復合酶輔助浸提綠茶多酚工藝條件優化

鄭生宏，繆葉旻子，嚴 芳，邵靜娜，何衛中（浙江省麗水市農業科學研究院，浙江麗水323000）

復合酶輔助浸提綠茶多酚工藝條件優化

鄭生宏，繆葉旻子，嚴 芳，邵靜娜，何衛中*
（浙江省麗水市農業科學研究院，浙江麗水323000）

采用纖維素酶+果膠酶的復合酶法在較適溫度下輔助浸提綠茶多酚，以茶多酚浸提率為考察指標，通過單因素和正交實驗優化了酶添加量、料液比、浸提溫度和浸提時間等四個浸提條件因素，確定了最佳浸提工藝條件為：纖維素酶和果膠酶分別添加0.3%，料液比1∶40 g/mL，浸提溫度50℃，浸提時間45 min；在此條件下茶多酚浸提率可達21.36%，明顯高于傳統水提法的茶多酚浸提率17.41%。

復合酶解，茶多酚，浸提，條件優化

茶多酚（TP）是茶葉中重要的次級代謝產物之一，約占茶鮮葉干重的18%～36%，對機體的活性氧自由基和脂類自由基具有較強的清除能力，其還具有防癌抗癌、殺菌抑菌、抗過敏、抗輻射等作用［1］，已被列為食品添加劑，在食品加工、醫藥、農業、日用化工等領域均有重要應用［2-4］。近年來提取茶多酚的主要方法包括溶劑提取法、離子沉淀法、柱層析法、超臨界萃取法、色譜法、超聲波法、微波法、酶法等［5］。這些方法主要都是通過有機溶劑（通常為乙醇）或者水在一定的條件下將茶多酚從細胞內浸提至溶劑中，然后采用物理或化學方法將其從浸提液中分離出來，因而茶多酚的提取可以歸納為浸提工序和分離工序兩個步驟。上述的茶多酚提取方法中，包括離子沉淀法、柱層析法以及色譜法的優勢主要體現在分離工序，而溶劑浸提法、超臨界萃取法、超聲波法、微波法和酶法的優勢主要體現在浸提工序，這其中超臨界萃取法因設備成本高且浸提率較低而很少使用［6］，而超聲波法、微波法和酶法可以看成是溶劑萃取法的輔助改進方法，能夠大大改善溶劑浸提法存在的周期長、浸提率較低等不足，成為目前研究的熱點之一［7-11］。而相較于超聲波法和微波法，酶法輔助浸提具有反應條件溫和，有效成分浸提率高等優點，又由于酶法提取是在非有機溶劑中進行，使得提取產物純度、穩定性、活性都較高，無污染，解決了有機溶劑提取法中，有機溶劑殘留及回收困難且乙醇用量大等缺點；此外，酶法提取在縮短浸提時間、降低能耗、降低提取成本等方面也具有一定的優勢。目前采用酶法提取，尤其是復合酶法提取茶多酚較少見諸報道［12-13］。基于此，本研究選用纖維素酶+果膠酶的復合酶輔助浸提綠茶中茶多酚，利用該復合酶在較適溫度下分解構成細胞壁及細胞間質的纖維素和果膠，從而提高茶多酚的溶解率和提取率。研究通過單因素和正交實驗優化復合酶浸提茶多酚工藝條件參數，以期最大限度提高茶多酚浸提率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麗水香茶 麗水市碧云天茶葉有限公司；纖維素酶（酶活10萬U/g）、果膠酶（酶活5萬U/g） 均購于江蘇銳陽生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、檸檬酸、福林酚、碳酸鈉等 均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

JFSD-100粉碎機 上海嘉定糧油儀器公司；HH-6電熱恒溫水浴鍋 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；PB-10酸度計 北京賽多利斯儀器系統有限公司；722N型可見分光光度計 優尼科儀器有限公司；AB104-N電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶多酚的提取 分別稱取3 g茶葉粉碎樣（精確至0.0001 g），加入若干純水和復合酶，攪拌均勻，根據前期實驗，復合酶選定為1∶1的纖維素酶：果膠酶。在酸度計下用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調pH 至5.0（折中選取），然后在一定的溫度和時間下水浴浸提，過濾，取濾液備用。

