不同地區(qū)牦牛肉中FABP基因Real-time PCR表達(dá)差異分析

薛艷鋒，郝力壯，劉書(shū)杰（青海省高原放牧家畜營(yíng)養(yǎng)與生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海高原牦牛研究中心，青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧810016）

不同地區(qū)牦牛肉中FABP基因Real-time PCR表達(dá)差異分析

薛艷鋒，郝力壯，劉書(shū)杰*
（青海省高原放牧家畜營(yíng)養(yǎng)與生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海高原牦牛研究中心，青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧810016）

為了研究不同地區(qū)牦牛肉品質(zhì)的差異，本實(shí)驗(yàn)從大通、九龍、河南、迪慶、紅原五個(gè)地區(qū)采集4歲公牦牛肌肉樣品，提取總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的作用下生成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用Real-time PCR檢測(cè)牦牛肌肉中脂肪酸結(jié)合蛋白基因的表達(dá)水平。將迪慶地區(qū)牦牛作為對(duì)照組，肌肉中脂肪酸結(jié)合蛋白基因的cDNA實(shí)時(shí)熒光定量的2-ΔΔCt值設(shè)定為1，則大通、九龍、河南、紅原地區(qū)的牦牛肌肉中脂肪酸結(jié)合蛋白基因的cDNA實(shí)時(shí)熒光定量的2-ΔΔCt值分別為4.18、2.94、9.95、10.73，從而得出不同地區(qū)牦牛肌肉中脂肪酸結(jié)合蛋白基因的相對(duì)表達(dá)水平，在分子水平上更加準(zhǔn)確地評(píng)估不同地區(qū)牦牛肉品質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅原和河南地區(qū)的牦牛肉品質(zhì)最優(yōu)，而迪慶地區(qū)牦牛肉品質(zhì)較差。

脂肪酸結(jié)合蛋白，實(shí)時(shí)定量PCR，基因表達(dá)，牦牛肉品質(zhì)

牦牛肉蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量低［1-2］，富含人體所必需的各種氨基酸、礦物質(zhì)、維生素，是一種高品質(zhì)的肉類(lèi)［3］。但牦牛肉由于肌纖維較粗［4］，且肌間脂肪和肌內(nèi)脂肪含量較低，使牦牛肉的大理石花紋評(píng)分低，嫩度差，導(dǎo)致牦牛肉的整體感官和口感次于其他牛肉［5］。

牦牛肉品質(zhì)受到多種因素的影響，包括營(yíng)養(yǎng)水平［6］、飼養(yǎng)方式［7］、屠宰運(yùn)輸［8］、加工手段［9］等非遺傳因素和牦牛品種［10］、基因調(diào)控等遺傳因素。目前，已經(jīng)有很多學(xué)者通過(guò)測(cè)定牦牛肉的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分和食用品質(zhì)對(duì)牦牛肉進(jìn)行研究和評(píng)定［11］，但還很少有人通過(guò)基因表達(dá)的層面來(lái)評(píng)定牦牛肉品質(zhì)以及通過(guò)基因調(diào)控來(lái)改善牦牛肉品質(zhì)。脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty Acid Binding Protein，F(xiàn)ABP）基因是調(diào)控肉品質(zhì)的主效基因［12-15］，F(xiàn)ABP是一類(lèi)存在于細(xì)胞質(zhì)中的小分子量蛋白質(zhì)，易與脂肪酸和其他有機(jī)溶解物相結(jié)合，而作為脂肪酸運(yùn)輸?shù)妮d體，在細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的代謝過(guò)程中起到重要作用［16］。FABP廣泛存在于各種組織當(dāng)中，其中以心肌和骨骼肌中含量最為豐富。

如果能夠通過(guò)基因調(diào)控的方法，提高FABP基因在牦牛肌肉中的表達(dá)量，就可以增加牦牛肉肌內(nèi)脂肪含量，提高牦牛肉的嫩度和適口性，使牦牛肉風(fēng)味鮮嫩、柔軟多汁，提高牦牛肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食用品質(zhì)，增加牧民經(jīng)濟(jì)收入，促進(jìn)藏區(qū)的穩(wěn)定和繁榮。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熒光定量技術(shù)測(cè)定FABP基因在不同地區(qū)的牦牛肉中的相對(duì)表達(dá)量，從基因的水平評(píng)定不同地區(qū)牦牛肉的品質(zhì)差異，為利用基因調(diào)控的手段改善牦牛肉的品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

