紅酵母紅素對氧化應激細胞PC12細胞的保護機制

張 丹，桑衛國（寧波大學海洋學院，浙江寧波315211）

紅酵母紅素對氧化應激細胞PC12細胞的保護機制

張 丹，桑衛國*
（寧波大學海洋學院，浙江寧波315211）

探究紅酵母紅素對氧化應激細胞的保護機制。PC12細胞（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞）分為對照組、模型組（200 μmol/L H2O2）、番茄紅素組（20 μmol/L番茄紅素+200 μmol/L H2O2，陽性對照組）和紅酵母紅素組（1 μmol/L紅酵母紅素+200 μmol/L H2O2、2 μmol/L紅酵母紅素+200 μmol/L H2O2和3 μmol/L紅酵母紅素+200 μmol/L H2O2），分別觀察PC12細胞的形態變化，檢測細胞凋亡率、半胱氨酸蛋白酶Caspase-3的活性及細胞中促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達含量。結果表明，與模型組相比，3 μmol/L的紅酵母紅素能維持細胞原有形態，降低了11.6%的細胞凋亡率（p＜0.05），抑制了62.92%的Caspase-3活性（p＜0.01），進一步研究發現紅酵母紅素能夠下調Bax的表達（p＜0.01），上調Bcl-2的表達（p＜0.01），從而阻止了凋亡鏈反應。綜上所述，紅酵母紅素可能通過抑制Caspase-3活性，調節Bax和Bcl-2的表達來發揮對氧化應激細胞的保護作用，且其作用存在劑量依賴性。

紅酵母紅素，氧化應激，保護機制，PC12細胞，凋亡

當受到氧化劑的刺激時，機體會產生過多的活性氧（ROS），會與細胞膜上的各種不飽和脂肪酸和膽固醇反應，導致自由基連鎖反應，抗氧化體系失調，引起不同程度的細胞毒性，同時細胞內的信號傳導途徑發生改變，最終導致細胞的凋亡［1］。生物體內存在的各種自由基通過多種途徑可導致細胞凋亡，包括：氧自由基直接損傷細胞核；激活半胱氨酸蛋白酶Caspase-3；調控腫瘤壞死因子等［2-4］。

紅酵母紅素（結構式見圖1）具有和番茄紅素（結構式見圖2）相似的化學結構。目前，紅酵母紅素的研究主要集中在其生物上游優化發酵提高色素產量方面，對關于其功能活性研究較少。但從化學結構的角度來看，Babin A等［5］以及Lee等［6］報道了紅酵母紅素在體外具有轉化為維生素A的能力，這可能與其具有

滿足生成維生素A的結構—無取代基的β-芷香環和側面具有11個碳原子的聚合鏈有關，所以其可能有β-胡蘿卜素所特有的維生素A前體功能。番茄紅素在一定條件下可發生順反異構化和氧化降解并且番茄紅素對氧化反應比較敏感，其溶液經日光照射12 h后，其中的番茄紅素基本上損失殆盡。然而，紅酵母紅素具有14個共軛雙鍵，目前認為共軛雙鍵的數目和抗氧化活性之間是有聯系的，所以紅酵母紅素可能具有清除自由基的作用。研究新型類胡蘿卜素對氧化應激的抑制具有一定的科研和應用價值，為類胡蘿卜素的廣泛開發利用提供理論基礎。目前為止，發酵法生產番茄紅素還未能進行工業化生產，如果可進行發酵工業化生產的紅酵母紅素具有和番茄紅素相比擬的功能活性，那么其應用前景是非常樂觀的。

圖1 紅酵母紅素結構式Fig.1 Structural formula of torularhodin

圖2 番茄紅素結構式Fig.2 Structural formula of lycopene

PC12細胞（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞）廣泛用于神經系統疾病的體外研究，也是在機體內最容易受到氧化應激損傷的細胞之一，所以本實驗以其為模型細胞。與此同時，H2O2常常作為模擬氧化應激的誘導劑。本實驗中采用PC12細胞和H2O2來建立氧化應激細胞模型，通過研究細胞的凋亡水平，可以進一步地了解紅酵母紅素對氧化應激的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PC12細胞（小鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株） 上海細胞所；紅酵母紅素（純度≥95%） 江南大學生物工程學院；番茄紅素（純度≥95%） 美國Sigma公司；DMEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清 美國Gibco公司；碘化丙啶（PI，純度≥94%）、Hoechst33342（純度≥98%） 南京建成生物工程研究所；AnnexinVFITC細胞凋亡檢測試劑盒、Caspase-3試劑盒 碧云天生物技術研究所；兔抗鼠β-actin抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體 美國Cell sinaling公司；其他試劑 均為分析純試劑。

