對于OA與PA以摩爾比1∶2混合得到的復合脂肪酸FA,當誘導濃度≤0.75 mmol/L時,細胞上清液ALT水平變化不明顯,僅在1.00 mmol/L的濃度下AST水平顯著增高。對比三種脂肪酸處理,可明顯看出PA更易使肝細胞出現炎癥,這一點與Ricchi[13]等人報道一致。

表1　ALT和AST水平Table 1　The content of ALT and AST(n=5)

注:a,b,c,d代表顯著性差異(p<0.05),相同字母則表示沒有顯著性差異。

2.4脂肪酸處理對胞內TG累積影響

在臨床上,TG累積常作為脂肪肝病理發生的關鍵指標。實驗中我們采用改良后的尼羅紅染色熒光測定胞內TG累積作為量化標準。尼羅紅是一種重要的親脂性染料,能夠與活體細胞內的中性脂或其他脂類物質發生反應,經常被用做胞內脂肪含量的熒光檢測染色,與細胞中中性脂反應后,在激發光波長450～550 nm,發射光波長大于528 nm時,在熒光顯微鏡下觀測到的是金黃色熒光;極性脂與尼羅紅反應后,在激發光波長515～560 nm,發射光波長大于590 nm時,可觀測到紅色熒光[14]。

圖3　細胞內TG累積Fig.3　Intracellular accumulation of TG(n=5)注:上圖為OA和FA誘導的細胞內TG累積, 下圖為PA誘導的胞內TG累積。

實驗測得脂肪酸誘導處理后各組細胞內TG水平如圖3所示。上圖顯示,在0.01～0.50 mmol/L濃度范圍,隨著OA與FA誘導濃度的增大,所測得的熒光強度逐漸上升,表明胞內TG累積量增加,表現出劑量依賴性。OA處理組在0.50 mmol/L誘導濃度下,TG累積的熒光強度是空白的6倍,FA處理組在0.50 mmol/L誘導濃度下,TG累積的熒光強度是空白的5倍。當OA與FA的誘導濃度升高至1.00 mmol/L時,熒光強度出現下降,這可能是由于高劑量OA與FA導致肝細胞數量下降的原因造成的。而PA處理組在0.01 mmol/L誘導濃度下,TG累積的熒光強度是空白的1.40倍。隨著誘導濃度升高,TG累積并沒有明顯變化。

圖4　脂肪酸濃度對細胞脂滴沉積影響Fig.4　The effect of fatty acid concentrations to cell lipid droplets deposition

有研究表明,在高血脂、肥胖、糖尿病等疾病狀態下,人體血漿自由脂肪酸的濃度在0.5 mmol/L以上[15],通過以上研究比較,我們發現對細胞內脂質累積影響最大的是0.50 mmol/L的OA處理組,與報道基本一致[16]。

2.5脂肪酸處理后的油紅染色細胞形態學觀察

肝細胞經脂肪酸誘導處理后采用油紅O染色,置于400倍倒置顯微鏡下觀察,結果如圖4所示?？瞻捉M中細胞邊緣清晰,胞漿豐富,核膜完整,未見有紅色脂滴沉積。隨著誘導濃度的增大,細胞內紅色脂滴數量逐漸增多。在0.50 mmol/L各處理組中,均可見明顯的紅色脂滴環繞于細胞周圍,繼續增大誘導濃度,則發現PA誘導組視野里的細胞數逐漸減少,這與細胞存活率和LDH、ALT和AST含量變化規律一致,證明了PA有較大的毒性,抑制了細胞的生長,加速了細胞的破裂。在0.75 mmol/L各處理組中,紅色脂滴數量增多,部分胞內紅色脂滴融合變大,脂滴呈現典型的印戎樣,細胞輪廓較為清晰。在1.00 mmol/L各處理組中,視野內細胞有些減少,脂滴仍然大量累積變大,細胞邊緣模糊,此時胞內脂肪變性。

3　結論

實驗結果表明,膳食中的飽和脂肪酸PA對肝臟細胞的毒性要遠大于單不飽和脂肪酸OA和復合脂肪酸FA。過量PA能抑制肝細胞生長,使細胞膜破裂,導致肝細胞TG累積和炎癥的產生。相對PA而言,OA和FA則對肝細胞沒有明顯毒害作用,但更易導致胞內脂質累積,說明過量單不飽和脂肪酸會加重肝細胞脂代謝負擔,導致脂肪肝的發生。因此,健康膳食油脂中應減少飽和脂肪酸PA的比例,控制單不飽和脂肪酸的攝入量,使各種脂肪酸達到合理的比例,從而避免對肝細胞功能造成傷害。

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A comparative study of palmitic acid and oleic acid on liver cell function

LIU Meng,WU Yong-pei,LIU Yi-xiang*,CHEN Hai-xiu

(College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China)

Imbalance of fatty acids in dietary intake is one of the main causes of inducing chronic metabolic syndrome,which threatened the health of mankind. Theinvitrocellular model was employed and the evaluation indexes,including cell proliferation,cell membrane integrity,inflammatory factor,and intracellular lipid accumulation,were detected. Therefore,the dietary fatty acids,oleic acid,palmitic acid,as well as the two fatty acids’ complex,were selected to assess how the excess dietary lipids influence on liver health in this work. This study demonstrated that the different dietary fatty acids exhibited different effects on liver cells. Palmitic acid shows higher cytotoxicity than oleic acid. Palmitic acid can induce cell apoptosis and disrupt the cell membrane integrity at lower doses. However,oleic acid,with the lower cytotoxicity,can cause the lipid accumulation in liver cells more easily. As far as the mixed fatty acids(oleic acid/palmitic acid,2∶1 ratio),although they exhibit lower cytotoxicity,inducing the lipid steatosis easily in liver cells was also observed. The experimental results for provides theory basis for reasonable dietary fat intake.

fatty acids;liver cells;lipid accumulation;oleic acid;palmitic acid

2015-08-11

劉萌(1992-)，女，研究生，研究方向：功能性食品開發，E-mail:873675645@qq.com。

劉翼翔(1982-)，男，博士，副教授，研究方向：海洋生物活性物質利用與開發，E-mail:lyxjmu@163.com。

國家海洋局公益項目(201205022-6)；福建省自然科學基金(2015J01139)；廈門市科技計劃項目(3502Z20143019)。

TS254.5

A

1002-0306(2016)03-0347-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.064