氮、磷對熱帶海洋富油微藻Desmodesmus sp.WC08生長及油脂積累的影響

羅　寧，張　森，劉平懷（海南大學，教育部熱帶多糖資源利用工程研究中心/熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室，海南海口570228）

氮、磷對熱帶海洋富油微藻Desmodesmus sp.WC08生長及油脂積累的影響

羅寧，張森，劉平懷*
（海南大學，教育部熱帶多糖資源利用工程研究中心/熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室，海南海口570228）

為研究氮源、氮濃度及磷濃度對一株富油海水藻株Desmodesmus sp.WC08生長和油脂積累的影響。以BG11為基本培養基，考察亞硝酸鈉、硝酸鈉、尿素及氯化銨以及不同尿素濃度和磷濃度對Desmodesmus sp.WC08生長、油脂積累影響。結果表明：除氯化銨外，不同氮源對Desmodesmus sp.WC08生長影響較小，以尿素為氮源時，生長和油脂積累最佳；Desmodesmus sp.WC08生長和油脂積累的最佳氮濃度為10 mmol/L，過高或過低都將影響其生長和油脂積累；Desmodesmus sp.WC08的生長和油脂積累隨著磷濃度的升高先增加后降低，最佳磷濃度為0.5 mmol/L；在最佳氮濃度和磷濃度下，Desmodesmus sp.WC08對氮、磷的吸收較完全，能夠充分利用培養基中的營養物質。

Desmodesmus sp.WC08，氮源，氮濃度，磷濃度，營養吸收

微藻是一類油脂含量高的微生物，大多數微藻的油脂含量可達干重的20%～50%［1］。化石燃料的短缺及其對環境的污染，使得富油微藻逐漸成為全世界的能源工作者關注的對象［2］。與傳統的油料作物相比，微藻具有高生長速率，高油脂產率，以及不占用耕地等優勢［3］。盡管微藻具有眾多優勢，但是高密度培養成本依然是微藻成為商業化生物柴油原料的瓶頸［4］，因此探索微藻高密度生長和油脂積累的影響因素具有很重要的意義。氮是生物體內蛋白質和核酸的基本組成元素，對微藻的生長和油脂積累具有調控作用。Scenedesmus sp.CCNM 1077［5］在氮脅迫情況下形態結構發生變化，油脂含量和多糖均達到最大，分別為干重的27.93%和45.74%。利用污水培養Chlorella sorokiniana［6］，當添加尿素為氮源時生長最好，尿素濃度為1.5 g/L時，生物量可達0.218 g/L，油脂含量高達61.52%。磷參與光合作用，是合成ATP的重要元素之一，對微藻的生長和油脂積累同樣有較大的影響。Rhopalosolen saccatus［7］在磷限制下脂肪酸成分有顯著變化，但是生物量和總脂積累無顯著影響，江淮真等［8］發現小球藻在缺磷條件下總脂和中性脂含量均逐漸增大。

Desmodesmus sp.WC08是分離自海南島的一株高生物量且油脂含量較高的鏈帶藻，目前對鏈帶藻的研究已有從自然條件［9］（溫度、光照強度、光照周期和pH）及營養元素［10］（鐵、鈣和鎂）優化鏈帶藻的培養條件，同時也可利用污水中的營養物質培養鏈帶藻［11］。本研究以Desmodesmus sp.WC08為對象，初步考察氮源、氮濃度及磷濃度對Desmodesmus sp.WC08生長和油脂積累的影響，為Desmodesmus sp.WC08的高密度培養及其油脂開發提供研究基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鏈帶藻（Desmodesmus sp.WC08） 海南大學生物工程綜合實驗室提供；粗海鹽購自海南鶯歌海鹽場；硝酸鈉、亞硝酸鈉、尿素、氯化銨、磷酸氫二鉀、氯仿及甲醇等均為國產分析純。