BX51型倒置相差顯微鏡、TH4-200熒光顯微鏡 日本Olympus公司；FACSCalibur流式細胞儀 美國BectonDickinson公司；SpectraMax M5/M5e酶標儀 美國Molecular Devices公司；FluorChem FC3化學發光成像分析系統 美國ProteinSimple公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅酵母紅素溶液的制備 將經0.22 μm濾膜過濾除雜除菌，高度純化的紅酵母紅素溶于細胞培養液中，分別配成1、2和3 μmol/L的紅酵母紅素溶液。

1.2.2 實驗分組及處理 采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基在37℃下培養PC12細胞，并用質量分數為0.25%胰蛋白酶溶液進行消化傳代［7］。待PC12細胞在細胞培養皿中培養24 h后，吸出培養液，隨機分為六組：對照組、模型組、番茄紅素組和三組紅酵母紅素的實驗組。對照組：加入細胞培養液連續培養26 h；模型組：先加入細胞培養液培養24 h后，再加200 μmol/L H2O2溶液繼續培養2 h；番茄紅素組：加20 μmol/L番茄紅素培養細胞24 h，加200 μmol/L H2O2溶液繼續培養2 h，作為陽性對照；三組紅酵母紅素的實驗組：分別加1、2和3 μmol/L紅酵母紅素溶液培養細胞24 h，加200 μmol/L H2O2溶液繼續培養2 h。

1.2.3 細胞形態的觀察 PC12細胞在細胞培養皿中按上述方法1.2.2培養后，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率

收集各組細胞，先1000×g離心5 min，吸走上清，加入200 μL Annexin V-FITC結合液吹打重懸細胞，在25℃避光孵育10 min，然后按上述同樣方法離心，吸走上清，再加入190 μL Annexin V-FITC結合液吹打重懸細胞，最后加入10 μL PI染色液，小心混勻，冰浴避光保存。隨即進入流式細胞儀以525 nm綠色熒光和620 nm紅色熒光檢測細胞凋亡率。

1.2.5 Caspase-3活性的檢測 采用碧云天試劑盒檢測Caspase-3活性。Casepase-3的底物催化產物對硝基苯胺（pNA）在405 nm附近有強吸收，從而可以通過測定吸光度來檢測Caspase-3的活性。

1.2.6 Western-blot檢測細胞內相關蛋白表達水平

將各組細胞提取蛋白，并用二喹啉甲酸（BCA）法測定其濃度。按每孔10 μL點樣，用12.5%的SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）進行凝膠電泳，等蛋白完全分離后，采用半干法將蛋白轉至PVDF膜。接著，放入含5%牛血清蛋白的洗膜緩沖液中，在室溫條件下封閉1 h。根據分子量大小剪下目的條帶分別加入一抗：β-actin抗體（1∶1000）、Bax抗體（1∶1000）和Bcl-2抗體（1∶1000），4℃孵育過夜。取出條帶，洗滌后放入二抗，室溫孵育1 h，最后洗膜并用3，3-二氨基聯苯胺（DAB）顯色，成像，使用電泳圖像分析系統進行分析。

1.2.7 數據處理與統計方法 數據為至少三次的平行數據結果，以平均數±標準差表示，用SPSS 17.0統計軟件進行t檢測，p值是接受兩均值存在差異這個假設可能犯錯的概率。p＜0.05代表差異具有顯著性，p＜0.01代表差異具有高度顯著性。

2 結果與分析

2.1 紅酵母紅素對PC12細胞形態的影響

圖3為倒置相差顯微鏡下觀察的PC12細胞形態。從圖3-A可以看出，正常的PC12細胞自由伸展、呈現纖維狀，細胞形態清晰分明；而圖3-B中模型組的PC12細胞不再自由伸展，皺縮成球形，不少細胞漂浮而死。在紅酵母紅素預孵育的情況下，細胞一定程度上受到了保護，即使后續加入H2O2，細胞形態也沒有

