液體發酵的桑黃多糖對小鼠免疫功能的影響

魏 靜，陳 力，鄧亞君，鄒 祥，徐興然（西南大學藥學院，重慶400715）

液體發酵的桑黃多糖對小鼠免疫功能的影響

魏 靜，陳 力，鄧亞君，鄒 祥，徐興然*
（西南大學藥學院，重慶400715）

研究液體發酵分離純化得到的桑黃多糖對小鼠免疫功能的影響。研究桑黃多糖對小鼠的免疫器官、碳廓清率以及IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α細胞因子的影響，發現桑黃多糖能顯著提高小鼠胸腺重量和脾臟重量，增強小鼠碳廓清率，增加IL-2和IFN一γ的含量，降低IL-1、IL-6、TNF-α的含量。證實桑黃多糖能顯著增強小鼠的機體免疫力，有一定的抗炎作用。

液體發酵，桑黃多糖，小鼠，免疫，細胞因子

桑黃是一種珍貴的藥用真菌，是國際公認抗癌效果較好的藥物，它的主要活性成分是桑黃多糖［1-3］?，F代研究表明，桑黃多糖通過細胞調節和體液免疫等提高機體免疫力而抑制腫瘤細胞的生長和轉移［4-5］。目前，國內外有各種桑黃類產品，包括抗癌藥品、提高機體免疫力的保健品等，市場需求量較大。

然而，桑黃的藥理研究大多使用的是桑黃子實體提取物，子實體栽培周期長，容易受自然氣候和原料等的限制［6］。隨著現代抗生素工業的迅速發展，液體發酵技術也廣泛應用到藥用真菌生產領域，該技術具有可大規模連續生產、周期短、產量高和生產效益高等優點［7］。實驗室利用桑黃發酵得到菌絲體［6］，通過分離純化制得桑黃多糖，本實驗參照中華人民共和國衛生部保健食品檢測與評價技術規范（2003版）［8］關于增強免疫力功能評價，研究該桑黃多糖對小鼠的免疫器官、碳廓清率以及IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、 IFN-γ、TNF-α細胞因子的影響，為其廣泛應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種（KM）小鼠 SPF級，雄性，13～17 g，購自重慶中藥研究所，實驗動物生產許可證號SCXK（渝）2012-0006；飼料 購自重慶中藥研究所；桑黃多糖口服液 由桑黃液體發酵液及其菌絲體分離純化制成，成分是桑黃多糖（含量為8.8 mg/mL），桑黃菌種由西南大學藥學院制藥工程研究室篩選保藏；大腸桿菌 由本實驗室保存；黃芪多糖口服液 艾迪森生物科技有限公司；IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-αELISA試劑盒 美國RD公司；注射用印度墨汁 Solarbio公司；0.1%Na2CO3。

ELX800型酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；離心機 Thermo公司；電子天平 北京賽多利斯儀器

系統有限公司；T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及處理 100只KM種小鼠，隨機分為五組：空白對照組（即為生理鹽水組，NS），黃芪多糖口服液組（陽性對照組，3.36 mL/kg），桑黃多糖口服液低劑量組（5 mg/kg）、中劑量組（10 mg/kg）、高劑量組（20 mg/kg）。每組20只，經灌胃給予受試樣品15 d，每天一次。給藥后間隔一定的時間補充飼料，不間斷給水。最后給藥1 h后進行測定［8-9］。

1.2.2 胸腺指數和脾指數測定 各組分別取10只，稱重，腹腔注射滅活的大腸桿菌，4 h內進行齜靜脈取血，小鼠處死后分別取出胸腺和脾臟，剝離脂肪組織，稱重，測定胸腺指數和脾臟指數指標。

胸腺指數（脾臟指數）=胸腺（脾臟）重量/體重

1.2.3 巨噬細胞功能測定 小鼠碳廓清實驗：各組分別取10只，稱重，每鼠尾靜脈注入注射用墨汁（0.1 mL/10 g·bw），注入后立即計時，于注入墨汁后2、10 min，分別從內眥靜脈叢取血20 μL，并立即將其加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。用紫外分光光度計在600 nm波長處測光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白對照。按下列公式計算廓清指數K：廓清指數K= （log OD2-log OD10）/（t10-t2）。OD2、OD10分別指注射墨汁后2 min（t2）和10 min（t10）的光密度值。