TU-1810紫外可見分光光度計北京普析通用；CR-22G II離心機日立；LDJ-25C冷凍干燥系統北京四環科學儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 日本SANYO；柱狀玻璃管高60 cm，直徑5 cm。

1.2培養基及培養條件

培養基為BG11，每升水中含有1.5 g NaNO3，0.04 g K2HPO4，0.075 g MgSO4·7H2O，0.036 g CaCl2·H2O，0.006 g檸檬酸，0.006 g檸檬酸鐵銨，0.02 g NaCO3，0.001 g EDTA·Na2，2.860 g H3BO3，0.220 g ZnSO4·7H2O，1.810 g MnCl2·4H2O，0.079 g CuSO4·5H2O，0.049 g Co（NO3）2·6H2O，0.390 g Na2MoO4·2H2O。

柱狀培養管中裝0.5 L培養液，接種比例1∶10（V/V），連續光照，光照強度為8000～10000 lx，室溫下培養，并通入無菌空氣，通氣比為0.25，培養周期為18 d。

1.3實驗設計

1.3.1氮源對Desmodesmus sp.WC08生長及油脂含量的影響培養基（除氮源外）按BG11培養基配制，海鹽濃度為15 g/L，分別用BG11配方中相同氮摩爾濃度（18 mmol/L）的硝酸鈉，亞硝酸鈉，尿素和氯化銨作為唯一氮源，每組實驗設計三組平行。

1.3.2氮濃度對Desmodesmus sp.WC08生長及油脂含量的影響分別以氮摩爾濃度為5、10、15、20、30 mmoL/L的尿素為氮源，其他成分按BG11培養基配制，海鹽濃度為15 g/L，每組實驗設計三組平行。

1.3.3磷濃度對Desmodesmus sp.WC08生長及油脂含量是影響分別以磷摩爾濃度為0.1、0.3、0.5、0.8、1.2 mmoL/L的磷酸氫二鉀為磷源，其他成分按BG11培養基配制，海鹽濃度為15g/L，每組實驗設計三組平行。1.4分析方法

1.4.1生長檢測培養周期為18 d，培養過程中每48 h取樣一次，在680 nm下測定藻液的吸光值。

1.4.2生物量濃度測定將培養18 d后的藻液于8000 r/min離心6 min，將所得藻泥用去離子水清洗3遍，采用真空冷凍干燥法進行干燥。生物量濃度計算公式為：

生物量濃度（g/L）=凍干藻粉（g）/培養液體積（L）1.4.3油脂含量測定參照文獻［12］氯仿-甲醇法對總脂進行提取和測定。稱取一定量的凍干藻粉，放入帶塞玻璃管中，加入2 mL的氯仿-甲醇溶液（氯仿∶甲醇為2∶1，v/v），常溫下磁力攪拌30 min，4000 r/min離心5 min，收集上清液，余下藻渣重復上述步驟重復提取一次，合并所有有機相，加入0.2倍體積的0.9% NaCl，離心分層收集下層氯仿層至干凈玻璃瓶中，氮吹儀吹干至恒重。計算公式如下：

油脂含量（%）=油脂質量（g）/藻粉質量（g）×100油脂產量（g/L）=生物量（g/L）×油脂含量（%）

1.4.4氮、磷含量測定總氮按照堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定，總磷按照鉬酸銨分光光度法測定。

1.4.5數據處理與分析分別采用SPSS 20.0和Oringin 8.0軟件對數據進行分析和圖形繪制。

2　結果與討論

2.1氮源對Desmodesmus sp.WC08生長及油脂含量的影響

圖1　Desmodesmus sp.WC08在不同氮源中的生長曲線Fig.1　Growth curve of microalgae Desmodesmus sp.WC08 with different nitrogen sources

