漆樹籽粕多糖的提取工藝優化及抗氧化活性研究

陳虹霞，王成章，2，*，葉建中，周　昊，2，陶　冉，李文君（.中國林業科學研究院林產化學工業研究所，生物質化學利用國家工程實驗室，國家林業局林產化學工程重點開放性實驗室，江蘇省生物質能源與材料重點實驗室，江蘇南京20042；2.中國林業科學研究院林業新技術研究所，北京0009）

漆樹籽粕多糖的提取工藝優化及抗氧化活性研究

陳虹霞1，王成章1，2，*，葉建中1，周昊1，2，陶冉1，李文君1
（1.中國林業科學研究院林產化學工業研究所，生物質化學利用國家工程實驗室，國家林業局林產化學工程重點開放性實驗室，江蘇省生物質能源與材料重點實驗室，江蘇南京210042；2.中國林業科學研究院林業新技術研究所，北京100091）

以脫脂后的漆樹籽粕為原料，采用熱回流提取漆樹籽粕多糖，通過單因素實驗和正交實驗優化該方法的最佳工藝條件，并進一步研究漆樹籽粕多糖對羥自由基和ABTS+自由基的清除能力。結果表明：最佳工藝條件為提取時間2.5 h，料液比1∶20（g∶mL），提取溫度80℃和提取次數2次，此時籽粕多糖的得率為1.561%。漆樹籽粕多糖對清除羥自由基和ABTS+自由基的IC50分別為8.515 mg·mL-1和7.03 mg·mL-1，當漆樹籽粕多糖的濃度為25 mg·mL-1時，對羥自由基的清除率達到61.5%，當濃度為10 mg·mL-1時，對ABTS+自由基的清除率達到58.4%。體外抗氧化實驗表明漆樹籽粕多糖抗氧化活性作用明顯。

漆籽，籽粕，多糖，提取，抗氧化活性

漆樹（Rhus succedanea L）是漆樹科漆樹屬的一種落葉喬木，是我國重要的經濟林樹種，廣泛分布于四川盆地。漆籽為漆樹的果實，我國每年產漆籽量約為200多萬噸，漆籽的外果皮中富含漆蠟，因其具較好的黏彈性能，廣泛應用于高級化妝品、潤滑劑和綠色表面活性劑等領域［1］。漆蠟是漆籽中的主要經濟產品，其加工方式主要為壓榨法和溶劑法，漆樹籽粕是漆蠟生產完后的主要附產物，其每年的產量約為100萬噸，但目前對其加工利用較弱，大部分都作為燃料焚燒。因此從漆樹籽粕中發現具有高活性的天然化合物引起了廣泛關注。

多糖是一類具有復雜結構的高分子化合物，廣泛存在于植物、動物和微生物中［2］。越來越多的研究發現，多糖對于人類具有很高的價值，特別是植物多糖因其充足資源和低毒高效的藥理活性廣泛應用于食品和藥物領域［3-4］。研究發現目前從植物中分離得到數百種植物多糖，大量的藥理實驗表明，多糖具有調節免疫、抑菌、抗病毒、抗氧化等［5-7］作用。

目前國內外對漆籽的研究主要集中在漆蠟和漆籽油的提取、脫色以及漆脂改性等方面［8-10］。為了提高漆籽資源的綜合效益，增加漆樹籽粕的經濟價值，本文利用熱回流浸提方法對漆樹籽粕中的多糖進行提取并采用單因素和正交實驗對其工藝進行優化。在此基礎上，進一步研究漆樹籽粕多糖的體外抗氧化活性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

漆樹籽2014年10采集于湖南桃源，自然晾干、粉碎成粉末，備用；石油醚、乙醇、丙酮、乙醚、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、ABTS、過硫酸鉀、甲醇、抗壞血酸、BHT購自國藥集團化學試劑有限公司；蒸餾水自制。

