油茶籽餅中茶皂素定量檢測方法研究

張團結，熊道陵，許光輝，陳　超，陳金洲（江西理工大學冶金與化學工程學院，江西贛州341000）

油茶籽餅中茶皂素定量檢測方法研究

張團結，熊道陵，許光輝，陳超，陳金洲
（江西理工大學冶金與化學工程學院，江西贛州341000）

本文建立了一種快速、簡單、準確測定油茶籽餅中茶皂素含量的方法。結果表明：采用分光光度法和高效液相色譜法對同含量的茶皂素測定結果較為吻合，相比之下分光光度法更為簡單快捷。分光光度法是以香草醛-高氯酸作為顯色劑，通過茶皂素甙元顯色，于554 nm為檢測波長。在樣品待測液中，加入香草醛-高氯酸1.0 mL，在溫度為60℃的條件下反應15 min，顯色效果最佳。該方法精密度高，顯色后在40 min內吸光度穩定，平均加標回收率為98.28% （RSD=3.86%）。本實驗建立了分光光度法測定茶皂素含量的方法，具有良好的準確度、精密度和穩定性，可用于茶皂素含量的測定。

分光光度法，高效液相色譜法，茶皂素，甙元

油茶籽餅中的茶皂素是一類五環三萜類齊墩果烷型皂甙，不僅具有天然優良的表面活性作用，還有殺滅細菌、殺滅害蟲、抑制細菌、消炎等作用［1-3］，故而被廣泛地應用于農藥、建材、化工等方面［2-5］。

從油茶籽餅中提取出的茶皂素含有蛋白質、多糖、單寧、油脂、樹脂等雜質，使得茶皂素產品質量差，色澤深黑，且不同地域的茶籽中茶皂素因品種、栽培環境等不同而存在差異，給茶皂素定量研究帶來很多的困難，因此迄今為止國內尚未見統一的檢測方法。

茶皂素定量分析方法研究有：重量法［6］、顯色法［7-9］、薄層掃描法［10］（TLC）、高效液相色譜法［11-12］（HPLC）等。其中重量法測定具有數值穩定性好、重現性強的優點，但是存在分析時間長，操作復雜，水解得到的皂甙存在纖維素等雜質，使得測定結果偏大等問題。顯色法測定茶皂素的含量是一種快捷的方法，但是從油茶籽餅中提取出的茶皂素含有蛋白質、單寧、茶多酚、多糖等雜質對檢測有很大的影響，常需要對這些雜質進行除雜方可進行顯色檢測。薄層掃描法和高效液相色譜法測定茶皂素的含量，對設備要求高，存在操作復雜，分析費用大等問題。本實驗以茶皂素水解后的甙元含量來測定茶皂素的含量，有效的避免茶皂素中雜質對測定結果的影響，提高了茶皂素含量定量的準確性，無需對茶皂素進行復雜的提純。本文測定方法比高效液相色譜法更為簡單、方便、快捷，為開發油茶籽餅中茶皂素含量測定提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

無水甲醇、乙醇南昌全友化工原料有限公司（分析純）；甲醇西隴化工股份有限公司（色譜純）；香草醛天津市巴斯夫化工有限公司（分析純）；高氯酸濟寧恒泰化工有限公司（分析純）；冰醋酸濟寧佰一化工有限公司（分析純）；鹽酸深圳市慶茂化工有限公司（分析純）；茶皂素標準品阿拉丁試劑有限公司（純度＞98%）；樣品茶皂素陜西帕尼爾生物科技有限公司（純度＞40%）；超純水實驗室自制。

Agilent高效液相色譜儀美國安捷倫公司；ATX324分析天平上海圣科儀器設備有限公司；101系列數顯鼓風干燥箱上海葉拓儀器儀表有限公司；UV-6300紫外分光光度計上海美普達儀器有限公司；HH恒溫水浴鍋江蘇金壇市中大儀器廠；JJ-1電動攪拌器江蘇金壇市中大儀器廠；R系列旋轉蒸發器山海申生科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1甙元的制備取3.0 g茶皂素標準品加入2.5 mol/L濃度的鹽酸甲醇溶液在沸水浴中水解1 h，水解后得到灰色的茶皂素甙元，在80℃干燥箱內烘1 h得到茶皂素甙元，取29.0 mg甙元，用甲醇溶解并定容到50.0 mL容量瓶中，獲得濃度為0.58 mg/mL的標品甙元溶液，用同樣的方法可得到濃度為1.38 mg/mL的樣品甙元溶液。1.2.2顯色方法茶皂素結構屬于齊墩果烷型，將皂素水解成甙元后利用分光光度法測定甙元的含量確定茶皂素的含量。茶皂素在沸水浴的鹽酸甲醇溶液中水解1 h得到甙元，再和香草醛上的醛基發生反應形成縮醛，成為新的共軛體系而顯色。