微藻對不同形式氮源的吸收利用存在一定的差異，對氮的利用先后順序一般為銨態氮、其次為硝態氮和亞硝態氮［13］。由圖1可以看出，Desmodesmus sp. WC08在以硝酸鈉、亞硝酸鈉、尿素和氯化銨為氮源時，具有明顯的生長差異。以尿素為氮源時，生長最快，其次為亞硝酸鈉和硝酸鈉，二者差異較小。以氯化銨為氮源時，培養7 d后，不再生長且開始死亡，第8 d時基本全部死亡，其可能由于NH4+的消耗致使培養液pH快速下降導致，培養結束時，培養液pH為3.24，此結果和以往的研究結果一致［14］。培養18 d后生物量見表1，尿素組的生物量最高，其次依次為亞硝酸鈉和硝酸鈉組，氯化銨組由于藻體死亡，未能測定生物量。ANOVA分析表明，尿素、硝酸鈉及亞硝酸鈉對Desmodesmus sp.WC08的生物量積累無顯著影響（p＞0.05）。但以尿素為氮源時，生長最好，生物量最高，可能與尿素不僅能為氮源而且能充當碳源有關。可見，四種不同形式的氮源中，以有機銨態氮的尿素最適宜微藻Desmodesmus sp.WC08生長和生物量積累。

表1　Desmodesmus sp.WC08在不同氮源中的生物量濃度Table 1　Biomass concentration of microalgae Desmodesmus sp. WC08 with different nitrogen sources

不同氮源下Desmodesmus sp.WC08的油脂含量和油脂產量見圖2，不同氮源下Desmodesmus sp.WC08的油脂含量無顯著差異（p＞0.05），但是對其油脂產量具有顯著影響（p＜0.05），其中尿素組的油脂產量最高，其次為亞硝酸鈉和硝酸鈉，但后兩者之間無顯著差異（p＞0.05）。以尿素為氮源時生物量和油脂產量均最大，因此在氮濃度實驗中選擇尿素為氮源。

圖2　氮源對Desmodesmus sp.WC08油脂積累的影響Fig.2　Effects of nitrogen sources on the lipid accumulation ofmicroalgae Desmodesmus sp.WC08

2.2氮濃度對Desmodesmus sp.WC08生長及油脂含量的影響

不同濃度的氮源對微藻生長和油脂積累具有非常重要的影響，通常在低氮或缺氮條件下，微藻細胞較易大量積累油脂，但是生長較差，生物量較低［15-16］。如圖3所示，Desmodesmus sp.WC08在不同濃度氮中的生長具有顯著差異，特別是在生長后期，低濃度氮比高濃度氮更利于Desmodesmus sp.WC08的生長。不同氮濃度對微藻Desmodesmus sp.WC08的生物量積累（表2）具有顯著影響，隨氮濃度升高，生物量逐漸升高，至10 mmoL/L時，生物量最高，隨后生物量逐漸降低，至氮濃度為30 mmoL/L時，生物量最低。說明較高的氮濃度對微藻的生長和生物量積累具有一定的抑制作用。氮濃度為10 mmoL/L時，最有利于Desmodesmus sp.WC08的生長和生物量的積累。

圖3　Desmodesmus sp.WC08在不同氮濃度中的生長曲線Fig.3　Growth curve of microalgae Desmodesmus sp.WC08 with different nitrogen concentrations

除了生長和生物量外，氮濃度對微藻細胞內油脂的積累亦具有重要的調控作用。如圖4所示，氮濃度對Desmodesmus sp.WC08的油脂含量和油脂產量具有極顯著影響，隨著氮濃度升高，油脂含量和油脂產量逐漸降低，氮濃度為5 mmoL/L時的油脂含量最高，是油脂含量最低的30 mmoL/L組的1.4倍。氮濃度為10 mmoL/L時，油脂產量最高，5 mmoL/L組次之，二者無顯著差異，是30 mmoL/L組油脂產量的2.2倍。