MULTISKAN GO酶標儀Thermo fisher scientific. oy；離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋上海江星儀器有限公司；FD-1冷凍干燥儀北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1葡萄糖標準曲線的繪制精確稱取葡萄糖標準品10 mg，加入蒸餾水溶解并定容到50 mL，得到1 mg/mL的標準品標準溶液。分別移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.9 mL的1 mg/mL標準溶液至10 mL的試管中，補加蒸餾水至終體積為1.0 mL，分別加入1.0 mL 5%的苯酚，搖勻后，加入3.5 mL的濃硫酸，迅速振蕩搖勻，室溫下靜置25 min，在490 nm處測吸光度。繪制吸光度與濃度的標準曲線，并擬合線性回歸方程。回歸方程Y=0.0081X-0.0139，相關系數R=0.9996。葡萄糖在20～180 μg區間具有良好的線性關系。

1.2.2熱回流浸提漆樹籽粕多糖漆籽粉末，加入料液比1∶10（g∶mL）的石油醚在70℃下，提取4次，每次3 h，過濾，濾液合并，真空濃縮為漆蠟。濾渣干燥，即為漆樹籽粕。取漆樹籽粕10 g，放入500 mL燒瓶中，按一定的料液比加入一定的蒸餾水，在一定的溫度下，提取一定時間后過濾，得到濾液。在旋轉蒸發儀上60℃真空濃縮至50 mL，加入無水乙醇，與多糖水溶液的體積比約為25∶1，在4℃下靜置24 h，離心（8000 r/min）得到沉淀，再用乙醚、丙酮（體積比約為10∶1）洗多糖沉淀兩次，最后將沉淀冷凍干燥得到各多糖提取物。按照1.2.1的方法在490 nm下測定吸光度。漆樹籽粕多糖的得率（%）=（多糖的質量/原料的質量）×100。

1.2.3單因素實驗設計根據單因素實驗設計，選擇提取溫度90℃，料液比1∶10（g∶mL），提取2次，提取時間2 h為固定條件，考察提取時間（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h），提取溫度（50、60、70、80、90、100℃），料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL）和提取次數（1、2、3和4次）對熱回流提取漆樹籽粕粗多糖得率的影響。

1.2.4正交實驗設計通過在單因素實驗的基礎上，選擇提取溫度90℃，料液比1∶20（g∶mL），提取次數2次，提取時間2 h為固定條件，利用正交實驗設計對提取漆樹籽粕多糖的三個主要因素提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）進行優化，選用L9（33）正交表，進行三因素三水平9組實驗，各因素水平表如表1所示。

表1　正交實驗設計因素-水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal experiment methodology

1.2.5漆樹籽粕多糖對羥自由基清除能力的測定將漆樹籽粕多糖提取物用蒸餾水配制成0.1～50 mg/mL的濃度梯度，以VC和BHT作為對照組進行實驗。取1 mL樣品溶液，加入1 mL濃度為9 mmol/L的FeSO4溶液，混合均勻后加入1 mL濃度為8.8 mmol/L的過氧化氫和1 mL濃度為9 mmol/L的水楊酸乙醇溶液，于37℃水浴中反應1 h，于510 nm處測其吸光度，空白對照對蒸餾水代替樣品溶液［11］。對羥基自由基清除能力的測定按以下公式進行計算：

式中：A0為空白對照的吸光度；A1為樣品的吸光度；A2為50%乙醇溶液代替水楊酸乙醇溶液的吸光度。

1.2.6對ABTS+自由基清除能力的測定儲備液的制作：將7.4 mmol/L的ABTS溶液與2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液等量混合，在黑暗處常溫靜置反應15 h，然后取1 mL溶液用甲醇稀釋，得到溶液在732 nm處的吸光度為0.74［12］。

將不同濃度的漆樹籽粕多糖提取物、VC和BHT 150 μL加入2.85 mL的上述儲備液，混合均勻，在黑暗處常溫靜置反應2 h，在732 nm處測吸光度，計為A1。以蒸餾水作為空白對照，在黑暗處常溫靜置反應2 h，在732 nm處測吸光度，計為A2。

式中：A1為待測樣品、ABTS在樣品溶劑存在體系存在下的吸光度，A2為ABTS在樣品溶劑存在下的吸光度。1.2.7數據分析采用Origin 7.5軟件進行繪圖及計算，采用SPSS 19.0方差分析進行顯著性檢驗。