1.2.4 細胞因子測定 由1.2.2齜靜脈取得的全血，室溫放置1 h以上，3000 r/min離心10 min，取血清，備用。按照ELISA試劑盒的說明書，進行細胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的測定。

1.2.5 數據處理 用SPSS 19軟件進行數據處理，采用單因素方差分析法，先進行F檢驗，再進行多重比較分析（LSD法）。并應用OriginPro 8作圖對結果直觀顯示。

2 結果與分析

2.1 胸腺指數和脾指數測定

分別以不同劑量的桑黃多糖口服液、黃芪多糖口服液和生理鹽水灌胃小鼠，研究桑黃多糖對胸腺、肝臟等免疫器官的影響，結果見表1。

表1 桑黃多糖口服液對小鼠免疫器官重量的影響（n=10）Table1 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the weight of mice’s immunity organs（n=10）

由表1多重比較可知，與生理鹽水組比較，中劑量組（10 mg/kg）的桑黃多糖口液能使小鼠胸腺指數極顯著（p＜0.01）增加，脾臟指數顯著（p＜0.05）增加，高劑量組（20 mg/kg）的桑黃多糖口服液能使小鼠胸腺指數和脾臟指數極顯著（p＜0.01）增加。黃芪多糖口服液在說明書指定等效劑量下，小鼠胸腺指數極顯著（p＜0.01）增加。胸腺指數和脾臟指數是評價機體免疫功能的重要參數，而桑黃多糖高劑量組的胸腺指數和脾臟指數均高于黃芪多糖口服液組。桑黃多糖說明對小鼠的免疫功能有促進作用，且效果優于黃芪多糖口服液。

2.2 小鼠碳廓清實驗

巨噬細胞吞噬功能是特異性和非特異性免疫功能的一個重要指標，測定方法有兩大類：體內法和體外法。本實驗采用體內法進行小鼠碳廓清實驗，以吞噬指數表示小鼠碳廓清的能力，指數越大，則說明對異物的吞噬活性越高。其碳廓清指數和吞噬指數測定結果見表2。

表2 桑黃多糖口服液對小鼠碳粒廓清率的影響Table2 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the carbon clearance rate of mice

由表2可知，與生理鹽水組相比，桑黃口服液高劑量組碳廓清指數和吞噬指數顯著（p＜0.05）提高，說明顯著提高了小鼠碳廓清能力；而黃芪多糖口服液只能極顯著（p＜0.01）提高小鼠的碳廓清指數。說明桑黃多糖對小鼠的非特異性免疫有明顯的促進作用。

2.3 細胞因子測定

對實驗獲得的血清進行ELISA測定，結果見圖1～圖6。

圖1 桑黃多糖對小鼠血清中IL-1的影響Fig.1 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the concentration of IL-1 in serum of mice

圖2 桑黃多糖對小鼠血清中IL-6的影響Fig.2 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the concentration of IL-6 in serum of mice

圖3 桑黃多糖對小鼠血清中TNF-α的影響Fig.3 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the concentration of TNF-α in serum of mice

圖1～圖3可見，對于IL-1、IL-6、TNF-α含量，陽性對照組同生理鹽水組相比，能一定程度降低其含量，但無顯著性差異。而桑黃口服液低、中、高劑量組同生理鹽水組相比，均能極顯著（p＜0.01）降低IL-1的含量，并且呈劑量依賴型；低、中、高劑量組能顯著（p＜0.05）降低IL-6的含量，且呈劑量依賴型；高劑量組能顯著（p＜0.05）降低TNF-α的含量。IL-1是一種內源性致熱源，炎癥介質；IL-6能刺激肝細胞產生急性期反應蛋白，引起發熱；TNF-α是引起炎癥反應的關鍵細胞因子，而在實驗劑量和時間下，桑黃多糖能顯著降低它們的含量，證實桑黃口服液有很好的抗炎作用［10-11］。