圖4　氮濃度對Desmodesmus sp.WC08油脂積累的影響Fig.4　Effects of urea concentration on the lipid accumulation of microalgae Desmodesmus sp.WC08

2.3磷濃度對Desmodesmus sp.WC08生長及油脂含量的影響

磷是除氮元素外，對微藻生長和生化組成最具影響和調控作用的元素之一。Desmodesmus sp.WC08在不同磷濃度下的生長曲線如圖5所示，不同磷濃度對其生長具有一定差異，磷濃度為0.3 mmoL/L 和0.5 mmoL/L時，生長最好，低于或高于此濃度范圍后，Desmodesmus sp.WC08的生長較差。最終生物量見表3，磷濃度對Desmodesmus sp.WC08的生物量具有顯著影響，隨著磷濃度的升高，生物量先升高后降低，至濃度為0.5 mmoL/L時，生物量最高，0.3 mmoL/L次之，二者沒有顯著差異（p＞0.05）。磷濃度為1.2 mmoL/L時，生物量最低，僅為0.5 mmoL/L時的一半，說明高濃度磷不利于Desmodesmus sp.WC08的生長。因此，Desmodesmus sp.WC08最適生長和生物量積累的磷濃度為0.5 mmoL/L。

圖5　Desmodesmus sp.WC08在不同磷濃度中的生長曲線Fig.5　Growth curve of microalgae Desmodesmus sp.WC08 with different phosphorus concentrations

Desmodesmus sp.WC08在不同磷濃度下的油脂含量和油脂產量如圖6所示，磷濃度對其油脂含量和油脂產量具有極顯著影響，其中在低磷濃度（0.1 mmoL/L）下，Desmodesmus sp.WC08的油脂含量最高，較易積累油脂。在高磷濃度（1.2 mmoL/L）下的油脂含量較低，磷濃度為0.3～0.8 mmoL/L時，油脂含量無顯著差異。同時，隨磷濃度升高，油脂產量先升高再逐漸降低，磷濃度為0.5 mmoL/L時，油脂產量最高，其次為0.3和0.1 mmoL/L，三者無顯著差異，磷濃度為1.2 mmoL/L時，油脂產量最低，約為0.5 mmoL/L組油脂產量的一半。

圖6　磷濃度對Desmodesmus sp.WC08油脂積累的影響Fig.6　Effects of phosphorus concentrations on the lipid accumulation of microalagae Desmodesmus sp.WC08

2.4Desmodesmus sp.WC08對培養基中的氮、磷的吸收利用

從圖7可以看出，5 mmol/L組和10 mmol/L組的氮源分別在第8 d和第12 d被消耗完，15、20和30 mmol/L組對氮源的利用率較低，在18 d時的利用率分別是68.82%、58.84%和39.65%。隨著氮濃度的增加氮的利用率逐漸降低，可能是Desmodesmus sp.WC08對氮的吸收存在飽和狀態，過高的氮濃度反而會抑制Desmodesmus sp.WC08的生長和油脂積累［2］。圖8所示，磷濃度為0.1、0.3和0.5 mmol/L組磷源分別在4、6和10 d被完全吸收，0.8和1.2 mmol/L組磷源在18 d基本吸收完全。對比氮、磷消耗曲線可以發現，磷濃度為0.1和0.3 mmol/L組的磷源分別在4和6 d被完全吸收，而對氮的吸收還在繼續，說明Desmodesmus sp. WC08在一定磷濃度下，對氮的吸收影響較小。對比不同氮濃度的生長曲線和氮消耗曲線可知，當氮濃度為10 mmol/L時生物量和油脂產量均最大，且此時氮消耗完全，而氮濃度在15 mmol/L是生物量和油脂產量均降低，因此氮濃度在10～15 mmol/L范圍內繼續增加可能會促進Desmodesmus sp.WC08的生長和油脂的積累。當氮濃度為10 mmol/L時，在12 d時培養基中氮消耗完全，但對比生長曲線發現藻細胞仍在增長，說明在缺氮條件時，藻細胞能夠利用自身所儲備的氮源，這與張森等［17］的研究結果一致。