麗水香茶→粉碎樣→過篩（40目）→酶解輔助浸提→抽濾→濾液→含量測定

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 酶添加量單因素實驗 精確稱取同一批次茶葉粉碎樣3 g于5個三角瓶中，料液比1∶20 g/mL，在酶解溫度50℃，浸提時間40 min的條件下，考察不同酶添加量對麗水香茶茶多酚浸提率的影響。酶添加量分別設置為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（分別表示纖維素酶和果膠酶總添加量）共五個梯度。

1.2.2.2 料液比單因素實驗 精確稱取3 g茶葉粉碎樣5份置于三角燒瓶中，分別加入質量分數為0.4%復合酶，在酶解溫度50℃，浸提時間40 min的條件下，考察不同料液比對茶多酚浸提率的影響。實驗中，分別設置料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL共五個不同配比。

1.2.2.3 浸提溫度單因素實驗 精確稱取3 g茶葉粉碎樣5份置于三角燒瓶中，結合上述實驗結果，在酶添加量0.4%，料液比1∶40 g/mL的條件下，考察不同浸提溫度對茶多酚浸提率的影響，其中溫度設置為30、40、50、60、70℃共5個梯度進行比較實驗。

1.2.2.4 浸提時間單因素實驗 精確稱取3 g茶葉粉碎樣5份置于三角燒瓶中，分別按重量比0.4%加入纖維素酶和果膠酶，在料液比1∶40 g/mL，浸提溫度50℃的條件下，考察不同浸提時間對茶多酚浸提率的影響。浸提時間設置為30、45、60、75、90 min共5個水平。

1.2.3 正交實驗 在上述單因素實驗結果基礎上，以減少實驗次數和尋求最佳參數組合，選擇復合酶添加量、料液比、浸提溫度、浸提時間共4個因素，各因素設置3個水平，按照L9（34）正交表進行實驗設計，實驗因素及水平見表1。

1.2.4 茶多酚含量的測定 參照文獻［14］。

1.2.4.1 沒食子酸標準曲線繪制 移取0.1 mg/mL沒食子酸標準溶液于容量瓶中，加入2 mL Folin-酚試劑，反應3 min，加4.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，定容至100 mL，靜置1 h，于765 nm測定吸光度。

表1 酶法浸提茶多酚正交實驗因素和水平Table1 Factors and levels of orthogonal test for TP extraction with composite-enzymolysis

1.2.4.2 茶多酚浸提率的計算 準確量取樣品溶液

1 mL，加入2 mL Folin-酚試劑，反應3 min，加4.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，搖勻定容至100 mL，靜止1h，

765 nm下測定其吸光度，并按下式計算茶多酚含量。

式中：A：樣品液吸光度；V：提取液體積，mL；d：稀釋因子；SLOPEstd：沒食子酸標準曲線的斜率；m：樣品干物質含量，%；m1：樣品質量，g。

1.3 數據處理

茶多酚提取實驗數據、圖表處理在Excel 2003中進行，正交實驗采用DPS軟件設計分析。每次實驗均進行三次平行實驗，實驗結果用平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以沒食子酸標準液濃度為橫坐標，沒食子酸標準液吸光度為縱坐標，繪制標準曲線（圖1），得回歸方程為：y=0.1711x+0.0004，R2=0.9993，表明沒食子酸在0～1.0 mg/mL范圍內線性關系良好。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.1 酶法浸提條件單因素實驗

2.1.1 酶添加量對茶多酚浸提率的影響 由圖2可知，酶添加量在0.2%～0.4%之間時，茶多酚浸提率隨著酶添加量的增加而增加。這是由于纖維素酶和果膠酶可破壞茶葉的細胞壁與細胞間質，促使茶多酚等胞內物質快速擴散溶出，提高茶多酚等有效成分的浸提率。在達到0.4%以后，隨著酶添加量的繼續增加，茶多酚浸提率基本保持不變，說明添加量在0.4%

時，酶解反應完全，茶多酚已充分浸提出來，繼續增加對浸提率影響不大?；诖?，選用質量分數0.4%作為最適酶添加用量進行后續單因素實驗。

圖2 酶添加量對茶多酚浸提率的影響Fig.2 Effect of enzyme contents on extraction rate of TP

2.1.2 料液比對茶多酚浸提率的影響 由圖3可知，隨著料液比在1∶20～1∶60 g/mL范圍內不斷增加，茶多酚浸提率呈現出先增加后下降的變化趨勢，當料液比在1∶20～1∶40 g/mL之間時，隨著料液比的增加，茶多酚浸提率也相應增加；在達到1∶40 g/mL后，隨著料液比的繼續增加，茶多酚浸提率呈現出不斷下降的趨勢。這可能是由于隨著料液比的增加，體系中酶的濃度相應在不斷減小，致使酶活相對降低，從而導致復合酶水解纖維素和果膠質能力有所減弱，最終使得茶多酚浸提率不斷下降。因而，采取料液比1∶40 g/mL浸提效果較好。