太大的異常，如圖3-D、圖3-E、圖3-F，細胞邊界清晰，大部分仍成自由伸展狀態，其中3 μmol/L的紅酵母紅素保護的細胞形態最好，依舊大部分呈現角狀梭狀，正常生長。

H2O2作用于細胞時，會導致脂質、蛋白質和DNA的結構發生改變。一旦組成細胞膜的蛋白質和脂質結構發生改變，細胞膜的流動性就會下降，穩定性隨之崩潰，細胞形態發生變化［8］。在本實驗中，得到不同濃度的紅酵母紅素在一定程度上保持了細胞膜的完整性，維持了PC12細胞的正常形態，從而對氧化應激細胞有保護作用。

圖3 紅酵母紅素對PC12細胞形態的影響Fig.3 Effect of torularhodin on the morphology of PC12 cell

2.2 紅酵母紅素對PC12細胞凋亡率的影響

處于凋亡早期的細胞會把磷酯酰絲氨酸外翻到細胞膜外側，磷酯酰絲氨酸暴露到細胞表面后會促進凝血和炎癥反應，而Annexin V和外翻到細胞表面的磷酯酰絲氨酸結合后可以減弱磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應活性。在Annexin V-FITC和PI染色后，使用流式細胞儀，正常的活細胞不被Annexin V-FITC和PI染色（流式圖的左下角區域）；凋亡早期的細胞僅被Annexin V-FITC染色（流式圖的右下角區域）；壞死細胞和凋亡晚期的細胞可以同時被Annexin V-FITC和PI染色（流式圖的右上角區域）。凋亡早期、壞死細胞和凋亡晚期的細胞所占比例的總和為細胞凋亡率。

見圖4，對照組細胞大部分出現在左下角區域，說明細胞處于正常狀態；當經過H2O2處理后，發現凋亡細胞明顯增加，凋亡早期和壞死細胞、凋亡晚期的細胞比例均有所升高，其細胞凋亡率為12.7%，比對照組高了12%；在經過紅酵母紅素的保護之后，細胞凋亡率顯著下降，分別從12.7%下降到5.7%、3.9%和1.1%，呈劑量依賴性，且與對照組相比3 μmol/L的紅酵母紅素組細胞凋亡率具有顯著性差異（p＜0.05）。

有研究通過Annexin V/PI雙染法測定細胞凋亡率發現氧化受損細胞的凋亡早期、壞死和凋亡晚期細胞比例明顯增加［9］。Qiang等［10］發現，相比模型組，三七總皂苷保護組的凋亡早期、壞死細胞和凋亡晚期細胞比例均有所減小，即三七總皂苷具有抗凋亡活性；與上述文獻報道結果相一致，本實驗結果證實紅酵母紅素

對H2O2誘導的細胞凋亡具有一定程度的改善作用，尤其對于凋亡早期的細胞具有特別顯著的保護作用。

圖4 紅酵母紅素對PC12細胞凋亡率的影響Fig.4 Effect of torularhodin on the apoptosis rate of PC12 cell

2.3 紅酵母紅素對PC12細胞Caspase-3活性的影響

Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，沒有活性，在凋亡的早期階段會被激活［11］，對染色體固縮等過程起到了重要的作用［12-13］，并可以直接特異性剪切DNA修復酶PARP，脫氧核糖核苷酸酶等。

從圖5中可以看出，模型組的Caspase-3活性提高到175.23%（p＜0.01），表明H2O2激發了細胞內Caspase-3的活化。同時，在不同濃度的紅酵母紅素對細胞保護培養后，Caspase-3活性都有一定程度的降低，其中3 μmol/L紅酵母紅素組的Caspase-3活性高度顯著降低到112.31%（p＜0.01），其保護效果最好。

Caspase-3在氧化應激介導的凋亡通路中起到了關鍵的作用［14］。實驗結果表明，H2O2激發了Caspase-3的活化，進行PARP的剪切，促使細胞凋亡，而不同濃度的紅酵母紅素抑制了這種促發機制，且存在一定的劑量依賴性，這與多篇報道對于氧化應激的作用機制研究結果是相類似的［15-16］。其中，3 μmol/L紅酵母紅素組具有高度顯著的調控作用。

圖5 紅酵母紅素對PC12細胞Caspase-3活性的影響Fig.5 Effect of torularhodin on the Caspase-3 activity of PC12 cell