1.2.3測定波長的選擇分別精密吸取標品甙元溶液和樣品甙元溶液各0.50 mL于10.0 mL帶有塞子的顯色管中，水浴蒸干溶劑，加入香草醛-高氯酸（體積比1∶4）1.0 mL，搖勻，在60℃水浴鍋中反應15 min，反應后冰水浴5 min，加入冰醋酸5.0 mL，以不加皂素甙元為空白試劑，在400～700 nm處掃描，確定最大吸收波長。

1.2.4顯色條件的確定通過對影響顯色的因素（顯色劑用量、反應時間、反應溫度）進行考察，得到最佳的顯色條件。

取標品甙元溶液0.30 mL，80℃水浴揮干溶劑，冷卻后，加入不同量的顯色劑（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL），搖勻，在不同溫度（45、50、55、60、65、70℃）水浴中加熱不同時間（5、10、15、20、25、30 min），迅速冷卻至室溫，加入5 mL冰醋酸，在最大波長處測定吸光度值，確定最佳顯色條件。

1.2.5標準曲線的建立精密吸取茶皂素標準品甙元溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL，分別置于10.0 mL帶塞子的顯色管中，加香草醛-高氯酸1.0 mL，搖勻，在60℃水浴鍋中反應15 min。冷卻后冰水浴5 min，加入冰醋酸5.0 mL，以不加皂素甙元為空白試劑，在最大吸收波長處測定吸光度。茶皂素含量計算公式見下式

式中：C為甙元含量（mg）；換算系數0.4921是茶皂素水解后產生的不溶于水的甙元占整個茶皂素的分子量百分比，茶皂素平均分子量為1203，甙元分子量為592；m為茶皂素樣品的質量（mg）。

1.3高效液相色譜法測定茶皂素的含量

按照參考文獻［13］方法改進，色譜條件為：色譜柱，Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：甲醇-水（v∶v=9∶1）；檢測波長為210 nm；柱溫：25℃。

標準品處理：精密稱取茶皂素標準品0.5 g（精確到0.0001 g），用甲醇超聲溶解并定容到100 mL容量瓶中。分別移取1.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL于5個50 mL容量瓶中，并用甲醇定容溶解。經0.45 μm微孔膜過濾后上機分析，以質量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算得到回歸方程。

哦，他說得很有道理，想求真情真愛，首先要把愛的立足點建立在對方身上，自己奉獻再多，最終還離不開這個“我”字，怎么讓別人無私地愛自己呢？對，人想活得比一般人更有意義，必須讓自己的思想脫俗……對，對，古為今用，傳統文化所包含的深刻的人生哲理，的確值得我們借鑒……想著想著，不知不覺便向老人頻頻點起頭來。忽然又有難題涌上心頭，說道：“可是，婚前的戀愛路子已經走錯了，既然夫妻過不來，就得打離婚的譜。”

樣品茶皂素含量的測定：用分析天平稱取樣品茶皂素0.058 g（精確到0.0001 g），用甲醇超聲溶解并定容于50 mL容量瓶中。經0.45 μm微孔膜過濾，用高效液相色譜進行測試分析。

茶皂素含量計算公式見下式：

式中：χ為樣品溶液中濃度（g/mL），V為樣品定容的體積（mL），m為樣品的質量（g）。

2　結果與分析

2.1甙元顯色測定結果

2.1.1最大吸收波長的確定從圖1中可以看出在波長為554 nm時吸光度最大，因此確定測定茶皂素甙元的波長為554 nm。

2.1.2顯色劑用量的確定顯色劑用量與吸光度的關系如圖2所示，實驗表明，隨著顯色劑用量的增加，吸光度在用量為1.0 mL之前上升較快。當顯色劑用量在1.0 mL之后吸光度趨于穩定，即反應已經完全，確定最佳用量為1.0 mL。

2.1.3反應時間的確定不同反應時間與吸光度值的關系如圖3所示。實驗表明，當反應時間小于15 min時，隨著反應時間的逐漸增大，吸光度值隨之增大，當反應時間達到15 min時，吸光度值達到最大。當反應時間超過15 min時，吸光度值有所下降，這是因為時間過長會破壞顯色體系，所以，選擇15 min為最佳反應時間。