圖3 料液比對茶多酚浸提率的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid rate on extraction rate of TP

2.1.3 浸提溫度對茶多酚浸提率的影響 從圖4可以看出，在所選的實驗溫度30～50℃范圍內，隨著浸提溫度的不斷提高，茶多酚浸提率也在不斷提高，且在50℃達到最大值，因而該溫度是整個酶體系最適作用溫度。50℃以后，隨著溫度繼續增加，茶多酚浸提率不斷下降。該結果說明在未達到最適作用溫度之前，升高溫度能促進酶解作用，使酶對細胞壁的破壞作用加強，進一步促使有效成分向細胞外擴散，升溫還能提供酶解反應所需能量，因而茶多酚浸提率在該溫度段不斷提高。之后，繼續提高溫度，致使具有蛋白質屬性的部分乃至全部酶超過其最適作用溫度而逐漸失活，從而酶促反應受到抑制。綜上，在溫度為50℃時，酶的活性能夠得到充分發揮，茶多酚浸提率達到最大，因此，選取50℃為最適浸提溫度。

圖4 浸提溫度對茶多酚浸提率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of TP

2.1.4 浸提時間對茶多酚浸提率的影響 由圖5可知，在所選時間段內，茶多酚浸提率隨著浸提時間的延長而呈現出先增加后下降而后基本保持不變的變化趨勢，在45 min中范圍內，茶多酚浸提率呈直線上升，說明隨著時間的延長，酶的活力充分得到發揮，酶解反應進行得較完全；45 min后，茶多酚浸提率有一定程度的下降，其原因可能是由于體系中已溶出的部分茶多酚發生了氧化聚合反應而轉變為其他物質，導致茶多酚含量減少；同時一些復合酶解產物，如花色素、單寧等本身就是纖維素酶的天然抑制劑，在溶液中濃度的累積也會對酶解反應造成抑制。綜上實驗結果，并非浸提時間越長越好，當浸提時間達到45 min時，茶多酚浸提率達到最大，因此，45 min為最佳酶解時間。

圖5 浸提時間對茶多酚浸提率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of TP

2.2 酶法浸提茶多酚正交優化實驗

由極差結果分析可知，料液比對茶多酚浸提率影響最大，其后依次為浸提時間、酶添加量和浸提溫度，最優參數組合為A3B2C2D2，即在酶添加量0.6%、浸提溫度50℃、料液比1∶40 g/mL、浸提45 min條件下，茶多酚浸提率最高。在此條件下對酶解法浸提茶多酚進行驗證實驗，同時以傳統水提法［15］為對照，3次平行，結果表明（表3）在最佳參數組合下，茶多酚浸提率達21.36%，均高于單因素實驗和正交實驗結果，表明此工藝具有一定的合理性。同時，與對照的傳統水提法相比，酶法茶多酚浸提率高出22.7%，且其條件溫和高效，操作簡單，因此復合酶解提取茶多酚是一種安全可靠的提取方法，具有很好的應用前景。

表2 正交實驗結果Table2 Results of orthogonal test by enzymolysis-assisted extraction

3 結論

選用纖維素酶和果膠酶的復合酶系對麗水香茶這一大宗綠茶進行茶多酚浸提實驗，通過單因素和正交實驗優化了酶法輔助浸提茶多酚條件參數，得到的最佳浸提條件為：復合酶添加量0.6%，料液比1∶40 g/mL，浸提溫度50℃，浸提時間45 min；在此條件下，茶多酚浸提率可達21.36%，明顯高于傳統水浸提法的茶多酚浸提率17.41%，且與傳統水提法相比，本復合酶解法還具有如下兩個優點，一是復合酶解法具有高效溫和、節能環保的優點，完全可以克服傳統水提法因在相對高溫長時條件下2次浸提茶葉中的茶多酚，致使浸提不充分、茶多酚尤其是兒茶素易氧化生成茶色素，與體系中咖啡堿、蛋白質生成茶乳酪，影響茶多酚的生物活性等不足。二是酶解法能促進茶葉內不利及無效成分的有益轉化，改善茶湯的色、香、味、形及營養價值等綜合品質，因而使得該法不僅局限于茶多酚的提取，而且可以作為改善風味和品質的方法之一應用于茶飲料生產，其應用前景可觀。

表3 復合酶浸提法與傳統水提法比較Table3 Comparison on extraction rate of TP between enzymolysis and boiling water

［1］宛曉春.茶葉生物化學［M］.北京：中國農業出版社，2003，319-330.