公牦牛背最長(zhǎng)肌樣品分別從大通（青海）、河南（青海）、九龍（四川）、紅原（四川）、迪慶（云南）五個(gè)地區(qū)采集現(xiàn)殺的4歲放牧公牦牛第12～13肋骨間的背最長(zhǎng)肌樣品（所用的鑷子、手術(shù)刀、剪刀等都嚴(yán)格滅菌），裝于5 mL凍存管中，迅速存放于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中，備用；利用GenBank中介紹的牦牛（Bos grunniens）FABP基因（GenBank Accession No：EU815937.1）和β-ACTIN基因（GenBank Accession No：BT030480），通過(guò)核心序列利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)5’和3’端特異性引物（見(jiàn)表1），引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成；Total RNA提取試劑盒北京Solarbio公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量染料大連TaKaRa公司；無(wú)水乙醇（99.7%）上海康拓化工有限公司，用以洗滌RNA；微量吸頭、無(wú)菌手套、無(wú)菌口罩上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

表1　牦牛FABP基因cDNA克隆引物Table 1　cDNA clone primers of yak FABP gene

移液槍德國(guó)Eppendorf公司；PCR擴(kuò)增儀、Realtime PCR儀、核酸電泳儀美國(guó)BIO-RAD公司；高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Sigma公司；凝膠成像系統(tǒng)英國(guó)SYNGENE公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Total RNA的提取取出-80℃凍存的肌肉樣品，稱(chēng)量100 mg左右，錫紙包好，置于液氮中；將肌肉樣品轉(zhuǎn)移到2 mL的tube管中，加入1 mL裂解液，勻漿器勻漿；室溫靜置5 min，使核酸蛋白質(zhì)完全分離；加入0.2 mL的氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置3～5 min；2～8℃，12000 r/min，離心10 min；將包含有RNA的上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移到新的tube管中；吸附柱前處理：在吸附柱中加入500 μL的洗柱液，室溫靜置2 min，2～8℃，12000 r/min，離心2 min，棄廢液；向上清水相中加入200 μL的乙醇，轉(zhuǎn)入吸附柱靜置2 min；2～8℃，12000 r/min，離心2 min，棄廢液；向吸附柱中加入600 μL的漂洗液，2～8℃，12000 r/min，離心2 min，棄廢液；向吸附柱中加入600 μL的漂洗液，2～8℃，12000 r/min，離心2 min，棄廢液；12000 r/min，離心2 min，棄掉收集管；將吸附柱置于室溫條件下1 min，使殘余的漂洗液去除；將吸附柱放入新的2 mL的tube管中，向膜中央加入50～100 μL的RNase free H2O，室溫靜置5 min；20℃，12000 r/min，離心2 min，即得到RNA于tube管中。

1.2.2cDNA的合成參考TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒推薦的方法，將提取到的牦牛肌肉樣品的Total RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（冰上操作），通過(guò)PCR得到cDNA。采用20 μL反轉(zhuǎn)錄體系：5×Primescript?Buffer 4 μL；Primescript?RT Enzyme MixⅠ1 μL；Oligo dT primer 1 μL；Random 6 mers 1 μL；Total RNA 1 μL；RNase free H2O 12 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：37℃，15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）；85℃，5 s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）。

1.2.3DNA的合成利用反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，通過(guò)普通PCR擴(kuò)增成DNA（冰上操作）。采用25 μL反應(yīng)體系：Template 1 μL；FABP primer F 0.5 μL；FABP primer R 0.5 μL；10×PCR Buffer 2.5 μL；dNTP 2 μL；Taq DNA polymerase 1 μL；ddH2O 17.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：Cycle 1：預(yù)變性94℃30 s；Cycle 33：變性95℃5 s，退火59℃30 s，延伸72℃30 s；Cycle 1：72℃3 min。

1.2.4Real-time PCR反應(yīng)參考TaKaRa試劑盒推薦方法，以合成的牦牛肌肉樣品的cDNA為模板，通過(guò)Real-time PCR反應(yīng)得到不同地區(qū)牦牛肌肉樣品的Ct值（冰上操作）。采用25 μL反應(yīng)體系：Template 2 μL；FABP primer F 1 μL；FABP primer R 1 μL；SYBR 12.5 μL；ddH2O 8.5 μL。同時(shí)還是選擇內(nèi)參β-ACTIN F-β-ACTIN R進(jìn)行Real-time PCR作為對(duì)照。Realtime PCR反應(yīng)條件：Cycle 1：預(yù)變性94℃30 s；Cycle 39：變性94℃5 s，退火60℃30 s。