2　結果與討論

2.1單因素實驗

2.1.1提取時間對多糖提取得率的影響從圖1中可以看出，當時間在0.5～2.5 h之間，多糖的得率增長較快，多糖的得率從0.693%增加至1.409%，提取時間在2.5 h后，多糖的得率增長緩慢。提取時間對漆樹籽粕多糖的得率影響較大，說明提取時間的長短直接影響水與植物細胞中多糖化合物的接觸程度，提取時間長，多糖化合物萃取得比較完全。

圖1　提取時間對熱回流提取漆樹籽粕多糖得率的影響Fig.1　Effect of extracting time on the yield of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L

2.1.2提取溫度對多糖提取得率的影響如圖2所示，隨著提取溫度的上升，漆樹籽粕粗多糖的得率先增大而后緩慢減少，溫度從50～80℃，多糖的得率從0.662%增至1.355%，說明溫度的增大有利于多糖化合物的溶出。但是溫度增至90～100℃時，多糖得率略微有些下降，說明在高溫條件下，較多色素類及其他化合物溶出，雜質量多，且高溫會使多糖類化合物發生降解。

圖2　提取溫度對熱回流提取漆樹籽粕多糖得率的影響Fig.2　Effect of extracting temperature on the yield of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L

2.1.3料液比對多糖提取得率的影響如圖3所示，料液比從1∶5（g∶mL）上升至1∶25（g∶mL），漆樹籽粕多糖得率從0.605%上升至1.465%，料液比的增大對多糖的溶出具有較大影響，特別是料液比從1∶5（g∶mL）增加到1∶10（g∶mL），多糖提取得率增加速度較快，而后增加緩慢。說明當水量較大時，能夠與籽粕組織細胞中的多糖進行充分接觸，從而大大增加了傳質效率。

2.1.4提取次數對多糖提取得率的影響如圖4所示，提取1次時多糖的得率為1.073%，提取2次時多糖的得率為1.314%，而后增加次數，多糖的增長緩慢。縮合考慮多糖得率以及能耗，選擇熱回流提取漆樹籽粕多糖的提取次數2次為宜。

2.2正交實驗優化

圖3　料液比對熱回流提取漆樹籽粕多糖得率的影響Fig.3　Effect of extracting ratio of material to water on the yield of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L

圖4　提取次數對熱回流提取漆樹籽粕多糖得率的影響Fig.4　Effect of extraction times to water on the yield of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L

表2　正交實驗結果Table 2　Results of the orthogonal test

提取時間、料液比和提取溫度是影響漆樹籽粕多糖得率的主要因素，以漆樹籽粕多糖得率為考察指標，按照L9（34）進行正交實驗設計，每組實驗重復3次，取平均值，實驗結果見表2，方差分析見表3。

根據直觀分析，從R值可以看出，各因素對漆樹籽粕多糖得率的影響大小為提取溫度＞料液比＞提取時間。從表2可以看出，熱回流提取漆樹籽粕多糖的最佳工藝條件為A2B2C2或A2B3C2，即提取時間2.5 h，料液比1∶20（g∶mL）或1∶25（g∶mL），提取溫度80℃。方差分析顯示，各因素存在顯著性影響。考慮到實際應用，料液比越高，能耗越高，所以最終的最佳工藝條件選擇提取時間2.5 h，料液比1∶20（g∶mL），提取溫度80℃和提取次數2次。

表3　正交實驗方差分析表Table 3　ANOVA table of orthogonal test

以正交實驗設計得到的最佳工藝條件，即提取時間2.5 h，料液比1∶20（g∶mL），提取溫度80℃和提取次數2次，進行3次熱回流提取多糖的平行實驗，取平均值，漆樹籽粕多糖得率為1.561%。

2.3漆樹籽粕多糖的抗氧化作用

2.3.1漆樹籽粕多糖對羥基自由基的清除能力化合物的抗氧化活動歸因于各種反應和機制，如自由基清除、還原能力，防止連鎖啟動和螯和催化反應過程中的金屬離子等。羥自由基被認為是氧化應激損傷主要原因，其很容易穿過細胞膜，與大多數生物大分子反應，如碳水化合物、蛋白質和DNA［13］。不同濃度的VC、BHT和漆樹籽粕多糖提取物對羥基自由基的清除能力如圖5所示。漆樹籽粕多糖提取物對羥基自由基具有較強的清除能力，濃度從0.1 mg·mL-1增加至25 mg·mL-1時，對羥基自由基的清除率顯著增大（p＜0.01），當濃度為25 mg·mL-1時，清除率為61.5%。其作用效果低于VC和BHT，其IC50為8.515 mg·mL-1。說明漆樹籽粕多糖中的含有羥基官能團能提供氫質子，從而能夠有效阻止自由基反應，將自由基轉化為無毒的物質［14］。