圖7　不同氮濃度下氮的消耗曲線Fig.7　Consumption curves of nitrogen under different nitrogen concentrations

圖8　不同磷濃度下磷的消耗曲線Fig.8　Consumption curves of phosphorus under different phosphorus concentrations

表3　Desmodesmus sp.WC08在不同磷濃度中的生物量Table 3　Biomass concentration of microalgae Desmodesmus sp.WC08 with different phosphorus concentrations

3　結論

本實驗以BG11培養基為基礎，考察了不同氮源、氮濃度及磷濃度對一株熱帶海洋富油微藻Desmodesmus sp.WC08生長和油脂積累的影響。實驗結果表明，Desmodesmus sp.WC08在以氯化銨為氮源時無法正常生長，其他三種氮源（硝酸鈉、亞硝酸鈉和尿素）對Desmodesmus sp.WC08生長和油脂含量影響較小，但對油脂產量有顯著影響。以有機氮源尿素為氮源時生物量和油脂產量最高。以尿素為氮源時，Desmodesmus sp.WC08生物量隨氮濃度升高而升高，油脂含量逐漸降低。當氮濃度為10 mmol/L時，油脂產量最高。低氮濃度有助于Desmodesmus sp. WC08細胞內油脂積累，而高氮濃度既不利于生長也不利于油脂積累。隨磷濃度的升高，Desmodesmus sp. WC08的生長和油脂積累先增加后減少，當磷濃度為5 mmol/L時生物量和油脂積累均達到最大。綜上，四種氮源中，最適合Desmodesmus sp.WC08生長和油脂積累的氮源為尿素且最適濃度為10 mmol/L，最適磷濃度為0.5 mmol/L。

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Effects of nitrogen and phosphorus on cell growth and lipid accumulation of tropic ocean microalgae strain Desmodesmus sp.WC08

LUO Ning，ZHANG Sen，LIU Ping-huai*
（Key Study Center of the National Ministry of Education for Tropical Resources Utilization/Hainan Provincial Key Lab of Fine Chem，Hainan University，Haikou 570228，China）

In order to study the effects of nitrogen sources and the concentrations of nitrogen and phosphorus on the growth，lipid accumulation of a marine algae Desmodesmus sp.WC08.Four nitrogen sources such as sodium nitrite，sodium nitrate，urea and ammonium chloride and different concentrations of urea and phosphorus were investigated based on the BG11 media.The results showed that different nitrogen sources made little difference to Desmodesmus sp.WC08 except for ammonium chloride.In addition，the growth and lipid accumulation proved to be best when using urea as nitrogen source.Accordingly，the best growth and lipid accumulation which would be easily affected if the concentration of nitrogen was higher or lower，could be obtained at the optimal concentration of nitrogen（10 mmol/L）.Likewise，the growth and lipid accumulation could be obtained at the optimal concentration of phosphorus（0.5 mmol/L）.To be concluded，the nitrogen and phosphorus could be thoroughly absorbed by WC08 and the nutrients in the BG11 media could also be fully used at the their optimal concentrations.

Desmodesmus sp.WC08；nitrogen sources；nitrogen concentrations；phosphorus concentrations；nutrient uptake

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0223-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.036

2015－07－21

羅寧（1991-），男，碩士研究生，主要從事微藻培養及其生物活性物質方面的研究，E-mail：luoning0615@sina.cn。

劉平懷（1967-），男，碩士，教授，主要從事微藻生物質資源方面的研究，E-mail：twlph@163.com。

國家科技支撐計劃項目課題（2011BAD14B01）；海南省中藥現代化科技專項（ZY201327）；國家科技型中小企業技術創新基金（13C26244604892）；海南省產學一體化項目（CXY20150034）。