1.2.5數(shù)據(jù)分析通過(guò)比較閾值法（2-ΔΔC）t進(jìn)行相對(duì)定量［17］。Ct為樣品的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。以迪慶地區(qū)的牦牛肌肉樣品作為對(duì)照樣，并將其FABP基因的2-ΔΔCt值設(shè)為1進(jìn)行閾值比較，根據(jù)公式：2-ΔΔCt=2-（［實(shí)驗(yàn)組FABP Ct-實(shí)驗(yàn)組β-ACTINCt）-（對(duì)照組FABP Ct-對(duì)照組β-ACTIN Ct）］計(jì)算大通、九龍、河南、紅原四個(gè)地區(qū)FABP基因的相對(duì)表達(dá)水平。采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步統(tǒng)計(jì)處理，SAS 9.1.3軟件中Anova程序進(jìn)行單因素方差分析，采用SPSS 17.0進(jìn)行各組之間的顯著性檢驗(yàn)和p值的計(jì)算。

2　結(jié)果與分析

2.1提取的Total RNA的檢測(cè)

不同地區(qū)牦牛肌肉樣品提取的Total RNA在1%的瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果。

從RNA電泳圖上可以清楚地看到28S、18S兩條亮帶，并且28S條帶的亮度大約是18S條帶亮度的2倍，無(wú)拖帶、雜帶，因此所提取的RNA質(zhì)量較高。

2.2克隆出的FABP基因DNA的檢測(cè)

不同地區(qū)牦牛肌肉樣品FABP基因克隆出的DNA在1%的瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果。

圖1　不同地區(qū)牦牛肌肉樣品RNA電泳圖Fig.1　RNA electrophoretogram of yak muscle samples from different regions

圖2　FABP基因克隆出的DNA的電泳圖Fig.2　Electrophoretogram of DNA cloned from FABP gene

此圖由提取的Total RNA反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA，再通過(guò)普通PCR擴(kuò)增成DNA得到的電泳圖。利用在編碼區(qū)兩側(cè)設(shè)計(jì)的牦牛FABP引物擴(kuò)增目的DNA，獲得約310 bp［18］的DNA片段，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DL2000的Marker可以清楚地看出條帶在250～500 bp之間。

2.3FABP基因Real-time PCR熒光定量

由1.2.5中提供的公式計(jì)算得出不同地區(qū)FABP基因的相對(duì)定量的拷貝數(shù)（見(jiàn)圖3）。

圖3　FABP基因相對(duì)定量拷貝數(shù)Fig.3　Relative quantitative copy number of FABP gene

本實(shí)驗(yàn)以大通、九龍、河南、迪慶、紅原這五個(gè)地區(qū)的牦牛背最長(zhǎng)肌為樣品，通過(guò)對(duì)FABP基因的cDNA重復(fù)3次進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)法，測(cè)出它們的平均△Ct值，再根據(jù)比較閾值法進(jìn)行相對(duì)定量得到最后的結(jié)果。

表2　不同地區(qū)牦牛FABP基因熒光定量PCRTable 2　Fluorogenic quantitative PCR of yak FABP gene from different regions

根據(jù)測(cè)定的各個(gè)地區(qū)的Ct值，利用SPASS 17.0分析軟件計(jì)算得出五個(gè)地區(qū)FABP基因表達(dá)量的差異顯著性如表4所示。

表4　不同地區(qū)FABP基因表達(dá)量差異顯著性分析Table 4　Significant analysis of FABP gene’s expression quantity in different regions

根據(jù)計(jì)算的結(jié)果和圖3可以看出，紅原和河南牦牛背最長(zhǎng)肌中FABP基因的2-△△Ct值最高，分別為10.73、9.95，接下來(lái)依次是大通、九龍、迪慶，分別為4.18、2.94、1.00。結(jié)合表4，可以看出，紅原和河南兩個(gè)地區(qū)牦牛背最長(zhǎng)肌中FABP基因的2-△△Ct值與迪慶FABP基因的2-△△Ct值之間的差異顯著（p＜0.05）。