2.3.2漆樹籽粕多糖對ABTS+自由基的清除能力ABTS+自由基是抗氧化活性測定應用中最廣泛的人工合成自由基之一。在有供氫能力的活性物存在時，ABTS+自由基與之反應，由藍綠色變成沒有顏色的ABTS［15］。利用該方法研究漆樹籽粕多糖提取物的抗氧化能力。由圖6可知，對ABTS+自由基的清除率與漆樹籽粕多糖的濃度呈正相關，當濃度從0.1 mg·mL-1增加至10 mg·mL-1時，清除率隨著濃度的增大顯著增強（p＜0.01）。當濃度在10 mg·mL-1時，清除率為58.4%，清除效果低于VC和BHT，其IC50值為7.03 mg·mL-1。以上數據可以說明漆樹籽粕多糖具有較強的抗氧化活性。

圖6　漆樹籽粕多糖對ABTS自由基的清除能力Fig.6　ABTS radical acavenging activity of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L

3　結論

采用熱回流提取漆樹籽粕多糖，通過單因素和正交實驗進行提取工藝優化，得到最佳工藝條件為：提取時間2.5 h，料液比1∶20（g∶mL），提取溫度80℃和提取次數2次，在此條件下籽粕多糖的得率為1.561%。研究漆樹籽粕多糖對羥自由基和ABTS+自由基的清除能力，并與VC和BHT進行對比，結果表明漆樹籽粕多糖具有一定的抗氧化活性，其清除能力低于VC和BHT。當濃度為25 mg·mL-1時，對羥自由基的清除率為61.5%，IC50為8.515 mg·mL-1。當濃度為10 mg·mL-1時，對ABTS+自由基的清除率為58.4%，IC50值為7.03 mg·mL-1。

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Extraction optimization of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L and its antioxidant activity

CHEN Hong-xia1，WANG Cheng-zhang1，2，*，YE Jian-zhong1，ZHOU Hao1，2，TAO Ran1，LI Wen-jun1
（1.Institute of Chemical Industry of Forestry Products，CAF Key and Open Lab on Forest Chemical Engineering，SFA，Nanjing 210042，China；2.Institute New Technology of Forest，CAF，Beijing 100091，China）

Single factor and orthogonal methodology were used to optimize the extraction conditions of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L，then the antioxidant（scavenging hydroxyl and ABTS radicals）of the crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L were possessed.The optimum extraction conditions were as follows：extraction time 2.5 h，ratio of material to water 1∶20（g∶mL），extraction temperature 80℃，and extraction times 2.Under the optimized conditions，an experimental yield was 1.561%.The IC50values scavenging hydroxyl and ABTS+radicals of the crude polysaccharides were 8.515 mg·mL-1and 7.03 mg·mL-1，respectively.The hydroxyl radical scavenging ability of polysaccharides reached 61.5%at 25 mg·mL-1.The ABTS+radicals scavenging ability of polysaccharides reached 58.4%at 10 mg·mL-1.The seed cakes polysaccharides displayed significant antioxidant.

Rhus succedanea L；seed cakes；polysaccharides；extraction；antioxidant activity

TS255.1

B

1002-0306（2016）04-0254-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.043

2015－08－24

陳虹霞（1983-），女，博士研究生，助理研究員，主要從事天然產物化學方面的研究，E-mail：shirenyahui@126.com。

王成章（1966-），男，博士，研究員，主要從事天然產物研究與利用方面的研究，E-mail：wangczlhs@sina.com。

國家林業局948技術引進項目（2015-4-46）；中國林科院林業新技術所基本科研業務費專項資金（CAFINT2013C03）；國家國際科技合作專項（2014DFR31300）。