2.4 紅酵母紅素對PC12細胞內相關蛋白表達水平的影響

在凋亡研究中促進和抑制細胞凋亡的蛋白有著關鍵作用，其中Bax蛋白為典型的促凋亡蛋白，而Bcl-2蛋白為抗凋亡蛋白［17］。當細胞受到氧化應激時，促凋亡蛋白Bax表達量增加，促發凋亡鏈反應［18］。而抗凋亡蛋白Bcl-2可以通過抑制線粒體通透性轉換孔的開放，阻止細胞色素的釋放，從而阻止一系列凋亡鏈反應［19］。

圖6是Bax和Bcl-2的表達情況，從圖7柱狀圖數據中可以看出，與對照組相比，模型組的Bax蛋白表達量明顯上調，增加幅度達到38.24%（p＜0.01），而Bcl-2的表達量降低了22.08%（p＜0.01）。但是通過加入番茄紅素或是不同濃度的紅酵母紅素對細胞進行保護后，與模型組相比，Bax蛋白的表達量呈現不同程度的下降，Bcl-2蛋白表達量也得到一定程度的恢復。其中3 μmol/L紅酵母紅素組的Bax蛋白表達量比模型組降低了37.46%（p＜0.05），其Bcl-2蛋白表達量上升18.89%（p＜0.01）。

從凋亡相關蛋白表達量的實驗結果來看，H2O2導致氧化應激相關蛋白的表達量發生變化，促使凋亡的發生，而不同濃度的紅酵母紅素對細胞進行保護后，下調促凋亡蛋白Bax表達，上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，從而阻止了凋亡鏈反應的發生，保護細胞免受氧化應激的損傷。

圖6 Western-blot檢測細胞內相關蛋白表達情況Fig.6 Testing related protein expression in cells by Western-blot

圖7 紅酵母紅素對PC12細胞的Bax、Bcl-2蛋白表達量的影響Fig.7 Effect of torularhodin on the Bax，Bcl-2 protein expression of PC12 cell

3 結論

在PC12細胞的氧化應激模型中，H2O2對PC12細胞進行氧化損傷，而不同濃度的紅酵母紅素均對氧化受損的細胞進行調控和保護，且調控能力呈現劑量依賴性，其中3 μmol/L紅酵母紅素具有較好的調控能力。紅酵母紅素能通過保護細胞膜，抑制Caspase-3的活性，有效調控Bax和Bcl-2蛋白的表達量，從而發揮抗凋亡活性，對氧化應激細胞產生保護作用。

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Cytoprotective mechanism of torularhodin against oxidative stress

ZHANG Dan，SANG Wei-guo*
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

This study aims to investigate the cytoprotective mechanism of torularhodin against oxidative stress.PC12 cells were randomly divided into control group and model group（200 μmol/L H2O2），lycopene group （20 μmol/L lycopene+200 μmol/L H2O2，positive control group）and torularhodin groups（1 μmol/L torularhodin+200 μmol/L H2O2，2 μmol/L torularhodin+200 μmol/L H2O2and 3 μmol/L torularhodin+200 μmol/L H2O2）.The changes of PC12 cell morphology were observed，while the apoptosis rate of cell，the activity of Caspase-3 and expressions of pro-apoptotic protein Bax and anti-apoptotic protein Bcl-2 were also detected.Results showed that 3 μmol/L torularhodin could maintain the original shape of cell，reduce 11.6% apoptosis rate（p＜0.05）and inhibit 62.92% Caspase-3 activity（p＜0.01），comparing with the model group.Further study demonstrated that torularhodin could down-regulate the expression of Bax（p＜0.01）and up-regulate the expression of Bcl-2 （p＜0.01），which thereby prevented chain reaction of apoptosis and protected cells from oxidative stress.In a word，torularhodin could effectively protect cells against oxidative stress，by mechanisms which probably involves the inhibition of Caspase-3 activity and adjustment of Bax，Bcl-2 expression in dose-dependent manner.

torularhodin；oxidative stress；protect mechanism；PC12 cells；apoptosis

TS264.4

A

1002-0306（2016）08-0120-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.016

2015-09-08

張丹（1987-），女，碩士，研究方向：生物技術及功能性食品，E-mail：1030453360@qq.com。

*通訊作者：桑衛國（1954-），男，副教授，研究方向：生物技術、食品研發和海洋生物分子育種，E-mail：282324079@qq.com。