3　結(jié)論與討論

郝稱(chēng)莉等［19］的研究表明，不同部位肌肉的FABP基因的表達(dá)量與肌肉內(nèi)脂肪含量出現(xiàn)不同程度的正相關(guān)，F(xiàn)ABP基因?qū)?nèi)脂肪沉積具有正調(diào)控作用。Michal等［20］，Jurie等［21］，Lee等［22］的研究表明，F(xiàn)ABP基因與牛肉大理石花紋密切相關(guān)，影響牛肉品質(zhì)。Hoashi等［23］，Cho等［24］，Barendse等［25］，Narukami等［26］的研究表明FABP基因調(diào)控牛肉脂肪酸的組成和脂肪的沉積，是調(diào)控牛肉品質(zhì)的主效基因。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)FABP基因的表達(dá)水平反應(yīng)牦牛肌內(nèi)脂肪含量，評(píng)估不同地區(qū)牦牛肉品質(zhì)。謝榮清等［27］測(cè)定4.5歲紅原牦牛肌肉的脂肪含量為5.34%；邱翔等［28］測(cè)定3～4歲九龍牦牛肌肉的脂肪含量為2.84%；張永輝［29］和劉勇［30］研究成年大通牦牛的肌肉脂肪含量分別為2.05%和1.83%。眾多學(xué)者從營(yíng)養(yǎng)成分層面的研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的紅原、河南、大通、九龍、迪慶五個(gè)地區(qū)牦牛背最長(zhǎng)肌中FABP基因的表達(dá)水平依次降低基本一致，再次證明了本研究結(jié)果的可信度。

表3　不同地區(qū)牦牛FABP基因的Ct值對(duì)比Table 3　Ct values’comparison of yak FABP gene from different regions

紅原、河南、大通、九龍、迪慶五個(gè)地區(qū)牦牛背最長(zhǎng)肌中FABP基因熒光定量ΔCt的平均值分別為-0.43、-0.32、0.93、1.44、2.99，2-ΔΔCt值分別為10.73、9.95、4.18、2.94、1.000，也就是說(shuō)紅原、河南、大通、九龍、迪慶五個(gè)地區(qū)牦牛背最長(zhǎng)肌中FABP基因的表達(dá)水平依次下降，導(dǎo)致肌內(nèi)脂肪含量和嫩度依次下降。因此，單從牦牛FABP基因的表達(dá)量考慮，紅原、河南地區(qū)牦牛肉的品質(zhì)最高，而迪慶地區(qū)牦牛肉的品質(zhì)最差。牦牛肉品質(zhì)的進(jìn)一步評(píng)定還需要結(jié)合大理石花紋、吸水率、蒸煮率、剪切力、其他相關(guān)基因表達(dá)水平等指標(biāo)。不同地區(qū)牦牛肉品質(zhì)的差異可能是由于牦牛品種、牧草營(yíng)養(yǎng)水平等因素造成的。因此，不同營(yíng)養(yǎng)水平、不同能量水平、不同添加劑水平、不同飼養(yǎng)方式、不同牦牛品種對(duì)FABP基因表達(dá)量和肌內(nèi)脂肪沉積量，以及最終對(duì)牦牛肉品質(zhì)的影響，將成為未來(lái)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，不斷優(yōu)化牦牛品種，確定最佳營(yíng)養(yǎng)水平、能量水平、飼養(yǎng)方式，從而提高牦牛肉品質(zhì)，增加牦牛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)于促進(jìn)藏區(qū)穩(wěn)定和繁榮都有著深遠(yuǎn)的意義。

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Analysis of FABP gene’s expression difference in yak meat from different regions by Real-time PCR

XUE Yan-feng，HAO Li-zhuang，LIU Shu-jie*
（State Key Laboratory of Cultivating Base of Plateau Grazing Animal Nutrition and Ecology of Qinghai Province，Key Laboratory of Plateau Grazing Animal Nutrition and Feed Science of Qinghai Province，Qinghai Plateau Yak Research Center，Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine，Xining 810016，China）

In order to research the difference of yak meat’s quality in different regions，total RNA was extracted from 4-year-old male yak’s muscle samples of Datong，Jiulong，Henan，Diqing，Hongyuan，and then cDNA was generated under the action of reverse transcription polymerase，at last，the production of reserve transcription reaction was utilized to carry out RT-PCR and detect the expression levels of FABP gene.The results were that if the yak muscle sample of Diqing was taken as the control group and the 2-ΔΔCtvalue of it was set to 1，the fluorescence quantitative 2-ΔΔCtvalue of Datong，Jiulong，Henan，Hongyuan yak muscles were 4.18，2.94，9.95，10.73 respectively.So that the relative expression quantity of FABP gene in yak muscles could be obtained to evaluate yak meat’s quality in different regions on molecular level.The yak meat’s quality of Hongyuan and Henan was the best while that of Diqing was the worst.

FABP；Real-time PCR；expression；yak meat quality

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0147-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.020

2015－05－29

薛艷鋒（1990-），男，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)，E-mail：945982845@qq.com。

劉書(shū)杰（1966-），男，研究員，研究方向：高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼草料開(kāi)發(fā)，E-mail：mkylshj@126.com。

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973項(xiàng)目）（2012CB722906）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2009BAC61B03-1）。