［2］陳鐿文.茶多酚粗品的精制及兒茶素單體分離的工藝研究［D］.西安：西北大學，2005.

［3］J D Lambert，C S Yang.Cancer chemopreventive activity and bioavailability of tea polyphenols［J］.Mutation Research，2003，523（1）：201-208.

［4］劉軍海，李志洲.茶葉中有效成分應用及其浸提工藝研究進展［J］.食品研究與開發，2007，28（3）：173-177.

［5］徐芳芳，朱蓓德，姜國偉，等.茶多酚浸提方法與藥理作用研究進展［J］.現代醫藥衛生，2012，28（7）：1033-1035.

［6］付勇，李萬林，張哲，等.茶多酚浸提方法的研究進展［J］.飲料工業，2013，16（5）：15-17.

［7］宋傳奎，肖斌，王艷麗，等.超聲波輔助浸提茶多酚工藝條件的優化［J］.西北農林科技大學學報：自然科學版，2011，39 （5）：133-139，146.

［8］郭樹琴，吳勝舉，牛春玲，等.超聲浸提綠茶茶多酚研究［J］.陜西師范大學學報：自然科學版，2009，37（7）：36-38.

［9］李剛鳳，汪輝喜，陳仕學，等.微波法浸提低檔綠茶多酚工藝研究［J］.糧食與油脂，2015，28（1）：60-62.

［10］謝藍華，肖南，張嘉怡，等.復合酶解輔助乙醇浸提茶多酚工藝研究［J］.茶葉科學，2013，33（1）：27-33.

［11］劉軍海，楊海濤，刁宇清，等.復合酶法浸提茶多酚工藝條件研究［J］.食品與機械，2008，24（3）：74-77，80.

［12］張衛紅.復合酶解法浸提茶葉中有效成分的過程研究［D］.西安：西北大學，2005.

［13］王元鳳，魏新林，王登良，等.金花茶葉酶法浸提工藝條件研究［J］.無錫輕工大學學報，2001，20（6）：582-587.

［14］GB/T 8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法［S］.北京：中國標準出版社，2008.

［15］龔志華，李麗，陳大海，等.綠茶無熱浸提技術研究［J］.湖南農業大學學報：自然科學版，2009，35（5）：558-560，579.

Optimizing of composite-enzymolysis assisted extraction process of green tea polyphenols

ZHENG Sheng-hong，MIAOYE Min-zi，YAN Fang，SHAO Jing-na，HE Wei-zhong*
（Lishui Academy of Agricultural Sciences，Lishui 323000，China）

Using cellulase and pectase as a mean of stimulus，composite-enzymolysis assisted extraction process of polyphenols from green tea was optimized in this investigation.The effects of factors as enzyme content，solid-to-liquid ratio，enzymolysis temperature，extraction time on the extraction rates of tea polyphenols were explored through single-factor and orthogonal test.The results showed that the optimal conditions were addition of 0.3%of cellulase and pectase respectively，solid-to-liquid ratio 1∶40 g/mL，enzymolysis temperature 50℃，enzymolysis time 45 min.Under such optimum conditions，extraction rate of green tea polyphenols reached up to 21.36%which was much higher than 17.41%obtained from traditional water extraction.

composite-enzymolysis；tea polyphenols；water extraction；condition optimization

TS272.2

A

1002-0306（2016）08-0211-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.035

2015－09－08

鄭生宏（1985-），男，碩士，助理研究員，研究方向：茶葉加工和茶生物化學，E-mail：zheng19851021@163.com。

*通訊作者：何衛中（1973-），男，高級農藝師，研究方向：茶葉加工技術，E-mail：Jnhwz@126.com。

現代農業產業技術體系建設專項資金資助（CARS-23）；麗水市茶葉產業科技創新團隊項目（2012cxtd05）。