由圖4～圖6可見，陽性對照組能極顯著的升高IL-2的含量，IL-4和IFN-γ同生理鹽水組相比無顯著性差異。低劑量組的IL-2、IFN-γ含量同生理鹽水組相比無顯著性差異，中劑量組能顯著（p＜0.05）的增加IL-2、IFN-γ含量，高劑量組能極顯著的（p＜0.01）增加IL-2、IFN-γ含量。而IL-4含量，各組之間均無顯著性差異。外源性微生物刺激固有免疫系統所產生的細胞因子可以活化T細胞，并促使輔助性ThO細胞分化為Thl或Th2。機體正常時，Th1和Th2細胞功能處于動態平衡狀態，維持機體正常的細胞免疫和體液免疫功能；當機體受到異己抗原攻擊時，Th1和Th2細胞中某一亞群功能升高，另一亞群功能降低，該現象即為Th1/Th2漂移［12］。Thl分泌IL-2和IFN一γ細胞因子，而桑黃多糖能顯著性增加其含量，從而介導細胞免疫，執行細胞內抗感染、抗病毒等；Th2細胞分泌的標志性細胞因子IL-4，介導體液免疫，執行細胞外抗感染、抗腫瘤，而桑黃多糖實驗組IL-4的含量雖然高于空白對照組，但無顯著性差異，說明桑黃多糖能夠增強特異性細胞免疫，對Th1的作用較明顯。

圖4 桑黃多糖對小鼠血清中IL-2的影響Fig.4 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the concentration of IL-2 in serum of mice

圖5 桑黃多糖對小鼠血清中IL-4的影響Fig.5 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the concentration of IL-4 in serum of mice

圖6 桑黃多糖對小鼠血清中IFN-γ的影響Fig.6 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the concentration of IFN-γ in serum of mice

3 結論與討論

免疫功能包括非特異性免疫和特異性免疫。臟器指數可從側面反應機體免疫強弱，碳廓清能力反應非特異性免疫狀況，細胞因子的測定反應特異性免疫狀況。白細胞介素在機體免疫應答和炎癥反應過程中發揮著重要的調節作用。TNF-α是一種多功能細胞因子，亦可作為內源性致熱原，參與敗血癥性或內毒素性休克等。IFN-γ能防止病毒在靶細胞內復制，可激活NK細胞，加強巨噬細胞的溶菌能力。

實驗選用13～17 g的KM種小鼠，避免隨時間的增加，胸腺退化對實驗結果的影響［8，13］。本實驗結果表明，桑黃多糖能顯著性提高小鼠胸腺指數和脾臟指數，增強小鼠碳廓清率，增加IL-2和IFN-γ的含量，降低IL-1、IL-6、TNF-α的含量，具有免疫增強劑的功效，能夠同時影響非特異性免疫和特異性免疫，顯著增強機體免疫力，并且具備一定的抗炎作用。

真菌多糖具有調節免疫力的作用，已有多種真菌多糖類保健品藥品上市。但大多數真菌多糖都以子實體提取物入藥，成本高，有些珍貴物種難獲得，制約了其廣泛應用。相關研究表明，桑黃發酵菌絲體提取物同桑黃子實體提取物的作用成分差別不大，甚至更多［14］。本實驗的桑黃多糖通過桑黃發酵分離純化制得，實驗表明，它能提高機體免疫。桑黃發酵菌絲體可替代現有的桑黃入藥成分，可降低成本，并且效果更顯著，為其擴大生產應用奠定了基礎。

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Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius by liquid fermentation technology on mouse's immunity function

WEI Jing，CHEN Li，DENG Ya-jun，ZOU Xiang，XU Xing-ran*
（College of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400715，China）

To study the effect of polysaccharides from Phellinus igniarius by liquid fermetation technology on mouse's immunity function.It mainly studied the immune organs in mice，carbon clearance rate，and IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IFN-γ，TNF-α affected by P.igniarius polysaccharide.The results showed that it could significantly increase the weight of thymus and spleen，enhance carbon clearance rate，increase the content of IL-2 and IFN-γ，reduce the content of IL-1，IL-6 and TNF-α.It was confirmed that polysaccharides from Phellinus igniarius could significantly enhance immunity，and there was a certain anti-inflammatory effects.

liquid fermentation technology；polysaccharides from Phellinus igniarius；mice；immune；cytokines

TS201.4

A

1002-0306（2016）08-0344-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.064

2015-10-19

魏靜（1990-），女，碩士研究生，研究方向：生物技術藥物篩選及其質量控制，E-mail：weijingfenming@126.com。

*通訊作者：徐興然（1967-），男，博士，副教授，研究方向：生物技術藥物篩選及其質量控制，E-mail：623475202@qq.com。

國家農業科技成果轉化資金項目（2012F1003006）；國家自然科學基金資助項目（31472170）。