圖1　皂素甙元掃描圖Fig.1　Saponin aglycone scan

表1　樣品加標回收率實驗結果Table 1　Recovery and precision data of sample

圖4　反應溫度對吸光度的影響Fig.4　Effect of reaction temperature on the absorbance

2.1.5標準曲線回歸方程的建立以吸光度值為橫坐標，茶皂素甙元含量（mg）為縱坐標繪制的標準曲線如圖5所示。計算線性回歸方程為：C=0.4231A+ 0.0037（R2=0.9976）。

圖5　皂素甙元標準曲線Fig.5　Aglucone standard curve

2.1.6精密度實驗精密吸取6份標品甙元溶液0.20 mL。實驗表明，連續6次測的吸光度值分別為0.251、0.250、0.249、0.251、0.252、0.250，其RSD為0.105%，表明該方法具有良好的精密度。

2.1.7穩定性實驗精密取標品甙元溶液0.30 mL。實驗表明，標品甙元溶液在顯色結束后的40 min內吸光度值保持在0.426左右，表明標品溶液顯色結束后的40 min內吸光度值是穩定的。

2.1.8加標回收率實驗按照實驗方法，分別對5組不同含量的樣品甙元中加入相同含量的標準品甙元進行回收率實驗，結果見表1，由表1可知平均回收率為98.28%，其RSD為3.86%，表明分光光度法檢測茶皂素含量具有較好的準確性。

2.2高效液相色譜法測定結果

經過紫外掃描實驗可知，茶皂素標準品在210 nm處有最大吸收峰，見圖6，因此本實驗采用210 nm為檢測波長。用標準品配制的5個不同濃度的標準液分別得出不同濃度下的峰面積，以質量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，見圖7，得到回歸方程為y=1.15×106χ+3.0×106，R2=0.9981（y表示峰面積，χ表示濃度）。

圖6　茶皂素標準品紫外吸收光譜圖Fig.6　UV absorption spectrum of tea saponin standard

圖7　茶皂素標準曲線（HPLC法）Fig.7　Tea saponin standard curve（HPLC）

2.3樣品含量測定

分別使用兩種方法對樣品進行測定，平行五次，結果帶入標準曲線，在根據標準曲線計算得到樣品中茶皂素含量，結果分別見表2、表3。

表2　分光光度法測定五個平行樣品結果Table 2　Determination results of 5 parallel samples by UV spectrophotometry

表3　HPLC法測定五個平行樣品結果Table 3　Determination results of 5 parallel samples by HPLC

3　結論

經過兩種方法的測定結果比較可知，采用分光光度法和高效液相色譜法測定同一含量的茶皂素樣品，其結果大致相同。本文建立的分光光度法操作簡單，對檢測設備要求低，通過精密度實驗、穩定性實驗、回收率實驗驗證了該方法的可靠性，該方法測定時間短，方便、快捷，可用于茶皂素含量的測定，適合推廣。

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Quantitative analysis of tea saponin from seed cake

ZHANG Tuan-jie，XIONG Dao-ling，XU Guang-hui，CHEN Chao，CHEN Jin-zhou （School of Metallurgy and Chemical Engineering，Jiangxi University of Science&Technology，Ganzhou 341000，China）

In order to establish a rapid，simple and accurate method of determining the content of tea saponin，spectrophotometry and HPLC methods were used.The quantitative analysis results for the same content of tea saponins from the two improved analysis methods were very accordant and the former was more simple.The employed coloring reagents was vanillin-acetic acid and the color determination of saponin content based on aglycone at the wavelength of 554 nm.Optimal color condition for sample solution were obtained as follows：color reagents 1.0 mL，temperature 60℃，reaction time 15 min.The color of the samples were stabled within 40 min and the average recovery was 98.28%（RSD=3.86%）with high precision.The method based on spectrophotometry including high accurate，precision and stability，it could be used for quantitative determination of tea saponin.

spectrophotometry；HPLC；tea saponins；aglycone

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0053-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.002

2015－05－25

張團結（1989-），男，碩士研究生，研究方向：再生資源綜合利用，E-mail：zhangtj0175@126.com。

熊道陵（1965-），男，博士，教授，研究方向：再生資源綜合利用，E-mail：dlxiongcs@163.com。

國家自然科學基金資助項目（51364014）；江西省科技廳資助項目（2013BBG70003）；江西省級大學生創新創業訓練計劃項目（201310407037，201310407057，201410407030）；江西省高校專業綜合改革試點項目（SZG-14-01-01）資助。